6 抽樣 

按每一發(fā)酵罐菌液制成的產(chǎn)品為一批，按批抽樣檢驗。抽樣過程要嚴格避免雜菌污染。6.1 抽樣工具及用品 

抽樣前預(yù)先準備好無菌塑料袋(或塑料瓶)、金屬勺、剪刀、封口機(或封口膠帶)、牛皮紙封樣袋、標簽、抽樣封條和膠水。 

6.2 抽樣數(shù)量及抽樣方法 

在成品庫抽樣，按“”形分層設(shè)點抽樣，抽樣以件為單位，小包裝產(chǎn)品以一包裝箱為一件。大包裝（30-50kg）產(chǎn)品以一袋（或一桶）為一件。抽樣基數(shù)由樣品基數(shù)的大小確定。1-10件，全部抽樣。11-200件，抽樣10件；201-400件，抽取20件。樣品基數(shù)大于400件，按照超過部分的2%增加抽樣件數(shù)。總件數(shù)不超過40件。

每件小包裝產(chǎn)品抽取一小袋，在無菌條件下每袋取樣200g。將所有樣品混勻，按四分法縮到2000g，分裝4袋，然后封口。每2袋為一份裝入牛皮紙封樣袋。最后貼上抽樣標簽和抽樣封條（液體根瘤菌肥小包裝產(chǎn)品抽樣參照此法進行）。所抽樣品一份留存被抽樣單位，一份交檢測中心檢測。

7  檢驗方法 

7.1 儀器設(shè)備及試劑 

7.1.1 儀器設(shè)備 

生物顯微鏡（10×100）； 

菌落計數(shù)器； 

恒溫培養(yǎng)箱； 

恒溫干燥箱； 

恒溫搖床； 

滅菌鍋； 

無菌室或超凈工作臺； 

酸度計； 

溫室或植物光照培養(yǎng)箱：植物葉面光照強度大于8000lx，溫度控制范圍20-30℃； 

試管：ф15mm×150mm，ф18mm×180mm； 

培養(yǎng)皿：直徑9cm； 

三角瓶：500mL； 

無菌吸管：1、2、5、10mL； 

玻璃刮刀； 

濾紙； 

酒精燈； 

標準篩：孔徑0.18mm和0.15mm； 

1號羊毛畫筆； 

無菌水； 

無離子水。

7.1.2 試劑 

7.1.2.1 革蘭氏染色試劑 

結(jié)晶紫； 

番紅； 

碘液；95%酒精。 

7.1.2.2 根瘤菌瓊脂培養(yǎng)基 

甘露醇（C6H14O6）5g 

蔗糖（C12H22O11） 5g 

酵母粉   0.5g 

磷酸氫二鉀（K2HPO4）  0.5g 

硫酸鎂（MgSO4•7H2O）  0.2g 

氯化納(NaCl) 0.lg 

硫酸鈣(CaS04)0.lg 

鉬酸鈉(Na2Mn04•2H20) 溶液  lmL 

硫酸錳(MnS04. •4H20) 溶液  1ml 

檸檬酸鐵(FeC6H502) l%溶液  1mL 

硼酸(H3B05)  l%溶液1mL 

剛果紅(C32H22N606S2Na2) 1%溶液   2.5mL 

瓊脂 18~20g 

水  l000mL 

pH值  7.0 

7.1.2.3 馬丁培養(yǎng)基(測霉菌數(shù)) 

磷酸二氫鉀(KH2P04• 7H20)0.5g 

葡萄糖(C6H1206•H20) l0.0g 

硫酸鎂(MgS04•7H20)  0.5g 

蛋白胨 5.0g 

1%孟加拉紅酒精(無水)溶液  3.3mL 

瓊脂 18~20g 

蒸餾水l000mL 

氯霉素 0.lg 

7.1.2.4 豆科植物結(jié)瘤試驗瓊脂斜面培養(yǎng)基 

磷酸二氫鉀(KH2P04• 7H20)0.22mg 

氯化鉀(KCl)155mg 

硫酸鎂(MgS04•7H20)   50mg 

硫酸鋅(ZnS04•7H20) 0.25mg 

硫酸銅(CuS04•5H20) 0.25mg 

硼酸(H3B05)0.25mg 

鉬酸鈉(Na2Mn04•2H20)0.05mg 

檸檬酸鐵(FeC6H502)30mg 

硝酸鈉(NaN03) 30mg 

瓊脂  5~10g 

水   l000mL 

pH7.0 

7.2  成品檢驗 

7.2.1 氣味檢驗 

取根瘤菌肥料樣品打開包裝，進行感官檢驗。

7.2.2 外觀檢驗 

將固體根瘤菌肥料包裝打開，裝在白色搪瓷盤中，將液體根瘤菌肥料搖勻。在明亮光線下進行感官檢驗。 

7.2.3 pH值測定 

液體根瘤菌肥料的pH值測定：取供檢菌液直接測定pH值，取三次測定結(jié)果的平均數(shù)。 

固體根瘤菌肥料的pH值測定：取50mL燒杯一個，加入菌肥25g，無離子水25mL。通過磁力攪拌使溶液均勻后用酸度計測定pH值。取三次測定結(jié)果的平均數(shù)。

