摘  要：該試驗旨在建立適合羅布麻保健茶總黃酮含量的檢測方法。以蘆丁為標準品,利用黃酮類分子在堿性溶液中顯色的原理測定含量。結(jié)果顯示:試驗方法的線性方程為Y=0.0012X+0.0031,R2=0.9997,線性關系良好;相對標準偏差SRSD為2.05%(n=6),回收率為99.1%(n=6),最低檢測線為4μg/mL。硝酸鋁顯色法更能代表羅布麻保健茶的品質(zhì)。

關鍵詞：羅布麻茶;總黃酮;硝酸鋁顯色法

羅布麻Apocynum venetum L.（紅麻）是夾竹桃科羅布麻屬多年生宿根草本植物，唐代《新修本草》、明代《救荒本草》稱“漆澤”，近代《中國高等植物》稱“茶葉花”。自20世紀50年代起，先后經(jīng)過我國幾十個科研院所、百余名科研人員的研究與臨床實驗表明，羅布麻（紅麻）葉具有清血脂、降血壓、解郁安神、清熱消炎、利尿消腫、抗氧化等功效，尤其降血壓功能比較顯著。羅布麻葉中富含黃酮類、有機酸、醇類、氨基酸、微量元素等活性物質(zhì)，大量試驗表明黃酮類物質(zhì)是羅布麻葉中的主要活性成分之一^[1-4]?？傸S酮包括黃酮與黃酮醇類等，是具有苯駢呋

喃環(huán)結(jié)構(gòu)的一類天然化合物總稱。目前，檢測總黃酮的方法有多種，研究發(fā)現(xiàn)不同的檢測方法測出羅布麻茶中的總黃酮含量不盡相同，有時還有較大差異^[5-9]。試驗采用硝酸鋁顯色對羅布麻茶中的總黃酮含量進行檢測，以期為羅布麻茶的進一步開發(fā)和研究提供參考^[10-11]。

1　材料與方法

1.1　材料

羅布麻茶樣品來自于阿勒泰戈寶茶股份有限公司自生產(chǎn)的戈寶紅麻^®羅布麻茶。

1.2　方法

1.2.1　蘆丁標準曲線的制備

精確吸取0，0.5，1.0，2.0，3.0和4.0mL蘆丁標準溶液于10mL比色管中，加入30%乙醇液至5mL，各加0.3mL5%NaNO₂溶液，振搖后放置5min，加入0.3mL10%Al(NO₃)₃溶液，搖勻后放置6min，加2mL1.0moL/LNaOH溶液，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，同時做空白，在510nm處測定吸光度。

1.2.2　樣品處理^[12-14]

取約1g羅布麻茶試樣粉末，準確稱定，倒入錐形瓶中，準確加入25mL70%乙醇，稱其質(zhì)量，回流1h，冷卻后，再次稱其質(zhì)量，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻后過濾，取1mL濾液于蒸發(fā)皿中，加1g聚酰胺粉，水浴上待乙醇揮發(fā)后轉(zhuǎn)入層析柱。依次用20mL石油醚、甲醇進行洗脫，將洗脫液濃縮，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，定容。

1.2.3　樣品測定

準確吸取2mL供試品溶液于10mL比色管中，加30%乙醇至5mL，照1.2.1，自“0.3mL加5%NaNO₂溶液”起，依法測定吸光度，并根據(jù)回歸方程計算樣品中總黃酮的含量。

1.2.4　顯色劑質(zhì)量分數(shù)選擇^[15-17]

