摘 要：漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用，屬于漢麻的抗逆性研究技術(shù)領(lǐng)域。所述應(yīng)用為：在漢麻體內(nèi)將CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量增高，以提高漢麻對非生物脅迫的耐受性。與水處理相比，在NaHCO<subgt;3</subgt;脅迫下，控制CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在漢麻體內(nèi)表達(dá)量至少增高11倍；在甘露醇脅迫下，控制CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在漢麻體內(nèi)表達(dá)量至少增高6倍；在NaCl脅迫下，控制CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在漢麻體內(nèi)表達(dá)量至少增高9倍。本發(fā)明明確CsNAC轉(zhuǎn)錄因子在不同脅迫反應(yīng)中的功能，為抗逆分子育種提供基因資源；豐富漢麻NAC轉(zhuǎn)錄因子參與非生物脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
權(quán)利要求
1.漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用為：在漢麻體內(nèi)將CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量增高，以提高漢麻對非生物脅迫的耐受性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用，其特征在于：與水處理相比，在NaHCO3脅迫下，控制CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在漢麻體內(nèi)表達(dá)量至少增高11倍；在甘露醇脅迫下，控制CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在漢麻體內(nèi)表達(dá)量至少增高6倍；在NaCl脅迫下，控制CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在漢麻體內(nèi)表達(dá)量至少增高9倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用中，過表達(dá)GFP-CsNAC56載體的構(gòu)建具體為：
步驟一：GFP載體單酶切
為了將CsNAC56基因插入到SmaI酶切位點處，將GFP載體用BsaI/Eco31I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后，獲得GFP載體的線性化產(chǎn)物，-20℃保存?zhèn)溆茫?/font>
步驟二：CsNAC56基因克隆
從NCBI網(wǎng)上獲得CsNAC56基因的片段序列，引物設(shè)計為GFP-CsNAC56-F：GGAGAGAACACGGGGGACTTTGCAAC-ATGGAGAGCACCGACTCCTC，GFP-CsNAC56-R：CCACTCCCTGAAGCGGCCGCTGTACA-TGAATACCAGTGCATTCCGGGC；分別在CsNAC56基因的5’端和3’端加上GFP載體在BsaI/Eco31I酶切位點接頭，以漢麻的cDNA為模板，按照PCR反應(yīng)體系，獲得同源融合的膠回收片段；
步驟三：目的片段與GFP線性化載體的連接
將步驟二得到的加完同源接頭的CsNAC56基因膠回收產(chǎn)物和步驟一得到的經(jīng)過BsaI/Eco31I雙酶切的GFP線性化產(chǎn)物，按照In-Fusion連接體系，50℃反應(yīng)15分鐘，然后將連接產(chǎn)物放-20℃保存?zhèn)溆没蛘咧苯佑糜谵D(zhuǎn)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用，其特征在于：步驟一中，BsaI/Eco31I雙酶切體系由4.0μL質(zhì)粒、2.0μL 10×Buffer J(promega)、1.0μL BsaI/Eco31I、13μL dd H2O組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用，其特征在于：步驟二中，所述PCR反應(yīng)體系包括2.0μL 10×PCRbuffer、2μL dNTP Mix(2mM)、1.0μLCsNAC56-F(10μM)、1.0μL CsNAC56-R(10μM)、0.4μL KOD(5U/μL)、0.8μL MgSO4(25mM)、0.1～0.2μg cDNA，并使用dd H2O補(bǔ)足至20μL；反應(yīng)程序為94℃5min循環(huán)1次，94℃30sec循環(huán)30次，50℃45sec循環(huán)30次，72℃71sec循環(huán)30次，72℃10min循環(huán)1次，16℃30min循環(huán)1次。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用，其特征在于：步驟二中，所述In-Fusion連接體系包括0.2～0.4μg GFP vector(Sma I)、1.5μLCsNAC56膠回收片段、5μL 2×Assembly Master Mix，并使用ddH2O補(bǔ)足至10μL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用中，酵母雙雜交Bait表達(dá)載體(pGBKT7-CsNAC56)的構(gòu)建具體為：
