標(biāo)準(zhǔn)類別： NY-行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（農(nóng)業(yè)） 

關(guān)鍵詞： 固氮菌肥料 

標(biāo)準(zhǔn)號： NY 411—2000 

標(biāo)準(zhǔn)名稱： 固氮菌肥料* 

標(biāo)準(zhǔn)分類： 農(nóng)業(yè)土壤化肥標(biāo)準(zhǔn) 

頒布部門： 

頒布日期： 

實(shí)施日期： 

1 范圍 

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了固氮菌肥料產(chǎn)品的分類、技術(shù)要求、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、包裝、標(biāo)識、運(yùn)輸、貯存等。 

本標(biāo)準(zhǔn)適用于含有益的固氮菌、能在土壤和多種作物根際中固定空氣中的氮?dú)?，供作物氮素營養(yǎng)，又能分泌激素刺激作物生長的活體制品。本標(biāo)準(zhǔn)也適用于以固氮菌為主的含有能促進(jìn)固氮、生長的植物促生根際細(xì)菌（PGPR）的復(fù)合固氮菌肥料。 

2 引用標(biāo)準(zhǔn) 

下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文，通過在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。 

GB/T625—1989 化學(xué)試劑 硫酸 

GB/T629—1997 化學(xué)試劑 氫氧化鈉 

GB/T1250—1989 極限數(shù)值的表示方法和判定方法 

GB/T6543—1986 瓦楞紙箱 

GB/T6682—1992 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法 

3 定義 

本標(biāo)準(zhǔn)采用下列定義。 

3 1 自生固氮菌 

在土壤里能固定空氣中的氮，供作物氮素營養(yǎng)，又能分泌激素刺激作物生長的微生物。 

3 2 根際聯(lián)合固氮菌 

既依賴根際環(huán)境生長，又在根際中固定空氣中的氮?dú)猓瑢ψ魑锏纳L發(fā)育產(chǎn)生積極作用的微生物。 

3 3 固氮效能 

固氮菌每消耗 1g碳水化合物（糖）從空氣中攝取氮素的毫克數(shù)，固氮效能用 mg氮 /g糖表示。 

4 產(chǎn)品分類 

4 1 按劑型不同分為 液體固氮菌肥料、固體固氮菌肥料和凍干固氮菌肥料。 

4 2 按菌種及特性分為 自生固氮菌肥料、根際聯(lián)合固氮菌肥料、復(fù)合固氮菌肥料。

5 技術(shù)要求 

5 1 菌種 

在含一種有機(jī)碳源的無氮培養(yǎng)基中能固定分子氮，并具有一定的固氮效能。菌體一般為短桿狀（固氮螺菌屬菌體呈螺旋狀），革蘭氏染色陰性。 

5 1 1 自生固氮菌 

用固氮菌屬（ Azotobacter）、氮單胞菌屬（ Azomonas）的菌種，也可用莖瘤根瘤菌（ Azorhizo biumcaulinodans）和固氮芽胞桿菌（ Paenibacillusazotofixans）菌株。 

5 1 2 根際聯(lián)合固氮菌 

可用下列菌種 固氮螺旋菌（ Azospirillum）；陰溝腸桿菌（ Enterobactercloacae）經(jīng)鑒定為非致病菌的菌株；糞產(chǎn)堿菌（ Alcaligenesfaecalis）經(jīng)鑒定為非致病菌的菌株；肺炎克氏桿菌（ Klebsiellapneumoniae）經(jīng)鑒定為非致病菌的菌株。 

使用本準(zhǔn)則規(guī)定之外的菌種生產(chǎn)固氮菌肥料時，菌種必須經(jīng)過鑒定，并符合 5 1要求。 

生產(chǎn)固氮微生物肥料所使用的菌種，必要時還要進(jìn)行菌種染色鑒別（見附錄 B）和菌種固氮效能測定（見附錄 C）。 

5 2 成品技術(shù)指標(biāo)（見表 1） 

表 1 成品技術(shù)指標(biāo) 