1.2.4.1　NaNO₂質(zhì)量分數(shù)

吸取2mL150μg/mL蘆丁標準品溶液，分別加入0.5mL1%，3%，5%，7%和9%NaNO₂溶液，其余同1.2.3。

1.2.4.2　Al(NO₃)₃質(zhì)量分數(shù)

吸取2mL150μg/mL蘆丁標準品溶液，分別加入0.5mL2.5%，5%，7.5%，10%，12.5%和15%Al(NO₃)₃溶液，其余同1.2.3。

1.2.4.3　NaOH質(zhì)量分數(shù)

吸取2mL150μg/mL蘆丁標準品溶液，分別加入4mL1.5%，2.5%，4%，5.5%和7%NaOH溶液，其余同1.2.3。

2　結(jié)果與分析

2.1　顯色劑質(zhì)量分數(shù)的選擇

結(jié)果表明，NaNO₂質(zhì)量分數(shù)在1%~5%范圍內(nèi)吸光度逐漸增加，當質(zhì)量分數(shù)＞5%時，吸光度有所下降，所以將NaNO₂的質(zhì)量分數(shù)設為5%；Al(NO₃)₃質(zhì)量分數(shù)在2.5%~10%范圍內(nèi)吸光度呈現(xiàn)不斷上升趨勢，隨后隨質(zhì)量分數(shù)的增加，吸光度開始下降，固將質(zhì)量分數(shù)設為10%；NaOH質(zhì)量分數(shù)在1%~4%范圍內(nèi)吸光度逐漸增加，當質(zhì)量分數(shù)＞4%時，吸光度有所下降，故將質(zhì)量分數(shù)設為4%。結(jié)果見圖1。

2.2　提取溶劑質(zhì)量分數(shù)比較

取1g供試品，分別加30%，50%，70%和95%乙醇回流提取1h。紫外分光光度法中并未明確提取乙醇體積分數(shù)，通過表1可知，70%乙醇的提取效果最佳。

2.3　提取時間比較

取1g供試品，分別加70%乙醇回流提取0.5，1，1.5和2h。測定結(jié)果見表2。1h提取已較完全，在相同的時間內(nèi)，回流提取比超聲提取率高。紫外分光光度法中采用超聲提取，從表2可看出，回流提取較超聲提取來說提取得更加充分。

2.4　方法學驗證

2.4.1　線形關系考察

按1.2.1要求，測定結(jié)果見表3，繪制蘆丁質(zhì)量濃度（μg/mL）與吸光度的標準曲線如圖2。結(jié)果顯示，蘆丁的標準曲線方程為Y=0.0012X+0.0031，R2=0.9997。

2.4.2　精密度試驗

取6份同一樣品，按前述方法測定總黃酮含量，計算相對標準偏差。由表4可知，總黃酮吸光度的SRSD為2.05%，顯示精密度良好。

2.4.3　穩(wěn)定性試驗

取同一樣品，按前述方法測定總黃酮含量，每隔30min進行測定，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，顯色反應后應在30min內(nèi)進行測定。

2.4.4　重復性試驗

取同一樣品，按前述方法分別制備6份供試品溶液，測定總黃酮質(zhì)量分數(shù)。由表6可知，總黃酮平均質(zhì)量分數(shù)為3.83mg/g，SRSD為2.60%，表明該測定方法的重復性良好。

2.4.5　回收率試驗

稱取6份樣品，每份1g左右，分別加入5.0mg蘆丁標準品，按前述方法測定總黃酮質(zhì)量分數(shù)，計算回收率，結(jié)果見表7，蘆丁的平均回收率為99.1%。

2.4.6　專屬性試驗

精確吸取4mL標準品溶液、樣品溶液及空白樣品，按照1.2.3方法要求精確添加顯色劑后，分別在400~800nm波長下進行掃描，如圖3、圖4、圖5所示，在510nm處標準品、樣品溶液有相同的吸收峰，空白樣品在510nm下無吸收峰，表明測定方法對羅布麻茶種的總黃酮測定具有良好的專屬性。

2.4.7　耐用性試驗

考察被測溶液的質(zhì)量分數(shù)對測定結(jié)果的影響。由不同實驗人員進行操作，每人均取0.6，0.8，1.0，1.2和1.4g羅布麻粉末樣品，按照1.2.3方法進行操作，測得樣品溶液在510nm下的吸光度。從表8可以看出，隨著樣品質(zhì)量分數(shù)的增加，黃酮質(zhì)量分數(shù)總體呈上升趨勢。3組實驗人員檢測出的黃酮質(zhì)量分數(shù)的SRSD結(jié)果表明，試驗條件具有良好的適應性。

