摘 要：工業(yè)大麻(Cannabis sativa)是一種重要經(jīng)濟(jì)作物，其種子萌發(fā)階段易遭受干旱脅迫，最終對生長和產(chǎn)量造成不利影響。NAC基因是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物應(yīng)對非生物脅迫方面起著重要作用。本研究基于前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用RT-PCR方法，從工業(yè)大麻品種'云麻1號(hào)'中分離克隆出了1個(gè)NAC類基因，命名為CsNAC62(GenBank No. XM＿030652694)。序列分析發(fā)現(xiàn)，CsNAC62基因CDS大小為1260bp，編碼419個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量48.32kD，等電點(diǎn)為8.24。CsNAC62蛋白的N端含有150～160個(gè)氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成，是NAM/NAC類基因家族典型的保守結(jié)構(gòu)域。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，CsNAC62由25.19%的α-螺旋、17.29%的延伸鏈和57.52%的不規(guī)則卷曲組成。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，工業(yè)大麻CsNAC62與桃樹(Prunus persica) NAC3的關(guān)系最近。'云麻1號(hào)'萌發(fā)種子中的CsNAC62基因隨著干旱脅迫處理(PEG-6000模擬)時(shí)間的延長，其表達(dá)量也逐步增加，萌發(fā)7 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大。而在正常萌發(fā)的種子(對照)中，CsNAC62的表達(dá)量則上升緩慢，表明CsNAC62基因受干旱誘導(dǎo)表達(dá)。本研究初步揭示了CsNAC62基因在PEG模擬干旱脅迫下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步探究其參與工業(yè)大麻干旱脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制提供參考。
關(guān)鍵詞：工業(yè)大麻；NAC轉(zhuǎn)錄因子；干旱脅迫；生物信息學(xué)分析；表達(dá)模式
大麻(Cannabis sativa)隸屬于大麻科(Cannaba‐ceae)大麻屬(熊和平,2008)，工業(yè)大麻指的是四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol,THC)含量低于0.3%的大麻品種類型(盧延旭等,2007)。工業(yè)大麻有著相當(dāng)高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，具有鎮(zhèn)痛、抗癲癇等藥用價(jià)值(Boehnke et al.,2021)，是紡織、繩索制品等的原材料(趙越等,2021)，還可開發(fā)無毒涂料、化妝品等(盧延旭等,2007)，其種子還可用于食品加工業(yè)(Zhao et al.,2022)。工業(yè)大麻在生長過程中(尤其是種子萌發(fā)階段)常受到干旱的脅迫，引起形態(tài)、生理生化和基因表達(dá)等變化，這些變化會(huì)對植株的生長和發(fā)育造成不利影響(石汝杰,胡廷章,2009)。培育具有抗性的大麻種質(zhì)是解決干旱脅迫的有效辦法，而挖掘工業(yè)大麻干旱脅迫的抗性基因可以為抗性品種的選育提供參考。
轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用，其作用原理主要是結(jié)合順式調(diào)控元件，對靶基因的表達(dá)進(jìn)行激活(或抑制)，進(jìn)一步對不同的信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控。植物轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，可以根據(jù)靶基因啟動(dòng)子中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不同分為58個(gè)家族(靳進(jìn)樸等,2015)，其中NAC是植物所特有且最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。目前，在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、歐洲油菜(Brassica napus)、白菜(Brassica rapa)、本氏煙草(Nicotiana benthamiana)、蘿卜(Raphanus sativus)、毛果楊(Populus trichocarpa)、大豆(Glycine max)等植物中均有多個(gè)NAC基因被鑒定(馬雪祺等,2021)。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對干旱脅迫中具有重要作用，Li等(2022b)對Dc NAC基因進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，Dc NAC6、Dc NAC18、Dc NAC29、Dc NAC44、Dc NAC51(主要在根中)和Dc NAC16、Dc NAC64 (主要在葉中)是鐵皮石斛(Dendrobium officinale)抗旱候選基因。同時(shí)研究表明，NAC基因也是植物生長和調(diào)節(jié)脅迫信號(hào)的控制開關(guān)，為作物適應(yīng)復(fù)雜的脅迫環(huán)境提供幫助(Saidi et al.,2022)。此外，工業(yè)大麻Cs NAC1和Cs NAC3的過量表達(dá)，還能顯著提高煙草(Nicotiana tabacum)植株的耐鹽性(胡華冉,2019)。綜上，深入研究NACs轉(zhuǎn)錄因子，對揭示植物響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)制具有著重要的理論價(jià)值。