指標(biāo) 劑型 

液 體 固 體 凍 干 

項(xiàng)目 

乳白或淡褐色液體， 黑褐色或褐色粉狀， 

外觀、氣味 混濁，稍 有 沉 淀，無 濕潤、松 散，無 異 臭 乳白色結(jié)晶，無味 

水分，% — 25 0! 35 0 3 0 

pH值 5 5! 7 0 6 0! 7 5 6 0! 7 5 

細(xì)度，過孔徑 0 18mm標(biāo)準(zhǔn)篩 5 20 0 

的篩余物，% # 

有效活菌數(shù)，個 /mL（個 /g、個 / 5 0 108 1 0 108 5 0 108 

瓶） $ 

雜菌率1），% $ 5 0 15 0 2 0 

有效期，2），月 # 3 6 12 

1）其中包括 10-6馬丁培養(yǎng)基平板上無霉菌。 

2）此項(xiàng)僅在監(jiān)督部門或仲裁檢驗(yàn)雙方認(rèn)為有必要時才檢測。

 6 抽樣 

按每一發(fā)酵罐菌液制成的產(chǎn)品為一批，逐批抽樣檢驗(yàn)。抽樣過程要嚴(yán)格避免雜菌污染。 

6 1 抽樣工具及用品 

抽樣前預(yù)先準(zhǔn)備好無菌塑料袋（或塑料瓶）、金屬勺、剪刀、封口機(jī)、牛皮紙封樣袋、標(biāo)簽、抽樣封條和膠水。 

6 2 抽樣數(shù)量及抽樣方法 

在成品庫抽樣，可按“ ”形分層設(shè)點(diǎn)抽取，抽樣以件為單位，小包裝產(chǎn)品以一包裝箱為一件。大包裝（30! 50kg）產(chǎn)品以一袋（或一桶）為一件。抽樣件數(shù)由樣品基數(shù)的大小確定。1! 10件，全部抽樣；11! 200件，抽樣 10件；201! 400件，抽取 20件；樣品基數(shù)大于 

400件者，按超過部分的 2%增加抽樣件數(shù)，但總件數(shù)不要超過 40件。 

每件包裝產(chǎn)品抽取一小袋，在無菌條件下每袋取樣 200g。然后將所有樣品混勻，按四分法縮到 2000g，分裝 4袋，然后封口。每 2袋為一份裝入牛皮紙封樣袋。 

液體產(chǎn)品每件吸取 10mL，一同放入無菌的三角瓶中，混勻后分成兩份，每份 250mL。凍干產(chǎn)品，每件取一支放入無菌的三角瓶中，加無菌液體培養(yǎng)液，溶解混勻后分成兩份，每 份 50mL。貼上標(biāo)簽和封條（一份被抽樣單位留存，一份交檢測中心檢測）。 

7 檢驗(yàn)方法 

7 1 儀器設(shè)備及試劑 

7 1 1 儀器設(shè)備 

生物顯微鏡（10 100）； 

菌落計(jì)數(shù)器； 

恒溫培養(yǎng)箱； 

恒溫干燥箱， 

恒溫?fù)u床； 

滅菌鍋； 

無菌室或超凈工作臺； 

酸度計(jì)； 

試管 %15mm 150mm，%18mm 180mm； 

培養(yǎng)皿 直徑 9cm； 

三角瓶 500mL； 

無菌吸管 0 5、1、5、10mL； 

玻璃刮刀； 

濾紙； 

酒精燈； 

標(biāo)準(zhǔn)篩 孔徑 0 18mm和 0 15mm； 

1號羊毛畫筆； 

無菌水； 

無離子水。 

7 1 2 試劑 

選擇培養(yǎng)基（見附錄 A）； 

剛果紅染液（0 5%）。 

7 2 成品檢驗(yàn) 

7 2 1 氣味檢驗(yàn) 

取固氮菌肥料樣品打開包裝，進(jìn)行感觀檢驗(yàn)。 

7 2 2 外觀檢驗(yàn) 

