關(guān)鍵詞：羅布麻；多糖；提取方法；結(jié)構(gòu)表征；抗氧化活性

羅布麻（Apocynum venetum L.）為夾竹桃科植物羅布麻的葉，收載于《中國藥典》2020年第一部，其具有清熱平肝，利水消腫的功效，主治高血壓，眩暈，頭痛，心悸，失眠，水腫尿少^[1]。羅布麻分布于歐洲及亞洲溫帶地區(qū)，在我國分布于新疆、青海、甘肅、陜西、山西、河南等省區(qū)，主要生在鹽堿荒地和沙漠邊緣及河流兩岸、沖積平原、河泊周圍及戈壁荒灘上^[2]。羅布麻葉富含黃酮、有機酸、多糖、蛋白質(zhì)、多酚及礦物質(zhì)等多種成分^[3-5]?，F(xiàn)代藥理學研究已證實羅布麻葉具有降壓、降脂、降糖、抑菌、抗氧化、抗抑郁、抗動脈粥樣硬化、保肝、調(diào)節(jié)腸道菌群及提高免疫力等功效^[6-9]。多糖為羅布麻葉的主要生物活性成分之一，Wang等^[10]通過水提法及分離純化從羅布麻花中得到了兩種分子量為7kDa和9kDa的具有抗凝血作用的多糖。Liu等^[11]從羅布麻根中分離得到了一種具有抗炎活性的中性多糖。Yuan等^[12]報道富含多糖的羅布麻葉提取物顯出較強的降糖、降血壓及調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。Chen等^[13]從羅布麻茶殘渣中分離得到了具有強乳化性能的多糖。鄭思睿等^[14]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了羅布麻葉多糖提取工藝，當提取溫度91℃、時間1.75h、料液比1:82（g/mL）的條件下提取率為1.86%。研究表明作為入藥部位的羅布麻葉，有關(guān)其多糖的相關(guān)研究僅限于其提取及活性篩選等。

多糖在自然界分布極廣，隨著多糖各類功能的逐漸挖掘，其廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化妝品等領(lǐng)域；因其多種藥理活性及功能特性，近些年來受到研究者們的廣泛關(guān)注^[15-17]。多糖的提取方面?zhèn)鹘y(tǒng)的熱水提取法逐漸被超聲輔助提取法、微波輔助提取法及酶提取法等新型提取方法取代。超聲輔助提取法利用超聲波的空化作用破壞細胞壁，從而加快多糖的析出；微波輔助提取法因其穿透力強、加熱效率高等優(yōu)點影響多糖的提??；酶提取法利用酶的專一性對多糖進行提取。新型輔助提取法克服了熱水提取法耗時長、提取效率低等缺點，且對多糖的結(jié)構(gòu)及生物活性的影響較為顯著。Jing等^[18]探究不同提取方法對黃精多糖的影響，得出堿提多糖因分子量高而顯出較好的流變特性，酶解法及凍融法所得多糖因小分子量而顯出較好的降脂活性。Tang等^[19]報道不同方法提取的火龍果多糖提取率在3.78%-7.25%，含量、單糖組成及分子量差距較大。白冰瑤等^[20]比較不同提取方法對恰瑪古多糖的生物活性的影響，得出超聲輔助提取多糖生物活性優(yōu)于其他方法。不同的植物多糖因自身的理化性質(zhì)的差異最合適的提取方法也不同，決定著其應(yīng)用的空間。因此，研究不同提取方法對多糖結(jié)構(gòu)及活性的影響對于其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用方面具有深遠的意義。本文選擇藥效豐富的羅布麻葉為研究對象也為植物多糖的研究拓寬了領(lǐng)域。

