摘 要:本發(fā)明公開了一種基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，該方法步驟流程包括對不同工業(yè)大麻產(chǎn)品進行的前處理、采集樣品的紅外光譜曲線、液相色譜法實測樣品中大麻二酚含量、紅外光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理及分析、建立模型、驗證模型。本發(fā)明基于中紅外光譜技術(shù)，結(jié)合PLS模型的預(yù)測能力和主成分分析的區(qū)分效果，可以對工業(yè)大麻提取物產(chǎn)品、花葉中的大麻二酚含量進行快速檢測。信息量簡潔豐富，且采用無損鑒別，操作簡單，綠色環(huán)保，性能可靠，具有較低的相關(guān)耗材和維修成本，降低了運行成本和環(huán)保風(fēng)險，節(jié)省大量的人力、物力、財力，適合推廣使用。為快速測定不同工業(yè)大麻產(chǎn)品的大麻二酚含量提供了一種新方法。
權(quán)利要求書
1.一種基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，其特征在于：該方法步驟流程包括：
(1)采集樣品的紅外光譜曲線；
(2)對步驟(1)得到的紅外光譜曲線進行預(yù)處理，得到排除噪音干擾的中紅外光譜數(shù)據(jù)；
(3)測定樣品中大麻二酚含量；
(4)將步驟(3)得到的大麻二酚含量數(shù)據(jù)與步驟(2)得到的中紅外數(shù)據(jù)進行回歸建模得到大麻二酚含量的中紅外預(yù)測模型；
(5)檢測待測定樣品的紅外光譜曲線，代入步驟(4)得到的大麻二酚含量的中紅外預(yù)測模型中，得到待檢測樣品的大麻二酚含量，完成所有檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，其特征在于：步驟(2)中預(yù)處理方法包括多元散射校正、偏差校正、平滑處理、變量標準化、一階導(dǎo)數(shù)處理、二階導(dǎo)數(shù)處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，其特征在于：步驟(4)所述的建模方法是指利用中紅外光譜儀和超高效液相色譜兩種高精密儀器所測得數(shù)據(jù)進行建模，首先將步驟(2)的中紅外光譜數(shù)據(jù)，將其作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的預(yù)測值，再使用超高效液相色譜儀檢測同批樣品的大麻二酚含量，液相色譜所測數(shù)據(jù)作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的真實值，之后將兩組數(shù)據(jù)進行回歸建模，便可得到工業(yè)大麻中大麻二酚含量中紅外光譜預(yù)測模型。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
工業(yè)大麻是在中國傳統(tǒng)種植的“火麻”或稱“漢麻”，基礎(chǔ)上培育的，植物干花葉中化學(xué)成分△9 四氫大麻酚含量小于0.3％Wt，可針對纖維用、籽用或花葉提取等工業(yè)應(yīng)用的低毒大麻品種。其中以大麻二酚為代表的大麻素類化學(xué)物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)具有抗抑郁、抗精神病、抗炎、神經(jīng)系統(tǒng)保護等多種藥理活性，近年來對工業(yè)大麻花葉中的藥用成分提取加工和應(yīng)用開發(fā)也非常多，因此國內(nèi)外種質(zhì)研發(fā)機構(gòu)紛紛研究和生產(chǎn)出多種高大麻二酚、低△9 四氫大麻酚含量的工業(yè)大麻產(chǎn)品，其中，全譜油作為一種典型的工業(yè)大麻提取物產(chǎn)品，它包含多種活性成分，這些成分共同作用產(chǎn)生了全譜油獨特的藥理活性，因其廣泛的健康益處在醫(yī)藥、保健品行業(yè)而備受青睞，所以市面上也催生出了很多的全譜油假冒偽劣產(chǎn)品。本發(fā)明專利的目的在于研究工業(yè)大麻和衍生產(chǎn)品的紅外光譜特性，建立一種快速、準確、簡便的工業(yè)大麻產(chǎn)品、品種鑒別方法。
中紅外光譜分析技術(shù)作為一種快速檢測技術(shù)具有分析時間短、操作簡單、分析成本低等優(yōu)勢，近年來在食品藥品的質(zhì)量分析、真假鑒定和產(chǎn)地鑒別等方面應(yīng)用越來越廣泛。本發(fā)明對工業(yè)大麻提取全譜油、花葉泡酒和工業(yè)大麻花葉的紅外光譜特性進行了研究，利用紅外光譜技術(shù)和數(shù)據(jù)處理軟件進行大麻二酚含量的預(yù)測和主成分分析。采用本研究的紅外快檢技術(shù)可對不同樣品進行快速區(qū)分和CBD含量的快速定量，具有很好的實際應(yīng)用價值。
