摘 要:劍麻是熱帶地區(qū)重要的纖維作物，生產(chǎn)中易受到寒害威脅而造成減產(chǎn)。超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的保護酶，在植物應(yīng)答低溫等逆境條件脅迫過程中起重要作用。前人研究已初步明確超氧化物歧化酶在劍麻低溫處理后起重要作用，但其在劍麻中的基因序列及分子調(diào)控機制尚未明確。在已發(fā)表的劍麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出5個SOD基因，遺傳進化分析顯示其在不同植物物種中進化較保守。實時定量PCR結(jié)果顯示低溫脅迫后5個基因表達模式均呈先上升后下降趨勢，且均與SOD活性變化顯著正相關(guān)（P<0.05）。其中2個CSD基因和1個FSD基因與SOD活性極顯著正相關(guān)（P<0.01），表明這3個基因在應(yīng)答低溫脅迫過程中起重要作用。研究鑒定了劍麻SOD基因并初步明確其應(yīng)答低溫脅迫表達模式，為深入開展劍麻抗寒機制研究提供了重要基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：劍麻；超氧化物歧化酶基因；低溫脅迫；基因表達
劍麻是熱帶亞熱帶地區(qū)廣泛種植的硬質(zhì)纖維作物，在我國主要種植于廣西、廣東、海南等地[1]。劍麻纖維具有強度高、質(zhì)地堅韌、耐腐蝕等特性，在航海、漁業(yè)、造紙等行業(yè)用途廣泛[2]。此外，劍麻纖維復(fù)合材料的高強度、耐腐蝕等特性在環(huán)保再生型建筑材料方面存在巨大的應(yīng)用前景[3]。近年來隨著全球氣候的變化，極端溫度（高溫和低溫）出現(xiàn)頻次日益增多，已成為制約全球農(nóng)業(yè)進一步發(fā)展的重要因素[4]。低溫作為一種非生物脅迫，可造成植物組織凍傷，引起芽萎縮、葉片發(fā)黃萎蔫、組織死亡等寒害癥狀[5]。劍麻作為典型的熱帶作物之一，對低溫寒害耐受力較差。我國大部分劍麻種植區(qū)處于熱帶亞熱帶地區(qū)，在早春易受“倒春寒”影響，嚴重時可造成大面積減產(chǎn)[6]。目前擬南芥、水稻等模式植物中已開展了大量的低溫脅迫調(diào)控機制相關(guān)研究，而劍麻相關(guān)研究報道較少。張學財?shù)?/font>[7]測定了低溫脅迫后劍麻葉片中保護酶等生理指標的變化規(guī)律，黃顯雅等和田夏紅等分別開展了劍麻種質(zhì)資源抗寒性田間調(diào)查[4,8]。楊欣麗開展了劍麻應(yīng)答低溫脅迫機制研究，明確了8種生理生化指標及CBF、psaA和psaB等基因的變化規(guī)律[6]。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）作為一種重要的保護酶，可有效清除植物體內(nèi)過量的活性氧，在植物生長發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答等過程中起重要作用[9]。劍麻中已初步明確低溫脅迫后SOD活性變化，但相關(guān)基因及表達模式尚未報道[6,7]。本研究根據(jù)已發(fā)表的劍麻轉(zhuǎn)錄組，通過同源序列比對鑒定SOD基因，并開展系統(tǒng)進化及表達分析，闡明劍麻SOD基因的遺傳進化規(guī)律及其應(yīng)答低溫脅迫表達模式，為探明其生物學功能及作用機制提供基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料種植與處理
本研究選取的試驗材料為劍麻主栽品種‘H11648’株芽苗，在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所（19.99°N，110.33°E）盆栽種植2個月后放置于智能人工氣候培養(yǎng)箱（DRXM-150-2，上海川昱）進行低溫處理。6°C處理0h、6h、12h、18h、24h時剪取葉片取樣[6]，每個處理均在不同植株重復(fù)取樣3次，隨后置于液氮速凍，放置于-80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/font>
1.2 材料種植與處理
以7個擬南芥和7個水稻SOD基因為參考序列，通過TBlastx方法在劍麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫檢索SOD基因同源序列[10-13]。通過ORF-FINDER軟件分析檢索獲得的劍麻基因序列，將包含完整編碼序列的SOD基因進行后續(xù)分析[14]。通過ProtParam軟件在線預(yù)測劍麻SOD蛋白長度、分子量和理論等電點等理化性質(zhì)[15]。選取擬南芥（7個）、水稻（7個）、蘆筍（9個）和劍麻（5個）SOD蛋白序列在ClustalX2.0軟件中進行多重序列比對，進而構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹，Bootstrap分析重復(fù)1000次[16]。
1.3 劍麻SOD基因表達分析及SOD活性測定