步驟一：帶有載體同源序列的CsNAC56基因的擴(kuò)增
根據(jù)CsNAC56基因的序列，設(shè)計構(gòu)建Bait表達(dá)載體引物；以pROK2-CsNAC56質(zhì)粒為模板，pGBKT7-CsNAC56-F和pGBKT7-CsNAC56-R為引物，利用PCR的方法引入pGBKT7質(zhì)粒線性化末端的同源互補(bǔ)序列；pGBKT7-CsNAC56-F：5’-CATGGAGGCCGAATTCATGGAGAGCACCGACTCCT-3’，pGBKT7-CsNAC56-R：5’-GCAGGTCGACGGATCCTTATGAATACCAGTGCATTCC-3’；
步驟二：pGBKT7質(zhì)粒雙酶切
使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系包括2.0μL 10×BufferE、1.0μgpGBKT7質(zhì)粒、1.0μL EcoRI(12U/μL)、1.0μLBamH I(10U/μL)、0.2μL BSA，超純水補(bǔ)足體積至20μL，反應(yīng)條件：37℃，6h；通過電泳檢測雙酶消化的結(jié)果，并通過凝膠回收試劑盒回收消化的質(zhì)粒，并對凝膠回收結(jié)果進(jìn)行電泳以確定濃度；
步驟三：CsNAC56基因與pGBKT7載體(雙酶切后的質(zhì)粒)的連接反應(yīng)
使用In-Fusion連接體系，In-Fusion連接體系具體為0.2～0.4μgpGBKT7 vector(SmaI)、1.5μL CsNAC56膠回收片段、5μL 2×Assembly Master Mix，并使用dd H2O補(bǔ)足至10μL；反應(yīng)條件：50℃，15min。
說明書
漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于漢麻的抗逆性研究技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
大麻(Cannabis sativa L.)是一年生草本植物，屬于大麻科。大麻是最早的馴化農(nóng)作物之一，是一種重要的經(jīng)濟(jì)植物，其莖中含有優(yōu)質(zhì)的纖維素，種子含有高質(zhì)量的油以及花序含有有價值的樹脂，從特種紙漿和紙張到營養(yǎng)食品，藥品和化妝品，大麻莖，種子和花序可以衍生出多種產(chǎn)品。然而，曾經(jīng)是重要的非糧食作物，用于生產(chǎn)紡織品和繩索，但由于與其他原料(如棉花和合成纖維)的競爭，大麻種植在20世紀(jì)逐漸減少。因此，培育纖維產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)的漢麻品種已成為研究的熱點。
植物依靠復(fù)雜的信號通路來有效防御外部威脅，同時保持增長的平衡。轉(zhuǎn)錄因子(TFs)在控制植物發(fā)育的各種過程以及對外界刺激的反應(yīng)中形成了主要的調(diào)控因子。植物中約有58個轉(zhuǎn)錄因子家族，其中NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子(王婉妮等,2022)，通常，在NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子中，保守的NAC域由五個子域組成，其中有三個高度保守的A，C和D子域以及兩個不同的B和E子域。除了與DNA結(jié)合外，NAC結(jié)構(gòu)域還通過與其他包含NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用來參與核定位以及同二聚體和異二聚體的形成。
TRR區(qū)域(transcriptional regulation region)位于NAC蛋白的C端，其序列是高度可變的，與轉(zhuǎn)錄激活活性調(diào)控的多樣性密切相關(guān)。遺傳學(xué)研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物中具有重要的生物學(xué)功能，例如葉片衰老，次級代謝以及對各種環(huán)境脅迫的反應(yīng)(Crameret al 2011；Nakashima et al 2012；Puranik et al 2012；劉濤等,2022)。Tran等報道從擬南芥中克隆的ANAC019，ANAC055和ANAC072在增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性中起重要作用(Tran etal.,2004)。因此，越來越多的研究探索了NAC家族應(yīng)對各種非生物脅迫的功能。同時有研究表明，NAC和MYB家族的幾類轉(zhuǎn)錄因子參與控制厚壁細(xì)胞形成的各個步驟(Zhu etal.,2014)。NAC基因VND6(VASCULAR-RELATED NAC DOMAIN6)和VND7分別抑制了擬南芥初生根中次生木質(zhì)部及初生木質(zhì)部脈管的形成(Kubo et al.,2005)。其他兩個擬南芥NAC基因NST1(NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR1)和NST2能夠調(diào)節(jié)次生壁增厚，這是花藥開裂過程中氣孔破裂所必需的(Mitsuda et al 2005)。擬南芥基因SND1(SECONDARY WALL-ASSOCI-ATED NAC DOMAIN PROTEIN1)被證明是調(diào)節(jié)纖維中次生壁合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄開關(guān)(Stracke et al 2001)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決漢麻在面對非生物脅迫時耐受性差的問題，提供一種漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