目前檢測大麻二酚含量常用的方法通常是液相色譜法(HPLC)或液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)分析，這些方法存在成本較高(流動相消耗多且存在環(huán)境污染，維護成本大)、分析時間長、檢測量小等問題，但使用本發(fā)明提供的方法剛好可以解決這些問題，本發(fā)明使用便攜式紅外光譜分析儀進行測定，設(shè)備維護簡單，檢測方法快速、簡便，并且有效避免了液相色譜或質(zhì)譜檢測過程中使用流動相對環(huán)境造成的污染。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有大麻二酚在檢測過程中存在的問題，本發(fā)明提供另一種基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，該方法步驟流程包括：
(1)采集樣品的紅外光譜曲線。
(2)對步驟(1)得到的紅外光譜曲線進行預(yù)處理，得到排除噪音干擾的中紅外光譜數(shù)據(jù)。
(3)測定樣品中大麻二酚含量。
(4)將步驟(3)得到的大麻二酚含量數(shù)據(jù)與步驟(2)得到的中紅外數(shù)據(jù)進行回歸建模得到大麻二酚含量的中紅外預(yù)測模型。
(5)檢測待測定樣品的紅外光譜曲線，代入步驟(4)得到的大麻二酚含量的中紅外預(yù)測模型中，得到待檢測樣品的大麻二酚含量，完成所有檢測。
優(yōu)選的，步驟(1)中，當樣品為液體時取0.1克溶解于2mL75％乙醇溶劑中，超聲處理15min，取50uL于2毫米厚溴化鉀壓片上，再將另一個壓片壓上去作為背景，然后放置到檢測窗口待測得到樣品的紅外光譜曲線。
優(yōu)選的，步驟(1)中，當樣品為固體時，將樣品清洗、烘干、粉碎、過篩，稱取過篩得到粉末樣品0.1克，均勻平鋪于測試臺上檢測得到樣品的紅外光譜曲線。
優(yōu)選的，步驟(1)中中紅外光譜的采集條件為：掃描范圍700～3800cm 1，每個樣品采集3次。中紅外光譜分析儀為美國安捷倫ATR Cary 630FTIR便攜式光譜儀，數(shù)據(jù)采集軟件為Agilent MicroLab PC Software。
優(yōu)選的，步驟(2)中數(shù)據(jù)處理軟件為Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1，經(jīng)預(yù)處理后剔除異常樣品數(shù)據(jù)，獲得工業(yè)大麻不同樣品的排除噪音干擾的中紅外光譜曲線。紅外光譜預(yù)處理的方法包括多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)、偏差校正(Deviation correction)、平滑處理、變量標準化、一階導(dǎo)數(shù)處理、二階導(dǎo)數(shù)處理。
優(yōu)選的，步驟(3)中大麻二酚含量通過超高效液相色譜Agilent Technologies 1290 Infinity測得。
優(yōu)選的，步驟(4)所述的建模方法是指利用中紅外光譜儀和超高效液相色譜兩種高精密儀器所測得數(shù)據(jù)進行建模，首先將步驟(2)的中紅外光譜數(shù)據(jù)，將其作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的預(yù)測值，再使用超高效液相色譜儀檢測同批樣品的大麻二酚含量，液相色譜所測數(shù)據(jù)作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的真實值，之后將兩組數(shù)據(jù)進行回歸建模，建模軟件為Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1，便可得到工業(yè)大麻中大麻二酚含量中紅外光譜預(yù)測模型。
本發(fā)明的有益效果
(1)該方法操作簡單，在建立模型之后，只需對操作人員簡單培訓(xùn)即可，光譜數(shù)據(jù)帶入模型即可直接得到結(jié)果，無需專業(yè)人員，檢測速度快，檢測成本低廉，很適合推廣應(yīng)用。
附圖說明
圖1為工業(yè)大麻的中紅外原始光譜圖。
圖1
圖2為光譜預(yù)處理圖，其中(1)為多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)；(2)為偏差校正(Deviation correction)；(3)為平滑處理(SG)；(4)為變量標準化(SNV)；(5)為一階導(dǎo)數(shù)處理；6.二階導(dǎo)數(shù)處理。
圖2
圖3為工業(yè)大麻主成分分析圖，其中(1)為2種工業(yè)大麻產(chǎn)品和花葉(花葉提取全譜油、花葉泡酒、工業(yè)大麻花葉)的主成分分析圖；(2)為三種全譜油產(chǎn)品主成分分析圖；(3)為三種花葉的主成分分析圖。
圖3
圖4為不同區(qū)域工業(yè)大麻的聚類分析圖。