將固體固氮菌肥料包裝打開，裝在白色搪瓷盤中，將液體固氮菌肥料搖勻，在明亮光線下進(jìn)行感觀檢驗(yàn)。 

7 2 3 pH值測定 

液體固氮菌肥料的 pH值測定：取供檢菌液直接測定 pH值，取三次測定結(jié)果的平均數(shù)。固體固氮菌肥料的 pH值測定：取 50mL燒杯一個，加入菌肥 25g，無離子水 25mL。通過磁力攪拌器使溶液均勻后用酸度計(jì)測定 pH值。取三次測定結(jié)果的平均數(shù)。 

7 2 4 含水量測定 

稱取固體固氮菌肥三份，每份 20 00g，精確到 0 01g，放入已稱恒重的鋁盒中。置105 干燥箱內(nèi)烘烤 4h，移至干燥器內(nèi)，冷卻后稱重。根據(jù)烘干前后質(zhì)量差按式（1）計(jì)算含水量。取三個樣品測定數(shù)的平均值。平行樣品絕對偏差應(yīng)低于 1%。 

含水量（ m 

%）= 0-m1 

m 100 …………………………（1） 

0 

式中 m0———烘干前樣品質(zhì)量，g； 

m1———烘干后樣品質(zhì)量，g。 

7 2 5 吸附劑顆粒細(xì)度測定 

稱樣 10 00g 

（精確至 0 01g），置于標(biāo)準(zhǔn)篩中（直徑分別為 0 18mm或 0 15mm），用水沖洗，用毛筆輕刷，至粉末不再通過為止。將篩余物置 105! 110 溫度下烘干，稱重。篩余物百分含量按式（2）計(jì)算： 篩余物（%）=篩余物量 （1-樣品含水量百分?jǐn)?shù)） 

樣品質(zhì)量 100 …………（2） 

7 2 6 有效活菌數(shù)和雜菌含量測定 

采用平板計(jì)數(shù)法測定有效活菌數(shù)及雜菌率。 

7 2 6 1 測定步驟 

采樣應(yīng)不少于 500g，從中稱取 10 00g，加入帶玻璃珠的 100mL的無菌水中（液體菌劑取 10mL，加入 90mL的無菌水中），靜置 20min后在旋轉(zhuǎn)式搖床上 200r/min充分振蕩 

30min，即成母液的菌懸液。 

用無菌吸管吸取 5mL上述母液的菌懸液加入 45mL無菌水中，混勻成 1 10稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋，分別得到 1 1 102，1 1 103，1 1 104，1 1 105等濃度（每個稀釋度必須更換無菌吸管）。 

用 0 5mL無菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液 0 1mL，加至直徑為 9cm平皿的選擇培養(yǎng)基（見附錄 A）表面，用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻地涂于瓊脂表面，或取 1mL不同稀釋度菌懸液加入培養(yǎng)皿內(nèi)，與瓊脂培養(yǎng)基混勻，每個樣品取 3個連續(xù)適宜稀釋度，每一稀釋度重復(fù) 3次，同時加無菌水的空白對照。28 培養(yǎng) 2! 3d后每個稀釋度取 5! 10個菌落的菌體，涂片染色（見附錄 B）。顯微鏡觀察識別后，選一個適宜稀釋度（菌落在 30!300個之間的平板），計(jì)算出同一稀釋度三個平皿上菌落平均數(shù)。 

雜菌數(shù)是指在選擇培養(yǎng)基上，除有效活菌外的其他菌的菌落數(shù)與馬丁培養(yǎng)基上霉菌數(shù)之和。馬丁培養(yǎng)基 10-4稀釋度菌懸液加樣，操作步驟同樣品有效活菌數(shù)檢測操作。 

7 2 6 2 允許差 

平行樣品誤差按式（3）計(jì)算，并應(yīng)符合表 2的規(guī)定。 

*= %（x--x） 

( n-1 …………………………………（3） 

式中 *———單一標(biāo)準(zhǔn)差； 

x———同一個稀釋度任一個平板測定值； 

-x———同一個稀釋度平板測定的平均值； 

n———重復(fù)次數(shù)。 

表 2 平板上菌落數(shù)對應(yīng)的單—標(biāo)準(zhǔn)差 

平板上菌落數(shù)，個 /皿 30! 50 51! 99 100! 300 

單一標(biāo)準(zhǔn)差， 10 0 20 0 50 0 

7 2 6 3 測定結(jié)果的計(jì)算 

按式（4）、式（5）計(jì)算樣品的有效活菌數(shù)及雜菌率 

有效 活 菌 數(shù)（ 個 /g）=菌 落 平 均 數(shù) 稀 釋 倍 數(shù) 母液菌懸液的體積（mL）

菌劑克數(shù)或毫升數(shù) 