多糖的提取為其分離分析、活性及產(chǎn)品研發(fā)的第一步，因此利用結(jié)構(gòu)表征及活性評價，結(jié)合不同方法自身優(yōu)缺點來篩選適合于羅布麻葉多糖的最優(yōu)提取方法是本研究的主要目的。本文以羅布麻葉為研究對象，通過熱水提法（Hot water extraction，HWE）、超聲輔助提取法（Ultrasoundassisted extraction，UE）、酶提取法（Cellulase-assisted extraction，CE和Pectinase-assisted extraction，PE）及超聲微波協(xié)同提取法（Ultrasound-Microwave assisted extraction，UME）等制備羅布麻葉多糖（Apocynum venetum Polysaccharide，AVP）。通過紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、氣相色譜、掃描電鏡-X-射線能譜、剛果紅實驗等波譜學、色譜學及經(jīng)典化學方法對羅布麻葉多糖結(jié)構(gòu)進行表征。進一步利用自由基清除能力、總還原能力及亞鐵離子螯合能力等評價抗氧化活性，并進行對比研究，從而篩選出適合于羅布麻葉多糖提取的最適方法。本文目的在于為羅布麻葉多糖的進一步提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性等提供實驗基礎(chǔ)，通過本文的實施，為羅布麻葉資源的充分利用和科學應(yīng)用提供技術(shù)支撐。 

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅布麻葉（Apocynum venetum L.）購買于藥材市場，產(chǎn)于新疆阿勒泰。纖維素酶（10000U/g，從里氏木霉所得，最適pH為7）、果膠酶（500U/mg，從黑曲霉所得，最適pH為5），各單糖標準品均為分析純購買于上海阿達瑪斯試劑有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼、2,6-二叔丁基對甲酚、菲啰嗪-鈉鹽、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽均為分析純購買于上海源葉生物科技有限公司；石油醚、無水乙醇、甲醇、乙酸酐、吡啶、水楊酸、氯化亞鐵、氫氧化鈉、鹽酸羥胺等均為分析純購買于天津市鑫鉑特化工有限公司；三氟乙酸，分析純，購買于廣州科檬生物科技有限公司；剛果紅、硫酸亞鐵、過氧化氫均為分析純購買于天津市致遠化學試劑有限公司廠。 

1.2 實驗方法

1.2.1 羅布麻葉的預(yù)處理

將羅布麻葉烘干進行粉碎處理，過100目篩。將粉碎后的羅布麻葉粉末按照溶劑和粉末1:5g/mL比例加入石油醚，進行脫脂處理，重復(fù)三次，使粉末風干后進行脫色處理，按料液比1:5g/mL加入85%乙醇溶液，90℃回流2h，進行抽濾，重復(fù)至乙醇層顏色較淡后自然風干備用。

1.2.2 羅布麻葉多糖的提取

1.2.2.1 熱水提取法

稱取羅布麻葉粉末（20g），在料液比、提取時間和提取溫度分別為1：20g/mL、2h和90°C條件下進行提取。冷卻至室溫后，通過離心除去固體殘留物（5000r/min，5min），得到離心上層清液。通過旋蒸儀將上清液濃縮至原始體積的三分之一，加入四倍體積95%的乙醇進行醇沉，靜置12h，將樣品在4000r/min下離心5min，以獲得沉淀，冷凍干燥，得到羅布麻葉粗多糖。實驗重復(fù)三次，稱重，按下式（1）計算得率。

     （1）

1.2.2.2 酶提取法

本次實驗主要使用的是纖維素酶和果膠酶，稱取20g羅布麻葉粉末，加酶量1%，將溶液酸性調(diào)節(jié)至最適pH，料液比1:20g/mL，45℃磁力攪拌下反應(yīng)2h，待反應(yīng)結(jié)束，將溫度加熱到90℃反應(yīng)10min使酶滅活，冷卻到室溫，離心，濃縮，再離心。加入四倍乙醇，靜置12h，離心，冷凍干燥，重復(fù)三遍計算得率^[21]。 

1.2.2.3 超聲輔助提取法

稱取20g羅布麻葉粉末，料液比1:20g/mL加蒸餾水，在超聲波處理器中反應(yīng)，超聲功率為500W，提取溫度為60°C，提取時間為60min。提取結(jié)束后，冷卻到室溫，離心，濃縮，乙醇沉淀，靜置12h，離心，冷凍干燥，實驗重復(fù)三次，稱重計算得率^[21]。