7.2.4 含水量測定 

稱取固體根瘤菌肥料三份，每份20.00g，精確到0.01g，放入已稱恒重的鋁盒中。置105℃干燥箱內(nèi)烘烤4h，移至干燥器內(nèi)，冷卻后稱重。根據(jù)烘干前后質(zhì)量差按式(l)計算含水量。取三個樣品測定數(shù)的平均值。平行樣品絕對偏差應(yīng)低于1%。 

含水量(%)=（m0-m1）/m0×100  ………………(1) 

式中：m0一烘干前樣品質(zhì)量，g 

m1一烘干后樣品質(zhì)量，g。

7.2.5 吸附劑顆粒細度測定 

稱樣10g(精確至0.01g)，置于標準篩中(直徑分別為0.18mm和0.15mm)，用水沖洗，用毛筆輕刷，至粉末不再通過為止。將篩余物置105~110℃溫度下烘干，稱重。篩余物百分含量按式(2)計算： 

篩余物(%)=篩余物質(zhì)量/（1-樣品含水量百分數(shù)）/樣品質(zhì)量×100  ………(2) 

7.2.6 根瘤菌活菌數(shù)及雜菌率的測定 

采用平板計數(shù)法測定根瘤菌活菌數(shù)及雜菌率。

7.2.6.1 制作根瘤菌培養(yǎng)基平板(7.1.2.2)及馬丁培養(yǎng)基平板(7.1.2.3) 

7.2.6.2 樣品稀釋培養(yǎng) 

稱取l0g供檢樣品(精確到0.01g)，裝人帶玻璃珠及100mL無菌水的三角瓶中(供檢樣品為液體，則取l0mL加入內(nèi)裝90mL無菌水的三角瓶中)，置搖床振蕩20min，轉(zhuǎn)速200r/min。振蕩好的樣品靜置20min后采用10倍稀釋法稀釋至10-7(液體樣品稀釋至10-8)。從最后三個濃度懸液中各取0.1mL，加至直徑為9cm的培養(yǎng)基平板上，用玻璃刮刀將菌液涂勻。每個稀釋度重復(fù)三次。25~28℃溫度下培養(yǎng)3~7d。用同樣方法將10-3稀釋度菌懸液0.1mL加到馬丁培養(yǎng)基平板上。28℃培養(yǎng)48h。

7.2.6.3 菌落鑒別及計數(shù) 

根據(jù)被檢產(chǎn)品標準描述的菌落特征，鑒別根瘤菌菌落與雜菌菌落。必要時進行革蘭氏染色(方法見附錄A)、鏡檢，以區(qū)分根瘤菌菌落和其他菌落。取菌落30~300的平板計數(shù)。算出三個重復(fù)的根瘤菌及雜菌菌落平均數(shù)。雜菌是指樣品所含有效活菌(包括根瘤菌及促生細菌)以外的其他種類微生物的總稱。雜菌總數(shù)是馬丁培養(yǎng)基上出現(xiàn)的霉菌數(shù)與根瘤菌培養(yǎng)基上出現(xiàn)的雜菌數(shù)(霉菌除外)之和。

根瘤菌數(shù)按式(3)計算，雜菌率按式(4)計算 

根瘤菌數(shù)〔億個/g(mL)〕=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×基礎(chǔ)液體積/樣品量/加樣量  …(3) 

雜菌率(%)=雜菌總數(shù)/（根瘤菌數(shù)+雜菌總數(shù)）×100  ………(4) 

7.2.7 稀釋結(jié)瘤檢驗 

寄主植物種子用0.1%升汞溶液表面消毒后催芽，種芽長1~2mm時用供試樣品的10-5~10-7稀釋度的懸液接種，植于試管瓊脂斜面上。設(shè)不接種的陰性對照和接種已知菌的陽性對照。重復(fù)6次。植物培養(yǎng)溫度20~25℃，植物葉面光照強度大于8000lx，每天光照12h。10~20d后觀察結(jié)瘤狀況。如空白對照結(jié)瘤，試驗需要重做?？瞻讓φ詹唤Y(jié)瘤，正對照結(jié)瘤，可以進行判定。在10-6稀釋度中70%植株結(jié)瘤為稀釋結(jié)瘤合格。

7.2.8 有效期的檢驗 

在產(chǎn)品說明書標明的有效期到達前10d測定活菌數(shù)，或按產(chǎn)品說明書標明的使用量對寄主進行接種試驗(7.2.7)?；罹鷶?shù)達到標準要求或70%植株結(jié)瘤為有效期合格。