本研究以工業(yè)大麻品種'云麻1號(hào)'為研究對象，在前期干旱脅迫處理的轉(zhuǎn)錄組測序基礎(chǔ)上，克隆出差異表達(dá)基因Cs NAC62，運(yùn)用相關(guān)軟件對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過q RT-PCR技術(shù)研究其響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)模式，以上研究結(jié)果將為后續(xù)Cs NAC62基因在工業(yè)大麻抗旱中的功能鑒定提供參考。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
本研究所用工業(yè)大麻(Cannabis sativa)'云麻1號(hào)'種子由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。
1.2 處理方法
挑選大小、外形一致的種子，使用70%酒精消毒，蒸餾水沖洗干凈并晾干備用。隨機(jī)挑選30粒種子，均勻擺放于9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，正常萌發(fā)處理加入蒸餾水9mL，干旱脅迫處理加入20%聚乙二醇6000(PEG 6000)溶液9mL。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)3d后；于光照12h，溫度25℃，黑暗12h，溫度20℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4d。在培養(yǎng)1、3、4、7d時(shí)取萌發(fā)種子或幼苗，每組每個(gè)時(shí)間段不同處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣后放至液氮中速凍，于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/font>
1.3 基因克隆
提取'云麻1號(hào)'不同處理以及不同萌發(fā)時(shí)間(1,3,4和7d)的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。RNA提取和反轉(zhuǎn)錄分別使用Hi Pure Plant RNA Mini Kit(廣州美基生物科技有限公司)和Mon Script™RTIII Super Mix with ds DNase (Two-Step)試劑盒(莫納(云南)生物科技有限公司,昆明)進(jìn)行?；诒菊n題組前期轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，使用Primer Pre‐mier 5.0軟件設(shè)計(jì)NAC62基因的引物。以上述cDNA為模板，利用康為世紀(jì)(泰州) 2×Es Taq Master‐Mix (Dye)進(jìn)行目的基因ORF的擴(kuò)增。其中，引物合成委托昆明擎科生物科技有限公司進(jìn)行(表1)。
RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系共25μL:2×Es Taq Mas‐ter Mix (Dye) 12.5μL、10μmol/L的正反向引物各1μL、cDNA 1μL和dd H2O9.5μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 2min；變性94℃ 30s，退火58℃ 1min，延伸72℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)；延伸72℃ 2min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將其送至昆明擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果通過Snap Gene軟件與前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。
1.4 生物信息學(xué)分析
首先，利用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測開放閱讀框，利用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對，使用Prot Param (https://web.expasy.org/prot‐param/)進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，使用Inter Pro(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，使用SOPMA (https://npsa.lyon.inserm.fr/cgibin/npsa＿automat.pl?page=/NPSA/npsa＿sopma.html)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)分別對其蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析。然后，通過DNAMAN 6.0軟件對NAC62的同源氨基酸序列進(jìn)行比對，利用MEGA 11.0構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.5 基因表達(dá)分析
q PCR檢測利用Applied Biosystems Quant Stu‐dio 7 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行。內(nèi)參基因?yàn)檎婧似鹗家蜃?/font>4E (eukaryotic initiation factor 4E,e IF4E)，反應(yīng)體系共20μL:2×Mon AmpTMSYBR Green q PCR Mix 10μL、20μmol/L的正、反向引物各0.4μL、c DNA模板1μL、Nuclease-Free Water8.2μL。q PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃30 s；變性95℃10 s，退火60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)所用引物(表1)由Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)，由昆明擎科生物科技有限公司合成。