圖4
圖5為工業(yè)大麻中大麻二酚含量中紅外光譜預(yù)測模型。
圖5
具體實施方式
下面結(jié)合附圖并通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。但下述的實施例僅僅是本發(fā)明的簡易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護范圍，本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準。
實施例中使用的儀器：安捷倫ATR Cary630 FTIR便攜式光譜儀；超高效液相色譜Agilent Technologies 1290 Infinity；數(shù)據(jù)處理軟件：Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1；MetaboAnalyst5.0。
下列實施方式中，根據(jù)中紅外掃描數(shù)據(jù)以及液相色譜測定數(shù)據(jù)建立模型。實驗所用樣品包括工業(yè)大麻提取全譜油、花葉泡酒和工業(yè)大麻花葉，均由云南工業(yè)大麻種植加工企業(yè)和云南工業(yè)大麻協(xié)會提供。
實施例1
一種中紅外光譜預(yù)測模型的建立，具體步驟如下所述：
(1)采集檢測樣品的中紅外光譜曲線：
A.將工業(yè)大麻提取全譜油、工業(yè)大麻花葉泡酒各取0.1克溶解于2mL75％乙醇溶劑中，超聲處理15min，待用。
B.將步驟(A)處理后的工業(yè)大麻提取全譜油和工業(yè)大麻花葉泡酒樣品使用移液槍分別滴50uL于溴化鉀壓片上，再將另一個背景壓片壓上去，然后放置到檢測窗口測試，每個樣品重復(fù)三次，
C.工業(yè)大麻花葉樣品前處理方法為清洗、烘干、粉碎、過篩。稱取過篩得到花葉粉末樣品0.1克，均勻平鋪于測試臺準備待測，檢驗時間為30秒，每個樣品重復(fù)三次，每次測樣后均用95％酒精擦拭檢測窗口。
得到的中紅外原始光譜圖如圖1所示。
(2)對步驟(1)得到的中紅外原始光譜圖進行預(yù)處理，得到排除噪音干擾的中紅外光譜數(shù)據(jù)，具體為將步驟(1)得到的每個樣品的3個重復(fù)中紅外原始光譜圖進行散射校正和預(yù)處理，包括多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)、偏差校正(Deviation correction)、平滑處理(SG)、變量標準化(SNV)、一階導(dǎo)數(shù)處理、二階導(dǎo)數(shù)處理，處理結(jié)果如圖2所示，其中圖2(1)為多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)結(jié)果；圖2(2)為偏差校正(Deviation correction)處理結(jié)果；圖2(3)為平滑處理結(jié)果；圖2(4)為變量標準化處理結(jié)果；圖2(5)一階導(dǎo)數(shù)處理；圖2(6)二階導(dǎo)數(shù)處理。
(3)測定樣品中大麻二酚含量：采用超高效液相色譜測定樣品中大麻二酚含量，具體步驟為：
A.標準曲線的制備
稱取1ml濃度1000ug/ml的大麻二酚標準溶液至10ml容量瓶中，并定容至刻度線，制得200ug/ml的標準溶液，并放置在 20℃下的冰箱內(nèi)避光冷藏待用，后續(xù)標準工作溶液分析設(shè)置5個不同梯度進樣(0.2μL，0.5μL，1μL，2μL，5μL)。
B.樣品分析
稱量工業(yè)大麻花葉粉末樣品0.2g，使用95％甲醇 水溶液提取，定容10mL，超聲30min，12000r/min離心5min，取出上清液，過0.22μm的有機系濾膜過濾，再將濾液轉(zhuǎn)移至色譜進樣瓶中上機分析。HPLC條件設(shè)置：Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流動相A為0.1％磷酸水溶液，B為甲醇溶液，等度洗脫：75％B，流速0.30ml/min，色譜柱溫：30℃；進樣量設(shè)置為1μL。并考察所檢測樣品處理液濃度是否在標準曲線范圍之內(nèi)，若不在，需稀釋或濃縮樣品處理液。
C.樣品含量計算公式
標準工作溶液的峰面積作為y，并與其相對應(yīng)的標準濃度進行回歸分析，可得標準曲線：y＝6.9806x 3.6129，R2＝0.9997。再根據(jù)峰面積之比對于濃度之比，即可算出大麻二酚的實際含量，所有樣品大麻二酚的實際含量如表1所示。
表1 樣品中大麻二酚含量的實測結(jié)果
(4)將步驟(2)得到的中紅外光譜數(shù)據(jù)，將其作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的預(yù)測值，再使用超高效液相色譜儀檢測同批樣品的大麻二酚含量，液相色譜所測數(shù)據(jù)作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的真實值，之后將兩組數(shù)據(jù)進行回歸建模，建模軟件為Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1，便可得到工業(yè)大麻中大麻二酚含量中紅外光譜預(yù)測模型。
