摘  要：羅布麻中含有大量糖苷和苷元類黃酮成分，具有不同藥理活性和藥代動(dòng)力學(xué)行為，對(duì)其分級(jí)是闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要途徑。針對(duì)羅布麻中的黃酮類成分建立溶劑誘導(dǎo)相變（SIPT）分級(jí)方法，考察不同種類有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽作為誘導(dǎo)劑對(duì)羅布麻中糖苷和苷元分離行為的影響。當(dāng)V（乙腈）∶V（水）=1∶1時(shí)，加入體積分?jǐn)?shù)為25%三氯甲烷誘導(dǎo)分相后，水相中的主要峰經(jīng)液相色譜質(zhì)譜鑒定為糖苷類化合物。SIPT分級(jí)的機(jī)理是通過向乙腈水溶劑中加入小體積與水不溶的有機(jī)溶劑或鹽溶液，從而使原本與水互溶的乙腈相從水-有機(jī)溶劑混合相中實(shí)現(xiàn)萃取分離；而無機(jī)鹽參與萃取誘導(dǎo)的行為可以歸結(jié)為鹽析效應(yīng)。將SIPT應(yīng)用于漢麻中，加入體積分?jǐn)?shù)為15%三氯甲烷時(shí)，獲得了良好的分相效果，SIPT法較好地實(shí)現(xiàn)了麻類中黃酮苷和苷元的分級(jí)。

關(guān)鍵詞：羅布麻；溶劑誘導(dǎo)分相；黃酮；苷元；分級(jí)；液相色譜

 

中藥是中華民族瑰寶，在諸多疾病的治療過程中發(fā)揮著重要作用。中藥是一個(gè)復(fù)雜的體系，含有極多的化學(xué)成分，如皂苷類、黃酮類、多酚、萜類、甾類等^[1]，其中，羅布麻（Apocynum venetum L.）為夾竹桃科羅布麻屬植物?，F(xiàn)代藥理研究表明，羅布麻葉具有降血壓、降血脂、抗抑郁、增強(qiáng)免疫、抗衰老等作用^[2-3]。

羅布麻葉中含有黃酮類、脂肪酸類、萜類、甾醇類、有機(jī)酸和揮發(fā)性成分等重要的活性成分^[4]，主要藥效活性基礎(chǔ)成分為黃酮類、黃烷類及其黃酮苷類^[5]。大多數(shù)黃酮苷元在水中存在溶解性差、生物利用度低等問題，從而導(dǎo)致人體對(duì)黃酮類藥物吸收慢、藥效不顯著，極大地限制了臨床應(yīng)用^[6-7]，給黃酮類新藥的尋找與開發(fā)帶來相當(dāng)大的困難。黃酮類成分（包括糖苷及其苷元）具有不同藥理活性和藥代動(dòng)力學(xué)行為，因此對(duì)糖苷及苷元分級(jí)進(jìn)行研究是闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要途徑。漢麻、工業(yè)大麻等麻類植物中含有大麻二酚等活性成分，其中還含有蘆丁等^[8]黃酮類成分，這些成分對(duì)于大麻二酚等成分的純化造成了較大干擾，使純化工藝復(fù)雜，導(dǎo)致產(chǎn)物成本較高。此外，這些成分回收利用對(duì)于生物質(zhì)資源開發(fā)以及從副產(chǎn)物中生產(chǎn)高附加值藥物中間體等具有重大意義。

傳統(tǒng)的中藥化學(xué)分離方法包括：不同極性的溶劑提取、大孔樹脂分類脫色吸附提取、硅膠柱分級(jí)純化、高效液相色譜法純化等^[9-12]。常規(guī)提取的方法難以區(qū)分糖苷和苷元，柱色譜方法可以純化各個(gè)單體化合物，但這可能降低中藥的協(xié)同作用^[13]，且柱色譜方法成本較高。因此，如何快速有效地將糖苷和苷元分離是亟待解決的問題。溶劑誘導(dǎo)相變（Solvent-Induced Phase Transition，SIPT）是一種新的樣品預(yù)處理方法，類似于從人血漿中同時(shí)測定多拉司酮及其主要代謝產(chǎn)物羥多拉司酮的鹽誘導(dǎo)相分離提取法（Salt-Induced Phase Separation Extraction，SIPSE）^[14]。