1.2.2.4 超聲微波協(xié)同提取法

取20g羅布麻葉粉末按照料液比1:20g/mL加入蒸餾水放入超聲微波協(xié)同提取儀中反應(yīng)。微波和超聲功率400W、提取溫度為60℃，提取時間為15min。提取后冷卻到室溫，進行離心，濃縮等操作，最后加入4倍乙醇，靜置12h，離心，冷凍干燥，重復(fù)三遍，計算得率^[22]。

1.2.3 羅布麻葉多糖的結(jié)構(gòu)表征

1.2.3.1 紫外分光光度法

配制濃度為1mg/mL的各多糖溶液，通過紫外分光光度計，在400-200nm的波長范圍內(nèi)進行全波長掃描。

1.2.3.2 傅里葉紅外光譜法

取適量的各多糖樣品放置于紅外分光光度計樣品臺上，記錄多糖在4000-500cm-1吸收光譜。

1.2.3.3 單糖組成

分別稱取5mg鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）及半乳糖（Gal）標準品，分別加入8mg鹽酸羥胺及0.5mL吡啶，于90℃水浴反應(yīng)30min。取出，冷卻至室溫，分別加入0.5mL乙酸酐，于90℃水浴反應(yīng)30min。待反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液吹干，加入1mL三氯甲烷，過0.22μm濾頭，供氣相色譜檢測。分別稱取5mg各多糖樣品，加入3mL三氯乙酸（2mol/L），于120℃水解6h。待水解完畢，加入3-4mL甲醇將溶液旋干，重復(fù)三次。按照單糖標準品衍生化方法進行衍生化，供氣相色譜檢測^[23]。氣相色譜條件：進樣口及檢測器溫度280℃、進樣量5µL、程序升溫條件如下：180℃保持5min，以2℃/min的速率加熱到220℃，保留10min，最后以5℃/min的速率加熱到280℃，保留10min。

1.2.3.4 剛果紅染色法

配制濃度為0.2mmol/L的剛果紅水溶液，濃度為1mol/L的氫氧化鈉溶液，配制質(zhì)量濃度為2mg/mL的各個多糖母液。準確量取1mL各多糖樣品溶液，加1mL剛果紅試液，加入不同體積的氫氧化鈉溶液，加水至4mL，使溶液中氫氧化鈉溶液的濃度為0-0.5mol/L，混勻，室溫反應(yīng)5min，用紫外分光光度計在400-700nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描，記錄最大吸收波長（λmax），氫氧化鈉濃度為橫坐標，λmax為縱坐標，繪制變化曲線^[24]。

1.2.3.5 掃描電鏡

取少量各多糖樣品于樣品臺上，用離子濺射儀噴一層鉑金。用掃描電鏡儀在不同放大倍數(shù)下觀察不同樣品的表面結(jié)構(gòu)形態(tài)。

1.2.4 抗氧化活性

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力

配制0.2mmol/L的DPPH-甲醇溶液和濃度為4mg/mL的各個粗多糖樣品母液。稀釋樣品至濃度為0.2-2mg/mL，準確量取各稀釋液1mL，加入等體積DPPH-甲醇溶液避光反應(yīng)30min，在517nm處用酶標儀測量吸光度。以2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）作為陽性對照，按照公式（2）計算DPPH自由基清除率^[25]。

     （2）

式中，A_i、A_j、A₀分別為樣品組、對照組及空白組。

1.2.4.2 羥自由基清除能力

配制6mmol/L的硫酸亞鐵溶液、6mmol/L水楊酸-乙醇溶液和質(zhì)量分數(shù)為0.1%的過氧化氫溶液，濃度為4mg/mL的各個粗多糖樣品母液。稀釋樣品至濃度為0.4-4mg/mL，準確量取各稀釋液1mL，加入等體積硫酸亞鐵溶液、水楊酸-乙醇溶液及過氧化氫溶液，放置反應(yīng)30min，于510nm處測定吸光度。按照公式（2）計算羥自由基清除率^[25]。