1 

加樣量（mL） ……………………………………………………………………………（4） 

雜菌率（%）= 雜菌數(shù) 

有效菌數(shù) +雜菌數(shù) 100 ……………………（5） 

7 2 7 有效期檢驗(yàn)在產(chǎn)品說明書標(biāo)明的有效期到達(dá)前 10d測定擾品各項(xiàng)指標(biāo)，方法同7 2 1! 7 2 6。 

8 檢驗(yàn)規(guī)則 

8 1 檢驗(yàn)分類 

8 1 1 產(chǎn)品出廠檢驗(yàn) 

產(chǎn)品交貨時進(jìn)行的檢驗(yàn)。 

8 1 2 產(chǎn)品型式檢驗(yàn) 

新產(chǎn)品鑒定或國家質(zhì)檢機(jī)構(gòu)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)。 

8 2 檢驗(yàn)項(xiàng)目 

型式檢驗(yàn)的檢驗(yàn)項(xiàng)目按 5 2要求進(jìn)行。出廠檢驗(yàn)不檢有效期。 

8 3 判定規(guī)則 

8 3 1 合格產(chǎn)品： 

a）檢驗(yàn)結(jié)果符合 5 2所規(guī)定的技術(shù)指標(biāo)的產(chǎn)品為合格產(chǎn)品； 

b）產(chǎn)品有效活菌數(shù)符合指標(biāo)，雜菌率不符合指標(biāo)，但小于本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的兩倍時（液體10%、固體 30%、凍干瓶 4%），而且在馬丁培養(yǎng)基平板上霉菌數(shù)小于 30 105，其他指標(biāo)有一項(xiàng)不符合，也可判為合格產(chǎn)品； 

C產(chǎn)品有效活菌數(shù)及雜菌率符合指標(biāo)，在水分、外觀、pH值、細(xì)度等次要檢測項(xiàng)目中，有 3項(xiàng)不符合技術(shù)指標(biāo)，也判為合格產(chǎn)品。 

8 3 2 不合格產(chǎn)品 

a）產(chǎn)品有效活菌數(shù)不符合技術(shù)指標(biāo)或投入菌種沒有完全相應(yīng)的檢驗(yàn)出，判為不合格產(chǎn)品； 

b）產(chǎn)品雜菌率超過本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的兩倍（液體 10%、固體 30%、凍干瓶 4%），判為不合格產(chǎn)品； 

c）產(chǎn)品有效活菌數(shù)符合指標(biāo)，雜菌率不符合指標(biāo)，但小于本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的兩倍時 C液體10%、固體 30%、凍干瓶 4%），其他指標(biāo)有兩項(xiàng)不符合指標(biāo)，判為不合格產(chǎn)品； 

d）產(chǎn)品檢驗(yàn)在馬丁培養(yǎng)基平板上霉菌數(shù)#30 105，判為不合格產(chǎn)品； 

e）產(chǎn)品水分、pH值、細(xì)度、外觀等次要檢測項(xiàng)目中，有 4項(xiàng)不符合技術(shù)指標(biāo)，判為不合格產(chǎn)品。 