糖苷和苷元存在極性差異，在水中和有機(jī)相中的溶解度有所不同。水和乙腈原本是互溶的溶劑，當(dāng)引入特定的無機(jī)鹽、糖、非極性溶劑，可以產(chǎn)生相變分層，具有能夠區(qū)分糖苷和苷元的潛力^[14]，因此，本文以羅布麻和漢麻為樣品，考察合適的溶劑誘導(dǎo)相變條件，進(jìn)而開發(fā)羅布麻中糖苷和苷元的分級(jí)方法，為羅布麻中藥效成分的活性評(píng)價(jià)和生物醫(yī)藥開發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

羅布麻，蘇州當(dāng)?shù)厮幉牡?；漢麻，齊齊哈爾大學(xué)黑龍江省工業(yè)大麻加工技術(shù)創(chuàng)新中心。甲醇、乙醇，分析純，上海泰坦科技股份有限公司；三氯甲烷、二氯甲烷、正丁醇，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉，純度≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

Waters2965高效液相色譜儀配置2996DAD檢測器、Empower色譜工作站，美國Waters公司；RE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義予華儀器廠；Expert-18k臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南吉爾森科技發(fā)展股份有限公司；KQ500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 樣品預(yù)處理

將采集的羅布麻葉放入50℃烘箱中烘干60min，烘干后使用粉碎機(jī)粉碎，過100目篩網(wǎng)，稱取50g羅布麻粉末，加入500mL乙醇溶液，超聲30min，超聲功率為150W。提取后減壓抽濾得到乙醇提取液，對(duì)乙醇提取液旋蒸濃縮，噴霧干燥后結(jié)塊得到羅布麻醇提物備用。稱取6.0g羅布麻醇提物，加入120mL乙腈水溶劑（體積比1∶1），超聲萃取30min，離心8000r/min，10min，取上清液4.0mL，分別加入0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL誘導(dǎo)劑，反復(fù)顛倒混勻后，離心6000r/min，10min后觀察分層情況，分別測定水相和有機(jī)相中的總糖苷含量，以峰面積比計(jì)算糖苷回收率。

1.4 HPLC色譜條件

色譜柱：MultohypODS-5μm，4.6mm×250mm，德國CS色譜服務(wù)有限公司；流動(dòng)相：A.水，B.乙腈；梯度程序：0～15min，5%B～65%B；16～30min，65%B～95%B；流速：1mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：265nm；進(jìn)樣量：10μL。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑誘導(dǎo)分相的溶劑考察

本文考察三氯甲烷、二氯甲烷和乙酸乙酯作為誘導(dǎo)劑對(duì)水和乙腈提取的羅布麻溶液進(jìn)行誘導(dǎo)分相，對(duì)分相后的有機(jī)相和水相分別取樣進(jìn)行液相色譜分析，結(jié)果如圖1～3所示。羅布麻成分復(fù)雜，水相和有機(jī)相中均含有較多的色譜峰，由圖1,2可知，水相和有機(jī)相中有部分重疊峰，說明誘導(dǎo)分相未呈現(xiàn)理想的糖苷及苷元分級(jí)效果。糖苷在反相C18柱上的保留相對(duì)弱于苷元，良好的分相應(yīng)呈現(xiàn)不同的譜圖，如圖1,2所示，水相層弱保留的峰相對(duì)較多，而有機(jī)相層的色譜峰相對(duì)較長的保留時(shí)間，可以判斷初步具備了分離糖苷和苷元的效果。3種不同誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)效果不盡相同，并且由于誘導(dǎo)劑加入量不同導(dǎo)致分相效果也不同，保留時(shí)間在18min前的峰主要存在于水相中，當(dāng)二氯甲烷和三氯甲烷作為誘導(dǎo)劑時(shí)，水相中該峰的峰高明顯大于有機(jī)相中，說明這兩種誘導(dǎo)劑具有更好的誘導(dǎo)分相效果，其中三氯甲烷優(yōu)于二氯甲烷。

  

圖1 三氯甲烷體積對(duì)分相效果的影響

  

圖2 二氯甲烷體積對(duì)分相效果的影響

  