考察被測溶液的穩(wěn)定性對測定結(jié)果的影響。放置0min，10min，20min，30min，40min，50min，1h，3h，5h和7h后，按1.2.3方法測吸光度。由表9可知，待測溶液加入顯色劑后隨著時間的延長，吸光度整體呈下降趨勢，所以顯色后應在1h內(nèi)上機完成檢測，該方法選30min內(nèi)上機檢測。

考察樣品提取時間對測定結(jié)果的影響。準確稱取1g羅布麻茶試樣粉末，置具塞錐形瓶中，加入25mL70%乙醇，靜置后稱其質(zhì)量，分別回流20，40，60，80和100min，冷卻后，再稱其，剩下步驟同1.2.3“用70%乙醇補足質(zhì)量”后的方法，分別添加顯色劑后在510nm下測定吸光度，結(jié)果見表10。

2.5　樣品的測定

分別稱取不同批次的羅布麻茶粉末，各1g，按1.2.3小節(jié)的方法和《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003版）》保健食品中總黃酮的測定方法分別進行測定，計算其總黃酮質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表11^[18]。

結(jié)果顯示，2個方法測定的總黃酮質(zhì)量分數(shù)具有較大差異，基本在1.5倍左右。紫外分光光度法檢測的是黃酮類物質(zhì)特有的B環(huán)的肉桂?；Y(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)是黃酮物質(zhì)的主要活性部位，吸收峰在300~400nm之間，硝酸鋁顯色法檢測的是所有具有鄰二位酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，吸收峰在510nm左右。紫外分光光度法直接對樣品進行測定，具有一定的局限性，比較適合成分單一樣品的檢測，不能很好地代表羅布麻茶的品質(zhì)。因為羅布麻茶中具有降血壓、降血脂等保健功效成分物質(zhì)除黃酮類物質(zhì)外，還含有大量其他物質(zhì)，如羥基苯甲酸類、綠原酸等酚類，這些物質(zhì)用紫外分光光度法是檢測不出來的^[19]。

2.6　最低檢測限

按照1.2.3方法測定20次空白溶液的吸光度并計算檢測限，根據(jù)“檢測限（LOD）=3.3δ/S”計算。式中，δ表示被測液中黃酮質(zhì)量分數(shù)的標準偏差；S表示標準曲線的斜率。由表12可知，最低檢測線為4μg/mL。

3　結(jié)論及討論

3.1　討論

野生羅布麻（紅麻）于20世紀60年代在我國北緯33°~48°的鹽堿地域大量分布，由于人為破壞、環(huán)境惡化等原因，導致羅布麻（紅麻）至今在全國29個歷史分布區(qū)的邊緣地帶僅有零星殘存，只有全球距海岸最遠的新疆阿勒泰鹽湖東戈壁尚存82041m²，是我國當今該植物最大的野生群落，羅布麻（紅麻）已瀕臨滅絕。因此，2006年，“拯救羅布麻健康千萬家”工程被發(fā)起，以原生種大規(guī)模（1453hm²）仿生種植。現(xiàn)已成為羅布麻（紅麻）年產(chǎn)干葉高達1000t的產(chǎn)能基地，占我國羅布麻（紅麻）資源的90%^[20]。因此確定合適檢測方法，對羅布麻（紅麻）產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大的意義。

3.2　結(jié)論

試驗方法的線性方程為Y=0.0012X+0.0031，R2=0.9997，線性關系良好；精密度試驗SRSD為2.05%（n=6）；穩(wěn)定性試表明溶液配制好后應在30min內(nèi)上機比色；重復性試驗顯示SRSD為2.60%（n=6）；回收率試驗顯示回收率為99.1%（n=6）；專屬性試驗表明該測定方法對羅布麻茶種的總黃酮測定具有良好的專屬性；從被測溶液的質(zhì)量分數(shù)、不同檢測人員及環(huán)境、被測溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取時間方面討論了檢測方法的耐用性，結(jié)果表明所設定的測定條件能夠滿足測定的需要，測定方法系統(tǒng)適用性良好，方法的檢出限為4μg/mL。由此說明，用該方法測定羅布麻茶中的黃酮是可行的。

羅布麻茶用硝酸鋁顯色法進行總黃酮檢測，該方法簡便、準確、專屬性好，能夠更好地代表羅布麻茶的保健功效。

參考文獻：

[1] 郭潔, 賈伯陽, 張蓉, 等. 國產(chǎn)保健食品原料與功效/標志性成分分析[J]. 食品研究與開發(fā), 2018, 10(24): 218-224.