8 3 3 含有植物促生根際細(xì)菌（PGPR）的固氮菌肥料產(chǎn)品檢測時，只測固氮菌數(shù)量，不測 

植物促生根際細(xì)菌的數(shù)量，也不視其為雜菌。 

8 3 4 本標(biāo)準(zhǔn)中質(zhì)量指標(biāo)合格判斷，采用 GB/T1250中修約值比較。

 9 包裝、標(biāo)識、運(yùn)輸和貯存 

9 1 包裝 

9 1 1 內(nèi)包裝 

液體肥料小包裝用塑料瓶或玻璃瓶，大包裝用塑料桶。固體肥料用不透明聚乙烯塑料袋包裝。凍干菌劑用玻璃指形管真空干燥。 

9 1 2 外包裝 

外包裝采用紙箱，紙箱質(zhì)量應(yīng)符合 GB/T6543的要求。箱外用尼龍打包帶加固。 

9 1 3 每箱（袋）產(chǎn)品中附有產(chǎn)品合格證和使用說明書，在使用說明中標(biāo)明使用方法、用 

量及注意事項(xiàng)。 

9 2 標(biāo)識 

在包裝箱（袋）上印有產(chǎn)品名稱、商標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)編號、肥料登記證號、生產(chǎn)單位、廠址、生產(chǎn) 

日期、批號和凈重，并印有防曬、防潮、防凍等標(biāo)記，若有必要還要加印易碎、防倒置等標(biāo) 

記。內(nèi)包裝上有產(chǎn)品名稱、商標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)編號、肥料登記證號、有效菌含量、生產(chǎn)日期、有效 

期、產(chǎn)品性能、使用說明書及生產(chǎn)單位、廠址等。 

9 3 運(yùn)輸 

適用于常用運(yùn)輸工具，運(yùn)輸過程中有遮蓋物，防止雨淋、日曬及 35 以上高溫。氣溫低于 0 時采取保溫措施，防止菌肥凍冰。運(yùn)輸過程中輕裝輕卸，避免包裝破損。 

9 4 貯存 

產(chǎn)品貯存在陰涼、干燥、通風(fēng)的庫房內(nèi)，最適溫度為 10 ! 25 ，不得露天堆放，以防雨淋和日曬，避免凍冰及長時間 35 以上高溫。 