1.6 統(tǒng)計(jì)分析
Cs NAC62基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和作圖分別通過Excel 2021和Graph Pad Prim 9軟件進(jìn)行。
2 結(jié)果與分析
2.1 目的基因的克隆
提取的工業(yè)大麻總RNA經(jīng)瓊脂糖電泳檢測出現(xiàn)3條帶，結(jié)果顯示，28S、18S條帶較亮，5S條帶最弱(圖1A)。通過Nano Drop 2000c儀器檢測發(fā)現(xiàn)，本次RNA樣品的OD值(A260/A280吸光度比值)均在1.8至2.1之間。
經(jīng)PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測觀察，獲得的片段符合目的基因的預(yù)期大小(圖1B)。膠回收后送昆明擎科生物科技有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)Snap‐Gene軟件比對后，認(rèn)為與目的基因的ORF序列一致。經(jīng)前期分析認(rèn)為該基因?qū)儆谥参?/font>NAC類轉(zhuǎn)錄因子家族成員，根據(jù)其在染色體上的位置命名為Cs NAC62 (Gen Bank No.XM＿030652694)。
表1 本研究中的引物序列及用途基因
2.2 ORF序列分析
通過BLAST和ORFfinder對Cs NAC62基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因序列全長1643bp，具有完整的ORF框，CDS為1260bp，編碼419個(gè)氨基酸。采用NCBI在線軟件對該基因的保守序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明Cs NAC62具有NAC蛋白(圖2)。
2.3 生物信息學(xué)分析
運(yùn)用Protparam在線軟件對Cs NAC62基因編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，Cs NAC62基因編碼蛋白的分子式為C2120H3254N602O661S18，理論分子量為48.32 k D；有41個(gè)帶正電荷殘基(Arg+Lys),38個(gè)帶負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)，理論等電點(diǎn)8.24；不穩(wěn)定指數(shù)大于40(Ⅱ=61.08)，親水性平均值等于-0.878。
運(yùn)用SOPMA在線網(wǎng)站對Cs NAC62基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(圖3A)，該蛋白由α-螺旋、延伸鏈和不規(guī)則卷曲組成，分別占比25.19%、17.29%和57.52%。Cs NAC62編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)通過SWISS-MODEL在線網(wǎng)站采用同源建模法進(jìn)行預(yù)測(圖3B)，結(jié)果顯示全局模型質(zhì)量估計(jì)(global model quality estimation,GMQE)值為0.26。
經(jīng)過Inter Pro網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，工業(yè)大麻Cs‐NAC62蛋白N端含有150～160個(gè)氨基酸殘基組成的NAC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是NAM/NAC類基因家族典型的保守區(qū)域(圖4)。利用DNAMAN 6.0軟件對工業(yè)大麻Cs NAC62以及其他10種植物的NAC基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行多序列比對分析，該保守結(jié)構(gòu)域含有A、B、C、D和E五個(gè)子結(jié)構(gòu)域(圖4)。運(yùn)用MEGA 11.0軟件對工業(yè)大麻Cs NAC62和桃樹(Prunus persica)、普通小麥(Triticum aestivum)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、毛果楊(Populus trichocarpa)、大豆(Glycine max)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、芝麻(Sesamum indicum)、'日本晴'水稻(Oryza sativa ssp.japonica Group)、煙草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、大麻(Cannabis sativa)的NAC蛋白序列以及甘蔗雜交種(Saccharum hybrid cultivar)、擬南芥NAC亞類蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖5)，發(fā)現(xiàn)Cs NAC62蛋白與桃樹NAC3蛋白關(guān)系最近。
圖1 工業(yè)大麻總RNA (A)和目的基因PCR擴(kuò)增(B)的凝膠電泳
A.1～8:RNA樣品。B.1:Cs NAC62;M:DL2000 DNA Marker
圖2 工業(yè)大麻Cs NAC62基因保守序列分析
圖3 工業(yè)大麻Cs NAC62蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)預(yù)測
2.4 基因表達(dá)模式分析