1.2.4.3 ABTS自由基清除能力

配制在734nm處的吸光度值為0.70±0.02ABTS溶液，濃度為4mg/mL的各個粗多糖樣品母液。稀釋樣品至濃度為0.5-4mg/mL，準確量取各稀釋液20μL，加入ABTS溶液180μL，室溫反應(yīng)5min，于734nm測定吸光度。以BHT作為陽性對照，按照公式（2）計算ABTS自由基清除率^[25]。

1.2.4.4 亞鐵離子螯合能力

配制濃度為5mmol/L的菲啰嗪溶液和濃度為2mmol/L的氯化亞鐵溶液，濃度為8mg/mL的各個多糖樣品母液。稀釋樣品，準確量取各稀釋液200μL，加入氯化亞鐵溶液20μL與菲啰嗪溶液40μL，室溫反應(yīng)5min，于562nm測定吸光度。以BHT作為陽性對照，按照公式（2）計算亞鐵離子螯合能力^[23]。

1.2.4.5 總還原能力

配制濃度為4mg/mL的各多糖樣品母液、磷酸緩沖溶液（PBS，0.2mol/L，pH=6.6）與鐵氰化鉀溶液（1%）。稀釋樣品，準確量取各稀釋液800μL，依次加入PBS和鐵氰化鉀溶液各400μL，在50℃環(huán)境下反應(yīng)50min冷卻至室溫；再加入10%的離心過后的TCA水溶液400μL，加入蒸餾水1.6mL和400μL三氯化鐵水溶液（0.1%），室溫放置10min，700nm處測定吸光度^[25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)采用OriginPro21軟件分析，采用均數(shù)±標準差表示，通過t檢驗，確認差異的顯著性，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對羅布麻葉多糖得率的影響

熱水提取法、超聲輔助提取法、纖維素酶提取法、果膠酶提取法及超聲微波協(xié)同提取等五種方法制備的羅布麻葉多糖的得率分別為9.2%±0.1%、12.1%±0.1%、13.4%±0.2%、13.6%±0.3%、12.4%±0.2%。如圖1所示，HWE的提取率顯著低于其他提取方法（P<0.01），酶提取法所得多糖的得率最高。HWE雖然條件較為溫和，但其耗時長，提取效率低。超聲波通過溶劑中產(chǎn)生的空化作用促進多糖的釋放、擴散和溶解^[21,26]；纖維素酶及果膠酶能夠在相對較低的溫度下有效地解聚植物細胞壁中的纖維素及果膠，并能破壞細胞壁和細胞膜，促進所需多糖的分離，從而導致得率的升高^[27,28]。因此，與HWE相比，新型輔助方法均可大幅度提高多糖的得率，此結(jié)果與較多文獻報道結(jié)果一致^[29,30]。Zhou等^[5]分別使用不同的溶劑（0.05mol/L及0.1mol/L的鹽酸及氫氧化鈉、水）提取羅布麻葉多糖，得出酸、堿提取能夠顯著提高多糖的得率，以0.1mol/L氫氧化鈉為溶劑提取的多糖得率為水提法的4倍。趙東洋^[31]通過熱水提取法分別對羅布麻葉、莖、花及羅布麻茶多糖進行提取，得率分別為3.5%、15.8%、12.0%及15.0%。其中羅布麻葉多糖的得率顯著低于本文中不同提取方法制備的AVP的得率。以上結(jié)果表明不同提取溶劑及提取方法對多糖得率有顯著的影響。

圖1 羅布麻葉多糖的提取結(jié)果

注：同一行內(nèi)不同字母表明有顯著差異（P<0.05）。AVP-HWE：羅布麻葉水提多糖，AVP-HWE，羅布麻葉超聲輔助提取多糖，AVP-CE羅布麻葉纖維素酶提取多糖，AVP-PE，羅布麻葉果膠酶提取多糖，AVP-UME，羅布麻葉超聲-微波協(xié)同提取多糖。