以上高溫。 

附 錄 A 

（標(biāo)準(zhǔn)的附錄） 

有效活菌數(shù)和雜菌（霉菌）測定的選擇培養(yǎng)基 

A1 固氮菌用阿須貝氏（Ashby）培養(yǎng)基 

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 0 2g 

硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 0 2g 

氯化鈉（NaCl） 0 2g 

碳酸鈣（CaCO3） 5 0g 

甘露醇（CsH14O6） 10 0g 

硫酸鈣（CaSO4·2H2O） 0 1g 

pH 7 0 

A2 固氮（莖瘤）根瘤菌培養(yǎng)基 

乳酸鈉（C3H3O3Na） 10 0g 

磷酸氫二鉀（K2HPO4） 1 67g 

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 0 87g 

氯化鈉（NaCl） 0 05g 

氯化鈣（CaCl2） 0 04g 

氯化鐵（FeCl3） 0 004g 

硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 0 1g 

酵母膏 1 0g 

（或酵母粉 0 8g） 

pH 6 8 

A3 聯(lián)合固氮菌培養(yǎng)基 

D-葡萄糖酸鈉（C6H11O7Na） 5 0g 

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 0 4g 

磷酸氫二鉀（K2HPO4） 0 1g 

硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 0 2g 

酵母膏 1 0g 

（或酵母粉 0 8g） 

氯化鈉（NaCl） 0 1g 

氯化鈣（CaCl2） 0 02g 

氯化鐵（FeCl3） 0 01g 

鉬酸鈉（Na2MoO4） 0 002g 

pH 6 8! 7 0 

A4 馬丁培養(yǎng)基（測霉菌數(shù)） 

磷酸氫二鉀（K2HPO4） 1 0g 

硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 0 5g 

葡萄糖（C6H12O6·H2O） 10 0g 

蛋白胨 5 0g 

1%孟加拉紅水溶液〔四氯四碘熒光素 

（C20H4ClI 

44O5）〕 3 3mL 

每升培養(yǎng)基中加入 0 1g氯霉素，一起滅菌。 

注 以上各培養(yǎng)基需蒸餾水 1000mL，瓊脂 18! 20g 

附 錄 B 

（標(biāo)準(zhǔn)的附錄） 

染色劑和染色方法 

B1 莢膜染色法 

B1 1 染色劑 

石碳酸復(fù)紅染色液 

甲液：堿性復(fù)紅（Basicfuchsin） 

（C20H20ClN3） 0 3g 

95%酒精（CH3CH2OH） 10 0mL 

乙液：石碳酸（C6H5OH） 5 0g 

蒸餾水 95 0mL 

a）將堿性復(fù)紅在研缽中研磨后，逐漸加入 95%酒精，繼續(xù)研磨使之溶解，配成甲液。 

b）將石碳酸溶解在蒸餾水中配成乙液。 

c）把甲液和乙液混合搖勻，成為石碳酸復(fù)紅，通?？蓪⒒旌弦合♂?span lang="EN-US"> 5! 10倍使用。 

稀釋液易變質(zhì)失效，一次不宜多配。 

B1 2 染色方法 

B1 2 1 取少量培養(yǎng)菌涂于載玻片水滴中，涂成薄層。 

B1 2 2 自然干燥或稍加熱。 

B1 2 3 在石碳酸復(fù)紅染 1min后，水洗，干后鏡檢。 

B1 3 染色結(jié)果 

菌體為紅色，菌體周圍有一層透明圈即為莢膜。 

B2 芽胞染色法 

B2 1 染色劑 

B2 1 1 5%孔雀綠 

孔雀綠（C23H25ClN2） 5 0g 

蒸餾水 100mL 

B2 1 2 0 05%堿性復(fù)紅 

堿性復(fù)紅（C20H20ClN3） 0 5g 

95%酒精 100mL 

B2 2 染色方法 

B2 2 1 制片。 

B2 2 2 加孔雀綠染液3! 5滴于涂片處，酒精燈火焰加熱至冒汽，但不沸騰，并隨時補(bǔ)加 

染液，維持涂片處不干，染色約 5! 10min。 

B2 2 3 自來水沖洗 30s。 

B2 2 4 用 0 05%堿性復(fù)紅染色1min，水洗，鏡檢（若 0 05%堿性復(fù)紅濃度太高，可根據(jù) 

具體情況適當(dāng)稀釋）。 

B2 3 染色結(jié)果 

芽胞綠色，菌體紅色。 

B3 革蘭氏染色法 

B3 1 染色劑 

B3 1 1 結(jié)晶紫染色液 

甲液 結(jié)晶紫（C25H30ClN3·9H2O） 2 0g 

乙醇（95%） 

（CH3CH2OH） 20mL 

乙液：草酸銨〔（NH4）2C2O4·H2O〕 0 8g 

蒸餾水 80mL 

甲、乙液相混，靜置 48h后使用。 

B3 1 2 盧哥（Lugol）氏碘液 

碘（I2）片 1 0g 

碘化鉀（KI） 2 0g 

蒸餾水 300mL 

先用少量（3! 5mL）蒸餾水溶解碘化鉀，再投入碘片，待碘全溶后，加水 100mL，配成母 

液，使用時加兩倍水，稀釋成盧哥氏碘液。 

B3 1 3 脫色液：95%乙醇。 

B3 1 4 復(fù)染液：0 5%的番紅水溶液 

2 5%番紅酒精溶液 10mL 

蒸餾水 100mL 

B3 2 染色方法 

B3 2 1 制片。 

B3 2 2 滴加結(jié)晶紫液，覆蓋 1min。 

B3 2 3 用水沖凈結(jié)晶紫液。 

B3 2 4 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋 1min。 

B3 2 5 用水沖去碘液，用吸水紙吸去水分。 

B3 2 6 加 95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進(jìn)行脫色，30s后水洗，吸去水分。 

B3 2 7 番紅染色液染 10s后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。 

B3 3 染色結(jié)果 

革蘭氏正反應(yīng)菌體呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體呈紅色。 

B4 鞭毛染色 

B4 1 染色劑 

甲液：丹寧酸（C76H52O46） 5 0g 

氯化鐵（FeCl3） 1 5g 

甲醛（15%） 

（HCHO） 2 0mL 

氫氧化鈉（NaOH） 

（1%） 1 0mL 

蒸餾水 100mL 

乙液：硝酸銀（AgNO3） 2g 

蒸餾水 100mL 

待硝酸銀溶解后，取出 10mL備用，其余的 90mL硝酸銀液中滴加濃氫氧化銨，則形成很濃厚的沉淀，再繼續(xù)滴加氫氧化銨到剛剛?cè)芙獬恋沓蔀槌吻迦芤簽橹?。再將備用的硝酸銀慢慢滴人，則出現(xiàn)薄霧，但輕輕搖動后，薄霧狀的沉淀又消失，再滴入硝酸銀，直到搖動后，仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止（如霧重，則銀鹽沉淀出，不宜使用）。 