利用q RT-PCR技術(shù)分析Cs NAC62基因在正常條件和PEG-6000處理后工業(yè)大麻種子萌發(fā)中的表達(dá)模式。結(jié)果(圖6)表明，在PEG-6000模擬干旱脅迫處理的種子中，Cs NAC62基因的相對表達(dá)量隨著PEG處理時(shí)間的延長而逐漸增加，4d時(shí)其相對表達(dá)量迅速升高，7d時(shí)達(dá)到最高。在對照組(正常萌發(fā))中，Cs NAC62的表達(dá)量增加緩慢，且在第4～7天時(shí)，處理組基因的相對表達(dá)量為對照組數(shù)倍。表明Cs NAC62基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)中受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。
圖4 工業(yè)大麻Cs NAC62與其他物種同源蛋白氨基酸序列比對
A～E：蛋白質(zhì)亞結(jié)構(gòu)域
3 討論
植物NAC類轉(zhuǎn)錄因子基因家族是植物特有的基因家族之一，其中N端結(jié)構(gòu)域相對保守，由A、B、C、D、E五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成，與核定位及DNA序列的識(shí)別和結(jié)合相關(guān)，C端結(jié)構(gòu)域序列多變，具有轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制作用，C端也決定了NAC蛋白功能的多樣化。本研究通過軟件分析發(fā)現(xiàn)，CsNAC62基因所編碼的蛋白質(zhì)在N末端含有植物NAC類轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)化分析表明Cs NAC62屬于NAM亞家族(Aida et al.,1997)。
NAC類轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)非生物脅迫等方面發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用(Wang et al.,2009)。豇豆(Vigna unguiculata) NAC1/NAC2轉(zhuǎn)錄因子通過
圖6 干旱脅迫下Cs NAC62基因在工業(yè)大麻萌發(fā)種子中的表達(dá)量分析
內(nèi)參基因：e IF4E;n=3；對照組：正常萌發(fā)；PEG-6000：干旱脅迫；ns：無顯著差異；****：差異極其顯著(P<0.0001)
圖5 工業(yè)大麻Cs NAC62與其他物種的NAC系統(tǒng)進(jìn)化樹
光合和抗氧化機(jī)制的共同激活提高轉(zhuǎn)基因豇豆的生長和耐旱耐熱性(Srivastava et al.,2022)；與野生型植株相比，大豆(Glycine max)的Gm NAC12基因在干旱脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)10倍以上，存活率提高了57%以上(Yang et al.,2022);Zm NACP、Zm‐NAC19、Zm NAC4、Zm JUB1和Zm NAC87是玉米(Zea mays) 5個(gè)響應(yīng)干旱脅迫的NAC家族成員，這5個(gè)NAC成員的過表達(dá)顯著提高了植株的干旱脅迫耐受性(Ding et al.,2023);Rc NAC091降低了月季(Rosa chinensis)的脫水耐性，其對脫水應(yīng)激反應(yīng)具有正向調(diào)節(jié)作用(Geng et al.,2022)；珍珠谷子(Pennisetum glaucum)基因組含有151個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，可分為11類，在這些基因中有的被干旱脅迫所上調(diào)，有的下調(diào)，因此Pg NACs的表達(dá)有助于珍珠谷子建立耐逆性(Dudhate et al.,2021);ONAC066是水稻(Oryza sativa)干旱應(yīng)激耐受性的正調(diào)控因子，在轉(zhuǎn)基因水稻中過表達(dá)ONAC066提高了干旱脅迫耐受性，增加了ABA敏感性，同時(shí)降低了干旱脅迫下的失水率，增加了脯氨酸和可溶性糖含量，減少了活性氧(ROS)的積累，上調(diào)了脅迫相關(guān)基因的表達(dá)(Yuan et al.,2019);Nt NAC053基因編碼一個(gè)新的NAC轉(zhuǎn)錄因子，可以通過激發(fā)煙草下游的逆境響應(yīng)基因和抗氧化系統(tǒng)來賦予煙草對干旱脅迫的耐受性(Li et al.,2022a)。本研究結(jié)果表明，工業(yè)大麻CsNAC62基因在PEG-6000處理中顯著上調(diào)表達(dá)，且隨著處理時(shí)間的增長，其相對表達(dá)量也在逐步增加，在第4～7d時(shí)，處理組基因的相對表達(dá)量為對照組數(shù)倍，推測Cs NAC62基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。雖然，大麻的基因組測序已經(jīng)完成(Cai et al,2021)，但是，Cs NAC62轉(zhuǎn)錄因子是通過何種信號(hào)途徑從而調(diào)控工業(yè)大麻響應(yīng)干旱脅迫的，仍需要深入研究。
4 結(jié)論
本研究克隆得到工業(yè)大麻Cs NAC62基因，其CDS區(qū)的全長為1 260 bp，共編碼419個(gè)氨基酸；通過同源基因比對發(fā)現(xiàn)，Cs NAC62蛋白同桃樹NAC3蛋白關(guān)系最近。在工業(yè)大麻種子萌發(fā)過程中，隨著干旱處理時(shí)間的延長，Cs NAC62表達(dá)量也逐步增加，7 d時(shí)達(dá)到最大；對照組中，其表達(dá)量上升緩慢，推測工業(yè)大麻Cs NAC62基因與干旱脅迫密切相關(guān)。本研究對于研究工業(yè)大麻Cs NAC62基因參與干旱脅迫應(yīng)答提供了數(shù)據(jù)。
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文章摘自：楊宇蕾,張涵雪,王珊珊等. 轉(zhuǎn)錄因子NAC62在工業(yè)大麻中的克隆、生信分析及其干旱脅迫響應(yīng)分析 [J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2024, 32 (01): 107-114.