對不同條件下建立的模型進行比較，選擇定標模型交叉驗證偏差(SEC)小，預(yù)測均方根誤差(RMSE)小，交叉驗證相關(guān)系數(shù)R大的模型。對不同條件下建立的模型進行比較，選擇定標模型交叉驗證偏差(SEC)小，預(yù)測均
方根誤差(RMSE)小，交叉驗證相關(guān)系數(shù)R大的模型。不同處理條件的比較如表2所示。最終選擇MSC+SG+SNV+2階求導(dǎo)，所得線性方程為y＝0.97647612*x+0.01719390。
表2 不同處理方法
實施例2
模型準確性預(yù)測
將待檢測的工業(yè)大麻樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入到中紅外預(yù)測模型當中，如圖5所示，篩選出其中不同產(chǎn)地的工業(yè)大麻所得結(jié)果進行驗證，并將這些數(shù)據(jù)分為校正集和驗證集，通過內(nèi)部交叉驗證的方式對模型的預(yù)測能力進行驗證，分別計算出每一個校正集和驗證集的準確率及相對標準偏差，以及交叉驗證相關(guān)系數(shù)(R2)、殘差，最后求平均值，結(jié)果如表3所示。準確率越高、相關(guān)系數(shù)越大說明模型預(yù)測效果越好，所有校正集和驗證集準確率均在80％以上，相對標準偏差均低于28％，表明該模型可以成功使用。
相對標準偏差RSD計算公式為
驗證集、校正集的準確率(A)計算公式為
將預(yù)測模型所計算出的每一個校正集、驗證集的預(yù)測含量導(dǎo)入EXCEL表格中，利用STDEV函數(shù)計算出標準偏差，代入RSD計算公式即可得到RSD值。
準確率計算公式中，|V|為每個樣品點殘差的絕對值。|P|為每個樣品點的預(yù)測值。殘差等于液相色譜所測的真實值減去預(yù)測模型所測的預(yù)測值，計算出每一個驗證集、校正集的準確率后，再求平均值，最終所得結(jié)果作為模型準確率判斷依據(jù)。
表3 PLS模型的準確率及RSD值(工業(yè)大麻花葉樣品)
為進一步驗證紅外光譜檢測的準確性，我們將實施例1中步驟(1)所得的原始光譜數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入主成分分析模型(PCA)中，分析是否可以有效區(qū)分不同品種。結(jié)果表明，該模型對于品種區(qū)分效果良好，可有效判別工業(yè)大麻不同品種，但缺點是無法對大麻二酚含量進行定量，結(jié)果如圖3所示，圖3(1)區(qū)分出了兩類工業(yè)大麻產(chǎn)品和花葉的區(qū)別(全譜油、工業(yè)大麻花葉泡酒杜、工業(yè)大麻花葉)。圖3(2)區(qū)分出了同種全譜油但不同含量的區(qū)別。圖3(3)區(qū)分出了工業(yè)大麻不同品種的區(qū)別(云麻7號、云麻8號、云麻10號)。該模型可證明紅外光譜檢測的準確性，同時可為工業(yè)大麻產(chǎn)品真假鑒別、品種區(qū)分提供一種依據(jù)。
根據(jù)實施例1中步驟(1)所得的原始光譜數(shù)據(jù)，還可對產(chǎn)地來源進行驗證，方法是通過建立聚類分析模型，可明顯區(qū)分出工業(yè)大麻6個產(chǎn)地的區(qū)別(楚雄、曲靖、尋甸、玉溪、保山、昆明、倘甸)，區(qū)分效果明顯、結(jié)果準確，同時可為產(chǎn)地溯源提供依據(jù)，模型如圖4所示。
實施例3真實值與預(yù)測值的比較
使用超高效液相色譜法檢測樣品的大麻二酚含量作為真實值，中紅外光譜預(yù)測模型為預(yù)測值，全譜油樣品的CBD含量預(yù)測標準差為4.94，標準誤差為1.71，花葉酒的CBD含量預(yù)測標準差為0.02，標準誤差為0.01，工業(yè)大麻花葉的CBD含量預(yù)測標準差為0.29，標準誤差為0.016，所有樣品的交叉驗證系數(shù)均大于0.9，表明模型可以成功使用。工業(yè)大麻樣品中的大麻二酚含量的真實值與預(yù)測值的比較如表4所示。
表4 22個樣品詳細信息
模型應(yīng)用
對待檢測樣品進行檢測，實驗值與預(yù)測值相關(guān)性圖見如圖5所示，全樣品預(yù)測值和實驗值的R均達到0.9以上，具有較高的預(yù)測準確性，說明模型可用于大麻花葉中大麻二酚含量的快速測定和初步篩選。
文章摘自國家發(fā)明專利，一種基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，發(fā)明人:李曉蕾，張浩，蔡尤西，張瑞婷，江茜，申請?zhí)?/font>:202411427449.6，申請日:2024.10.14。