圖3 乙酸乙酯體積對(duì)分相效果的影響

本文系統(tǒng)探討了三氯甲烷和二氯甲烷兩種有機(jī)溶劑及不同添加量對(duì)分相效果的影響。分層后，分別采集水相和有機(jī)相樣本，并進(jìn)樣至液相色譜儀進(jìn)行分析。以糖苷類化合物的總峰面積作為評(píng)估指標(biāo)，量化評(píng)估不同誘導(dǎo)劑類型及添加量對(duì)分相效果的影響，結(jié)果如表1所示。由表1可知，隨著誘導(dǎo)劑體積分?jǐn)?shù)從5%增加到25%，水相中糖苷類化合物占總糖苷的比例逐漸增加，因誘導(dǎo)劑體積分?jǐn)?shù)超過30%導(dǎo)致后續(xù)去除困難，本文誘導(dǎo)劑添加量為25%，此時(shí)回收率分別為98.47%（三氯甲烷）和97.73%（二氯甲烷）。誘導(dǎo)劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)糖苷類化合物水相回收率的影響趨勢如圖4(a)所示。此外，乙腈-水提取體系中乙腈和水體積比也影響糖苷和苷元的分離效果。以25%三氯甲烷為誘導(dǎo)劑，考察乙腈-水體積比對(duì)糖苷回收率的影響，結(jié)果如圖4(b)所示。由圖4(b)可知，乙腈體積分?jǐn)?shù)從40%增加到80%的過程中，糖苷的回收率出現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象，當(dāng)乙腈和水體積比為1∶1時(shí)，糖苷的回收率最大。

表1 誘導(dǎo)劑種類和用量對(duì)回收率的影響

  

  

圖4 誘導(dǎo)劑及乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)糖苷回收率的影響

以氯化鈉為誘導(dǎo)劑，氯化鈉加入量為0.2,0.6g，誘導(dǎo)分相結(jié)果如圖5所示。從保留時(shí)間為18min左右的峰在水相和有機(jī)相中來看，氯化鈉作為誘導(dǎo)劑分相時(shí)，該峰在水相和有機(jī)相中峰高差異不大，說明氯化鈉誘導(dǎo)分相對(duì)羅布麻無分級(jí)效果。

  

圖5 不同添加量的氯化鈉誘導(dǎo)分相對(duì)羅布麻中黃酮類成分的分級(jí)效果

通過鹽析或者無機(jī)誘導(dǎo)劑改善萃取分離的方法已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用^[15-18]，這主要取決于采用的萃取體系以及需要分離的物質(zhì)對(duì)結(jié)構(gòu)。由圖1～3,5可知，與有機(jī)萃取誘導(dǎo)劑相比，無機(jī)誘導(dǎo)劑的效果明顯不如有機(jī)誘導(dǎo)劑。這是由本文研究體系中分離的糖苷和苷類兩類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)決定的。糖苷中含有糖基和苷元，糖基具有較強(qiáng)的親水性，而苷元的疏水性更強(qiáng)，盡管無機(jī)鹽可以通過鹽析將水和有機(jī)溶劑分層，但相對(duì)而言，糖苷在水中溶解度能力增加，有機(jī)相對(duì)于苷的溶解能力改善有限，因此效果不明顯。

2.2 溶劑誘導(dǎo)分相對(duì)羅布麻黃酮分級(jí)的優(yōu)化條件及結(jié)果

經(jīng)過溶劑誘導(dǎo)分相條件考察，確定羅布麻葉中黃酮類成分提取-分級(jí)的最佳條件為：6.0g羅布麻醇提物粉末，加入120mL溶劑，V（乙腈）∶V（水）=1∶1，超聲溶解30min，離心4500r/min，10min，取上清液加入體積分?jǐn)?shù)為25%三氯甲烷進(jìn)行誘導(dǎo)分相，水相層含較多的糖苷類物質(zhì)。對(duì)水相層中的糖苷類進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜（LC-QTOF/MS）定性檢測，確定主要組分如圖6所示。由此可見，誘導(dǎo)分相后，水相中的主要峰為糖苷類化合物。溶劑誘導(dǎo)分相法較好地實(shí)現(xiàn)了對(duì)羅布麻中黃酮苷和苷元的分級(jí)，為該類成分的藥學(xué)活性評(píng)價(jià)和生物醫(yī)藥開發(fā)，以及對(duì)糖苷類成分的分離純化等奠定良好基礎(chǔ)。