2.2胡麻發(fā)育期特征分析

2.2.1 單糖組成

混合標準品及不同提取方法制備的多糖的GC圖進行比較得出羅布麻葉中的多糖主要含有阿拉伯糖（Ara）、葡糖糖（Glc）和半乳糖（Gal）三種單糖，含有少量的木糖（Xyl）和甘露糖（Man），不含有鼠李糖（Rha），結(jié)果如表1所示。在五種多糖中阿拉伯糖（23.4%-38%）、葡糖糖（19.6%-48.3%）和半乳糖（21.4%-33.02%）含量最多，不同提取方法所得多糖的單糖含量也不同。如表1所示，經(jīng)使用輔助提取法，單糖組成變化較為明顯，且多糖中的Glc含量均有所上升，Gal含量下降，此結(jié)果表明超聲波、微波及酶的使用可能會將植物中不溶性糖降解為可溶性糖，且不同酶對其影響也有所差別，導致單糖組成的變化。從單糖組成可初步判斷羅布麻葉多糖可能是由阿拉伯半乳聚糖組成的果膠類多糖。Wang等^[10]研究表明羅布麻花兩種純化后的多糖由不同摩爾比的Rha、Ara、Xyl、Man、Glc及Gal組成，其中Gal及Ara為其主要單糖。Liu等^[11]報道羅布麻根多糖由摩爾比為35.10:34.18:23.67:7.04的Man、Ara、Glc及Gal組成，其主要單糖為Man及Ara。Yuan等報道^[12]經(jīng)熱水提取及堿提取后的羅布麻葉多糖由Ara、Rha、Gal、Glc及GalA組成。魏檸檸^[32]研究報道經(jīng)水提醇沉及Sevag法脫蛋白后的羅布麻葉多糖由摩爾比為0.29:1.0:0.55:3.88:1.12:2.20:1.29的Man、Rha、葡萄糖醛酸（GlcA）、GalA、Glc、Gal及Ara組成。研究報道的羅布麻葉多糖的主要單糖組成與本文發(fā)現(xiàn)的一致，然而由于多糖制備方法及羅布麻植物來源的不同，各單糖摩爾比存在一定的差距。

表1 羅布麻葉多糖的單糖組成（摩爾比）

注：AVP-HWE：羅布麻葉水提多糖，AVP-HWE，羅布麻葉超聲輔助提取多糖，AVP-CE 羅布麻葉纖維素酶提取多糖，AVP-PE，羅布麻葉果膠酶提取多糖，AVP-UME，羅布麻葉超聲-微波協(xié)同提取多糖。

a為出苗期；b為營養(yǎng)生長期；c為生殖生長期。

圖2 羅布麻葉多糖的氣相色譜圖

2.2.2 紫外吸收光譜結(jié)果

羅布麻多糖的紫外吸收光譜圖如圖3A所示。如圖所示，AVP-UE和AVP-UME在280nm附近出現(xiàn)了微弱的吸收峰，說明其中含有極少量的蛋白，經(jīng)BCA法測定后得出蛋白含量極少，可忽略不計。此研究結(jié)果與Zhou等^[5]的研究報道一致。

2.2.3 紅外吸收光譜結(jié)果

紅外光譜可以用來分析多糖的糖苷鍵類型、官能團的類型以及糖環(huán)構(gòu)型等。羅布麻葉多糖紅外光譜圖如圖3B所示，五種多糖均在4000-500cm^-1范圍內(nèi)顯出了相似的多糖吸收峰，說明多糖有相似的特征結(jié)構(gòu)。3400cm^-1及2900cm^-1附近的吸收峰表示O-H及C-H的伸縮振動，1640cm^-1左右的吸收峰是COO-的伸縮振動，1475cm^-1左右的吸收峰是平面彎曲振動中的C-H，1200-1000cm^-1處的吸收峰為C-O-H鍵中C-O的拉伸振動，890cm^-1處出現(xiàn)吸收峰說明該多糖具有β-糖苷鍵，說明羅布麻葉多糖具有β-構(gòu)型的糖苷鍵^[33,34]。以上結(jié)果表明，不同的提取方法對羅布麻葉多糖的一級結(jié)構(gòu)和糖苷鍵類型的影響較少。