采用天根植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技，中國）提取樣品中的總RNA，并通過Go Script Reverse Transcription System（Promega,美國）反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。通過QuantStudio6實時熒光定量PCR系統(tǒng)（賽默飛，美國）進行實時定量PCR分析。PCR反應(yīng)程序為94℃反應(yīng)30s；94℃反應(yīng)3min，94℃反應(yīng)10s，58℃反應(yīng)30s，共重復(fù)40個循環(huán)；溶解曲線循環(huán)。PCR擴增體系最終體積為20μL，其中包含1μLc DNA模板、10μL Trans Start Tip Green qPCR Super mix（全式金，中國）、0.4μL Passive Reference Dye（全式金，中國）、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物和7.6μ雙蒸水。根據(jù)5個劍麻SOD基因及內(nèi)參基因PP2A（proteinphosphatase2A）的編碼序列，在Primer3軟件中設(shè)計定量PCR引物，其序列見表1[17]。每個樣品重復(fù)3次作為技術(shù)重復(fù)，通過2-ΔΔCt法計算每個基因的相對表達量[18]。采用羥胺法測定劍麻樣品中SOD活性[6]。
2 結(jié)果與分析
2.1 劍麻SOD基因的鑒定
在劍麻轉(zhuǎn)錄組中進行同源序列檢索共獲得5個含完整編碼序列的SOD基因（表2），將其命名為AhCSD1、AhCSD2、AhMSD1、AhFSD1和AhFSD2，其序列長度為834～1397bp，編碼的蛋白質(zhì)長度為152～300aa。蛋白質(zhì)分子量為15225.84～33921.87Da，理論等電點為5.07～8.84。
表1 實時定量PCR引物
表2 劍麻SOD基因及其蛋白理化性質(zhì)
圖1 擬南芥、水稻、蘆筍及劍麻SOD基因遺傳進化分析
注：At表示擬南芥；Ah表示劍麻；Ao表示蘆筍；Os表示水稻
2.2 劍麻SOD基因系統(tǒng)進化分析
以擬南芥、水稻SOD基因為參照，選取天門冬目作物蘆筍、劍麻SOD基因進行遺傳進化分析。利用ClustalX2.0軟件進行氨基酸序列的多重比對并構(gòu)建Neighbor-Joining進化樹（Bootstrap分析采用1000次重復(fù)），結(jié)果如圖1所示。28個蛋白序列被分成3個分支，即FSD、MSD和CSD分支。FSD和MSD分支中各物種序列數(shù)相近，擬南芥和蘆筍序列數(shù)分別在兩分支多于其他物種。CSD分支中水稻和蘆筍序列數(shù)多于擬南芥和劍麻，其中CSD3亞分支中未聚類到劍麻序列。此外，劍麻和蘆筍序列均聚類在相同分支。
2.3 劍麻SOD基因應(yīng)答低溫脅迫表達分析
通過實時定量PCR檢測低溫脅迫后劍麻SOD基因表達模式，結(jié)果顯示5個基因表達水平均呈先上升后下降趨勢，但未達到顯著水平（圖2）。其中AhFSD2表達水平在處理后12h和24h時分別較6h和18h時略有下降，其余4個基因表達水平僅在處理后24h略有下降。
2.4 劍麻低溫脅迫SOD活性與基因表達相關(guān)性分析
進一步測定了低溫脅迫后劍麻葉片中SOD活性，結(jié)果顯示其呈先上升后下降趨勢，處理后18h時SOD活性達到峰值后下降（圖3A）。將SOD活性與5個基因的表達模式進行相關(guān)性分析（圖3B），結(jié)果顯示AhFSD1、AhFSD2和AhCSD1表達模式與SOD活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），其余2個基因呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。
圖2 劍麻SOD基因低溫脅迫表達模式
A：樣品葉片中SOD活性圖 B：SOD與基因表達相關(guān)性分析圖
圖3 劍麻SOD基因低溫脅迫表達模式
注：B中R為相關(guān)系數(shù)，*和**分別表示顯著（P<0.05）和極顯著（P<0.01）
3 討論
SOD在植物抗氧化防御系統(tǒng)中起重要作用，可將超氧陰離子自由基歧化為H2O2和O2以清除活性氧[19]。劍麻中已初步明確SOD在應(yīng)答低溫脅迫過程中起重要作用，但其蛋白類型及基因序列尚未明確[6]。植物中主要存在3種類型SOD，即CSD（Cu/Zn-SOD）、MSD（Mn-SOD）和FSD（Fe-SOD），高等植物中以CSD為主[20]。根據(jù)同源序列檢索發(fā)現(xiàn)劍麻中存在上述3種類型SOD基因，在不同植物物種中進化較保守，與模式植物相比CSD基因數(shù)量較少，可能與SOD基因的組織特異性表達有關(guān)[11]。目前劍麻基因組序列尚未公布，葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中可能并未完全反映基因組水平SOD基因家族的表達模式。實時定量PCR結(jié)果顯示低溫處理后5個劍麻SOD基因表達水平均上升，在24h時開始下降，與SOD活性變化規(guī)律一致，且均呈顯著正相關(guān)，表明5個基因均參與應(yīng)答低溫脅迫。其中2個CSD基因和1個FSD基因與SOD活性極顯著正相關(guān)，表明這3個基因在應(yīng)答低溫脅迫過程中起重要作用。后續(xù)將進一步探究劍麻CSD基因應(yīng)答低溫脅迫機制，提升對劍麻抗寒機制的理解，對選育抗寒劍麻新品種具有重要意義。
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文章摘自: 陳莉莎，李玉波，胡曉麗，楊欣麗，易克賢，黃興. 劍麻超氧化物歧化酶基因鑒定及低溫脅迫表達分析[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)，2024，116(01):23-27.