[2] 龐秀清, 馬瑩, 方燦, 等. 輔助降血脂類保健食品質(zhì)量現(xiàn)狀分析[J]. 食品安全導刊, 2017, 15(3): 146-148.

[3] FAN H J, LIANG Y, JIANG B, et al. Curcumin inhibits intracellular fatty acid synthase and induces apoptosis in human breast cancer MDA-MB-231 cells[J]. Oncology Reports, 2016, 18(35): 2651-2656.

[4] NIE F Y, LIANG Y, JIANG B, et al. Apoptotic effect of tannic acid on fatty acid synthase over-expressed human breast cancer cells[J]. Temor Biology, 2015, 27(10): 1007-1015.

[5] 張娟, 卿德剛, 孫宇, 等. 化學計量學輔助分析羅布麻中的黃酮類成分[J]. 西北藥學雜志, 2020, 35(2): 173-177. [6] 徐碩, 徐文峰, 鄺詠梅, 等. 一測多評法測定羅布麻葉中6個黃酮類成分的含量[J]. 藥物分析雜志, 2019, 18(7): 1217-1228.

[7] 于村, 俞莎, 沈向紅. 保健食品中總黃酮測定方法的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2002, 8(12): 401-402.

[8] 于村, 俞莎, 沈向紅. 中草藥總黃酮的提取和含量測定[J]. 浙江預防醫(yī)學, 2002, 14(7): 61-62.

[9] 劉維, 蒲朝文, 封雷, 等. 保健食品中總黃酮含量的分光光度測定法[J]. 職業(yè)與健康, 2005, 21(6): 839-840.

[10] 范華鋒, 趙士權(quán), 查河霞. 紫外分光光度法測定保健食品中總黃酮的方法改進[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2011, 21(4): 828-828.

[11] 張欣燁, 張利鋒, 張潔, 等. 紫外分光光度法在保健食品檢測中的應用[J]. 中國衛(wèi)生工程學, 2015, 14(8): 347-349.

[12] 李艷提, 趙金鳳, 張衛(wèi)民, 等. 羅布麻茶總黃酮含量測定方法研究[J]. 食品科技, 2010, 35(6): 274-277.

[13] 劉東平, 周亞球, 王先榮. 羅布麻葉總黃酮的測定方法探討[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2007, 18(6): 614-616.

[14] 范維剛, 解成喜, 李鋒, 等. 羅布麻茶總黃酮含量測定方法研究[J]. 食品科技, 2010, 35(6): 274-277.

[15] 李慕春, 王苗苗, 韓非, 等. 羅布麻和白麻中主要化學成分的統(tǒng)計分析[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2018, 24(2): 62-68.

[16] 賀靈芝, 李俊華, 梁忠厚. 黑老虎果皮中總黃酮提取工藝研究[J]. 衡陽師范學院學報, 2020, 3(1): 82-86.

[17] 廖圓圓, 王燕新, 郭曉農(nóng), 等. 枇杷葉總黃酮提取及體外抗氧化的研究[J]. 西北民族大學學報, 2020, 21(1): 60-64.

[18] 王光亞. 保健食品功效成分檢測方法[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2002: 29-31.

[19] 李維嘉, 黃璇瑩, 蔡大川, 等. 紫外分光光度法測定保健食品中總黃酮 (以蘆丁計) 的不確定度評估[J]. 食品安全導刊, 2015, 15(36): 161-165.

[20] 劉起棠, 肖正春, 張衛(wèi)明. 中國羅布麻2個新變種-戈寶紅麻、戈寶白麻[J]. 中國野生植物資源, 2015, 34(1): 40-42.

文章摘自：何偉,王莉,黃景鳳,劉磊,楊如鋼,黃升.羅布麻茶中總黃酮測定方法[J].食品工業(yè),2021,42(08):180-184.