圖3 羅布麻葉多糖的紫外及紅外吸收光譜圖（A:UV；B:FT-IR）

2.2.4 剛果紅染色試驗結(jié)果

研究表明具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖在堿性條件下與剛果紅生成紅色絡(luò)合物，絡(luò)合物的λmax發(fā)生紅移，且隨著氫氧化鈉濃度的升高三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，λmax呈現(xiàn)下降趨勢^[35]。如圖4所示，與對照組相比，不同提取方法制備的羅布麻葉多糖與剛果紅形成的絡(luò)合物的λmax均發(fā)生紅移。然而，隨著NaOH濃度的升高，各絡(luò)合物的λmax出現(xiàn)了不同的無規(guī)則變化，說明羅布麻葉多糖中可能不含有三螺旋結(jié)構(gòu)，此結(jié)果與羅布麻根多糖報道一致^[36]。其中，AVP-CE及AVP-UE顯出先上升后降低趨勢，AVP-PE顯出先平緩再上升趨勢，AVP-UME及AVP-HWE顯出緩慢上升再降低的趨勢，結(jié)果表明不同方法制備的羅布麻葉多糖具有不同的高級結(jié)構(gòu)，不同提取方法所得羅布麻多糖的高級結(jié)構(gòu)存在差異。

圖4 羅布麻葉多糖-剛果紅絡(luò)合物λmax變化圖

2.2.5 掃描電鏡結(jié)果

五種提取方法制備的羅布麻葉多糖在5000×和20000×放大倍數(shù)下的掃描電子顯微鏡圖（SEM）如下圖5所示。AVP-UE顯出球狀及蜂窩狀結(jié)構(gòu)，球狀顆粒表面較為光滑，而蜂窩狀顆粒表面較為粗糙（圖5A）。AVP-HWE表面結(jié)構(gòu)多表現(xiàn)為不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，放大至20000×可看出其主要是由不規(guī)則顆粒組成，表面較為粗糙（圖5B）。AVP-PE和AVP-CE表面都呈現(xiàn)出片狀和塊狀混合結(jié)構(gòu)，放大后發(fā)現(xiàn)AVP-PE片狀結(jié)構(gòu)較為完整，且較大，AVP-CE由片狀結(jié)構(gòu)較小、結(jié)構(gòu)比較緊湊且多聚的結(jié)構(gòu)組成（圖5C和圖5D）。AVP-UME由不規(guī)則大小的絲狀與片狀組成，表面較為粗糙（圖5E），結(jié)果表明不同提取方法制備的羅布麻葉多糖表面形貌各不相同，不僅形狀和顆粒大小，而且表面積等均有所不一樣。與傳統(tǒng)水提法相比，超聲輔助法、酶輔助法及超聲-微波輔助法所制備的多糖可能由于在提取過程中超聲、微波及酶的使用對植物細胞壁的破壞程度更大，處理方法在不同程度上破壞了多糖的原始鏈接方式，并導致了大小和形狀的不同，說明不同的提取法對多糖的高級結(jié)構(gòu)影響較大^[37,38]，此結(jié)果與剛果紅實驗結(jié)果一致。

圖5 羅布麻葉多糖SEM圖 

2.3 羅布麻葉多糖的抗氧化活性

不同提取方法制備的羅布麻葉多糖的抗氧化活性結(jié)果如圖6所示。隨著濃度的升高，各多糖樣品DPPH自由基清除能力均顯出濃度依賴性關(guān)系（圖6A）。當濃度為1mg/mL時，AVP-HWE、AVP-UE及AVP-UME的DPPH自由基清除能力強于陽性對照BHT。其中，AVP-HWE的DPPH自由基清除能力最強，IC50值為0.219mg/mL，其DPPH自由基清除能力顯著強于其余多糖（P<0.05）。羅布麻葉多糖羥自由基清除能力結(jié)果如圖6B所示，低濃度時五種多糖清除率均較差，隨著濃度的升高AVP-HWE、AVP-UME和AVP-UE的清除能力迅速升高。通過對比IC50值可得出AVP-UE的羥自由基清除能力最強，IC50值為0.298mg/mL。與DPPH及羥自由基清除能力相比，羅布麻葉多糖的ABTS自由基清除能力及亞鐵離子螯合能力較強。隨著樣品濃度的升高，ABTS自由基清除能力及亞鐵離子螯合能力均逐漸上升（圖6C、6D），通過IC50值大小可以判斷出AVP-HWE的ABTS自由基清除能力最強，IC50值為0.072mg/mL，AVP-CE和AVP-UE的亞鐵離子螯合能力更強，IC50值分別為0.107mg/mL和0.108mg/mL，活性強于其余多糖。在測定濃度范圍之內(nèi)各多糖的總還原能力隨著濃度的升高而增強，然而弱于陽性對照BHT，各樣品之間無顯著性差異，結(jié)果表明多糖對于自由基清除能力有一定的選擇性。