B4 2 染色方法 

4 2 1 涂片：在載玻片的一端滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取斜面上少許菌苔，在載玻片的水滴中輕蘸幾下。將玻片稍傾斜，使菌液隨水滴緩慢流到另一端，然后平放在空氣中干燥B4 2 2涂片干燥后，滴加甲液染3! 5min，用蒸餾水沖洗。加乙液染30! 60s，并在酒精燈上加熱，使其稍冒蒸氣而染液不干，然后用蒸餾水沖洗，干后鏡檢。 

B4 3 染色結(jié)果 

菌體為深褐色，鞭毛為褐色。 

附 錄 C 

（標(biāo)準(zhǔn)的附錄） 

菌種固氮效能測定方法 

在 500mL三角瓶中加入 100mL無氮培養(yǎng)基（含糖 1%即 1g），121 滅菌 30min。無菌操作，每瓶接入兩環(huán)待測菌種（或 1mL培養(yǎng) 3d的培養(yǎng)液），放置搖床上振蕩（120r/min） 

30 培養(yǎng) 5! 7d后，取出定糖測氮。 

定糖采用蒽酮光電比色法。 

測氮采用半微量光電比色法。 

C1 蒽酮光電比色法 

C1 1 測定原理 

糖類遇硫酸即脫水成為醛類，再變成呋喃衍生物，后者與蒽酮縮合，生成藍(lán)綠色化合物。于 580! 650nm處進(jìn)行比色測定（蒽酮可與單糖、雙糖、淀粉、糊精等反應(yīng)），該方法適 

合于含糖量 0 003%以上的樣品。 

C1 2 試劑和儀器 

分析中除有說明外，限用分析純試劑和 GB/T6682中規(guī)定的三級水。 

C1 2 1 硫酸。 

C1 2 2 0 2%（m/V）蒽酮溶液：稱取 0 2g蒽酮于 100mL硫酸中。充分?jǐn)嚢?，使其溶解?span lang="EN-US"> 

該溶液不穩(wěn)定，應(yīng)當(dāng)天配用。 

C1 2 3 葡 萄 糖 標(biāo) 準(zhǔn) 液：準(zhǔn) 確 稱 取 葡 萄 糖 1 000g，溶 于 水 中，定 容 至 1000mL，即 為 

1 000mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。 

C1 2 4 分光光度計(jì)。 

C1 3 分析步驟 

C1 3 1 試樣處理 

取發(fā)酵培養(yǎng)的菌液 1 00! 4 00mL（取決于含糖量），稀釋至 100 00ml，取此稀釋液1 00mL于比色管中，加水至 2 00mL，每管加入蒽酮試劑 4 00mL，搖勻，水浴加熱 15min，使之充分顯色，冷卻后，于 580! 650nm處進(jìn)行比色測定，記錄吸光度，同時進(jìn)行空白試驗(yàn)。 

C1 3 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 1 00、2 00、4 00、6 00、8 00、10 00、20 00mL。于 100mL容量瓶 

中，加水至刻度，該液分別含糖 10、20、40、60、80、100、200%g/mL。 

吸取 1.00mL放入比色管中，加水至 2.00mL，按 C1.3.1方法測定，記錄吸光度用標(biāo)準(zhǔn)系列的含糖量定義橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 