  

圖6 優(yōu)化的溶劑誘導(dǎo)分相后水相和有機(jī)相羅布麻的LC-MS

注：1.綠原酸，2.白麻苷，3.異槲皮苷，4.金絲桃苷，5.槲皮素-3-(6''-丙二?；?-葡萄糖苷，6.山奈酚-3-葡萄糖苷，7.槲皮素3-(6''-乙酰葡糖苷)。

2.3 溶劑誘導(dǎo)分相對(duì)羅布麻中黃酮苷和苷元分級(jí)的機(jī)理

有機(jī)溶劑作為誘導(dǎo)劑的萃取體系，小體積的誘導(dǎo)劑與有機(jī)溶劑形成新的有機(jī)相，新有機(jī)相與水相分層，

實(shí)現(xiàn)相分離，進(jìn)而達(dá)到萃取的目的。無機(jī)鹽參與萃取誘導(dǎo)的行為可以歸結(jié)為鹽析效應(yīng)^[15-18]。通過在體系中加入不同種類的鹽，改變有機(jī)溶劑在水中的溶解度，直到實(shí)現(xiàn)分層，達(dá)到萃取的效果。本文分別采用無機(jī)和有機(jī)誘導(dǎo)劑在不同分離體系中的行為進(jìn)行研究，初步闡明了誘導(dǎo)劑結(jié)構(gòu)等對(duì)分離結(jié)果的影響，進(jìn)一步拓展應(yīng)用范圍。

2.4 溶劑誘導(dǎo)分相對(duì)漢麻黃酮的分級(jí)結(jié)果

本文利用溶劑誘導(dǎo)相變法對(duì)漢麻中的成分進(jìn)行分級(jí)探索，考察不同有機(jī)溶劑（三氯甲烷、二氯甲烷和正丁醇）和乙腈-水體積比對(duì)分相的影響，其中，二氯甲烷和正丁醇未出現(xiàn)分相現(xiàn)象，乙腈-水體積比對(duì)三氯甲烷誘導(dǎo)分相影響不大。此外，樣品類型對(duì)于誘導(dǎo)分相體系有一定選擇性。對(duì)于漢麻，少量三氯甲烷即可達(dá)到良好的分相效果，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)V（乙腈）∶V（水）=1∶1時(shí)，15%三氯甲烷誘導(dǎo)體系下，大部分組分出現(xiàn)在水相層，為糖苷類成分。因漢麻化學(xué)成分研究較少，市售對(duì)照品少等局限，本文未作進(jìn)一步鑒定。

  

圖7 三氯甲烷誘導(dǎo)分相對(duì)漢麻中化學(xué)成分的分級(jí)效果

綜上，有機(jī)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)有機(jī)溶劑的分層，這一現(xiàn)象可以理解為少量有機(jī)誘導(dǎo)劑將大量有機(jī)溶劑從水有機(jī)溶劑混合相中萃取出來，形成新的有機(jī)相，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)目標(biāo)組分的分離。相較于萃取溶劑，誘導(dǎo)劑的疏水性更強(qiáng)，在本文中更容易使苷從有機(jī)相中分離。

 

3 結(jié)論

本文探索了羅布麻葉中黃酮類化合物糖苷與苷元的分級(jí)方法，通過向乙腈-水溶液體系中加入三氯甲烷誘導(dǎo)分相實(shí)現(xiàn)在水相中富集糖苷的方法。乙腈與水的體積比影響糖苷的回收率，在乙腈體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，糖苷回收率較高；在所考察的二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯3種有機(jī)誘導(dǎo)劑和氯化鈉無機(jī)誘導(dǎo)劑中，三氯甲烷添加量為25%時(shí)，糖苷回收率較高，達(dá)98.47%，在羅布麻和漢麻黃酮苷與苷元的分級(jí)中達(dá)到較好的效果。此外，本文從物理化學(xué)層面探討了有機(jī)與無機(jī)誘導(dǎo)劑分相的機(jī)理，為拓展溶劑誘導(dǎo)分相的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

 

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文章摘自：王子梵,姚振,初紅濤,等.基于溶劑誘導(dǎo)相變萃取法麻類植物中糖苷與苷元的分級(jí)研究[J/OL].齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2025,(01):2-7[2025-02-10].