Li等^[7]研究報道羅布麻葉提取物當濃度為1mg/mL時對DPPH、ABTS及羥自由基的清除能力為57.4%、55.9%、83.1%，此結(jié)果顯著低于羅布麻葉多糖的抗氧化活性。鄭思睿等^[14]報道熱水提取后的羅布麻葉多糖具有較強的DPPH自由基清除能力和較弱的羥自由基清除能力，當濃度為6mg/mL時其對羥自由基的清除能力低于50%。田立等^[39]報道當濃度為1.2mg/mL時，羅布麻葉多糖對羥自由基的清除能力為78.2%，同樣濃度下總還原能力吸光度值達1.63。

研究表明多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系較為緊密。由于不同提取方法得到的多糖的結(jié)構(gòu)差距較大，不同提取方法制備的羅布麻葉多糖顯出的活性差距也較大。經(jīng)對比不同提取方法制備的羅布麻葉多糖的IC50值（表2）可看出，不同種提取法制備的多糖有不同的自由基清除能力。在羥自由基清除能力方面AVP-UE有較好的優(yōu)勢，AVP-CE亞鐵離子螯合能力較強，在DPPH和ABTS清除能力中AVP-HWE的清除能力最好，各多糖在總還原能力方面差距較小。以上結(jié)果表明不同方法制備的羅布麻多糖均顯出了不同的抗氧化活性。因此，原藥材種類、產(chǎn)地，多糖的單糖組成、糖苷鍵鏈接方式及多糖的提取分離手段等均可能影響活性。

表2 羅布麻葉多糖抗氧化活性（IC50mg/mL）

注：AVP-HWE：羅布麻葉水提多糖，AVP-HWE，羅布麻葉超聲輔助提取多糖，AVP-CE 羅布麻葉纖維素酶提取多糖，AVP-PE，羅布麻葉果膠酶提取多糖，AVP-UME，羅布麻葉超聲-微波協(xié)同提取多糖。

圖6 羅布麻葉多糖的抗氧化活性

3 結(jié)論

本文通過熱水提取、超聲輔助提取、超聲微波協(xié)同提取、纖維素酶及果膠酶提取等方法制備羅布麻葉多糖，通過UV、FT-IR、GC、SEM及剛果紅染色等對多糖進行了結(jié)構(gòu)初探，并通過體外自由基清除能力評價了抗氧化活性。結(jié)果表明果膠酶提取法得率最高（13.60%），熱水提取法得率最低（9.20%）。羅布麻葉多糖主要含有Ara、Glc和Gal三種單糖，含有少量的Xyl和Man，FT-IR表明提取方法對多糖一級結(jié)構(gòu)影響較小，均不含有三螺旋結(jié)構(gòu)?？寡趸瘜嶒灡砻髁_布麻葉多糖具有較強的DPPH、ABTS、羥自由基清除能力及亞鐵離子螯合能力，IC50分別為0.072-0.099、0.219-0.422、0.298-0.423、0.107-0.149mg/mL。綜上，不同提取方法對多糖結(jié)構(gòu)及活性有顯著的影響，經(jīng)綜合比較得出超聲輔助提取法和纖維素酶提取法更適合于羅布麻葉多糖的提取。研究不同提取方法對羅布麻葉多糖結(jié)構(gòu)以及活性的影響對于其在食品和藥品原料開發(fā)方面具有深遠的意義。有關(guān)于羅布麻葉多糖提取工藝優(yōu)化、分離純化、結(jié)構(gòu)解析和生物活性關(guān)系研待進一步探究。

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