C1 4 分析結(jié)果的計(jì)算 

100mL溶液的含糖量（ X）按式（C1）計(jì)算： 

X=（m1-m2） 100 

m 100 10-6…………………………（1） 

式中：m1———標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的試驗(yàn)含糖量，%g/mL； 

m2———標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的空白試驗(yàn)的含糖量，%g/mL； 

m———吸取發(fā)酵溶液體積，mL。 

C1 5 允許差 

a）取平行測定的算術(shù)平均值為測定結(jié)果； 

b）平行測定結(jié)果的允許差不大于 0 005g/100mL。 

C2 固氮菌液全氮比色測定法 

C2 1 測定原理 

在硫酸銅或硫酸鉀存在下，濃硫酸中加入菌液，并加熱使試樣全部有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮，與奈氏試劑反應(yīng)，于波長 420nm處進(jìn)行比色測定。 

C2 2 試劑和儀器 

分析中除非另有說明，限用分析純試劑和 GB/T6682中規(guī)定的三級水。 

C2 2 1 硫酸（GB/T625）。 

C2 2 2 雙氧水 

C2 2 3 氫氧化鈉（GB/T629）2mol/L溶液：稱量 8g氫氧化鈉溶于水中，定容至 100mL。 

C2 2 4 40%（m/V）氫氧化鈉（GB/T629）溶液：稱取 40g氫氧化鈉溶于 100mL。水中。 

C2 2 5 50%（m/V）酒石酸鉀鈉溶液：50g酒石酸鉀鈉溶于 100mL水中。 

C2 2 6 奈氏試劑：7 1g碘化鉀，10g碘化汞（HgI2）溶于少量水中，另配 16g氫氧化鈉溶于 

70mL水中，冷卻后將前一溶液緩緩倒入氫氧化鈉溶液中，邊加邊攪拌，最后用水稀釋至100mL，靜置過夜，取清液儲于棕色瓶中。 

C2 2 7 催化劑：100 0g硫酸鉀與 10 0g硫酸銅共同研磨均勻，儲于廣口瓶中。 

C2 2 8 分光光度計(jì)。 

C2 3 分析步驟 

C2 3 1 試樣制備和測試 

吸取固氮菌液 1 00mL于 30mL消化管中，加硫酸（C2 2 1）3mL，加 0 1g催化劑（C2 2 7）和 5滴雙氧水（C2 2 2）消煮至清亮，若反應(yīng)液久煮不清，可冷卻后加 1! 2滴雙氧水（C2 2 2），繼續(xù)煮至無色透明，取下冷卻。加少許蒸餾水，搖勻，滴加 40%氫氧化鈉至出現(xiàn)氫氧化銅沉淀（約 11! 12mL），加酒石酸鉀鈉（C2 2 5）20滴，以去除氫氧化物沉淀掩蔽鈣鎂，將試管液全部轉(zhuǎn)移至 100mL容量瓶中，消化管洗滌液一并倒入容量瓶，稀釋至刻度，搖勻。過濾，濾液 10 00mL于比色管中，加氫氧化鈉（C2 2 3）1 00mL，加酒石酸鉀鈉 1 00mL，加奈氏試劑 3mL，搖勻，顯色 2! 3min后，即倒入比色杯中，于 420nm處比色計(jì)測定。讀取吸光度。 

C2 3 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 

準(zhǔn)確稱取在（105 5） 烘 1h直至恒重的優(yōu)級純試劑硫酸銨 0 4716g，溶于水，稀釋至 

100mL，該液含氮 1mg/mL，取此液 0 05、0 10、0 25、0 50、1 00、2 00mL。放入 100mL容量瓶，用水稀釋至刻度，其含氮分別為 0 50、1 00、2 50、5 00、10 00、20 00/%g/mL，取標(biāo)準(zhǔn)液各 1mL放入比色管中，加水至 2mL，按 C1 3 1方法測定，記錄吸光度。 

用標(biāo)準(zhǔn)液的氮含量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。 

C2 4 分析結(jié)果的計(jì)算 

氮（ X）含量以 g/100mL表示，按式（C2）計(jì)算 

X=（m1-m2） 1000 

m 100 10-6………………………（ C2） 

式中 m1———標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的試驗(yàn)含氮量，%g/mL； 

m2———標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的空白試驗(yàn)氮含量，%g/mL； 

m———吸取發(fā)酵溶液體積，mL。 

C2 5 允許差 

a）取平行測定和算術(shù)平均值為測定結(jié)果； 

b）平行測定結(jié)果的允許差不大于 0 005g。