漢麻CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為：在漢麻體內(nèi)將CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量增高，以提高漢麻對非生物脅迫的耐受性。
進(jìn)一步地，與水處理相比，在NaHCO3脅迫下，控制CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在漢麻體內(nèi)表達(dá)量至少增高11倍；在甘露醇脅迫下，控制CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在漢麻體內(nèi)表達(dá)量至少增高6倍；在NaCl脅迫下，控制CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在漢麻體內(nèi)表達(dá)量至少增高9倍。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為：本發(fā)明明確CsNAC轉(zhuǎn)錄因子在不同脅迫反應(yīng)中的功能，為抗逆分子育種提供基因資源；豐富漢麻NAC轉(zhuǎn)錄因子參與非生物脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
附圖說明
圖1為GFP載體圖譜；
圖2為大腸桿菌菌液PCR電泳圖，其中M：DNA Marker DL2000 1-8、檢測的大腸桿菌菌液PCR產(chǎn)物；
圖3為CsNAC56表達(dá)模式分析圖；
圖4為CsNAC56亞細(xì)胞定位圖；
圖5為CsNAC56轉(zhuǎn)錄自激活驗證圖。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
實施例1
本發(fā)明以漢麻NAC轉(zhuǎn)錄因子CsNAC56為研究對象，分別在不同的非生物脅迫下研究其表達(dá)模式，并且利用原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)及酵母雙雜交技術(shù)探討其分子特性。
本實施例所使用的植物材料為漢麻2號，培養(yǎng)至快速生長期時，在28℃環(huán)境和16/8h光/暗循環(huán)中生長，相對濕度為70-75％。
一、非生物脅迫下CsNAC56基因的在漢麻葉中的表達(dá)模式
利用水、300mM Mannitol(甘露醇)、100mM NaHCO3和200mM NaCl依次浸泡漢麻幼苗，于處理24h對葉子進(jìn)行取樣，液氮速凍，-80℃保存用于提取RNA，利用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總的RNA；使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO)反轉(zhuǎn)錄。使用Bio-Rad Chromo4 real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行實時定量PCR。
反應(yīng)混合液含有2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo)12.5μl，上下游引物0.5μM，cDNA模板2μl(相當(dāng)于100ng的RNA)，dd H2O補(bǔ)足至總體積為25μl。反應(yīng)條件為：94℃，30s；45循環(huán)：94℃，12s；58℃，30s；72℃，30s。最后80℃，1s。漢麻Actin1作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。相對表達(dá)水平利用2-△△CT方法計算(Livak et al.,2001)。CsNAC56在水處理下的表達(dá)水平設(shè)為1，其它的處理相應(yīng)進(jìn)行計算。每一個樣品進(jìn)行三次獨立的生物學(xué)重復(fù)，每次進(jìn)行三次技術(shù)重復(fù)。所有的引物顯示在表1中。
表1實時定量PCR引物序列
二、過表達(dá)GFP-CsNAC56載體的構(gòu)建
(1)GFP載體單酶切
如圖1所示，圖1為載體圖，將基因融合到過表達(dá)載體上，為了將CsNAC56基因插入到SmaI酶切位點處，將GFP載體用BsaI/Eco31I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，按照BsaI/Eco31I雙酶切體系，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后，獲得GFP載體的線性化產(chǎn)物，-20℃保存?zhèn)溆?。所?/font>BsaI/Eco31I雙酶切體系由4.0μL質(zhì)粒、2.0μL 10×Buffer J(promega)、1.0μL BsaI/Eco31I、13μL dd H2O組成。
(2)CsNAC56基因克隆
從NCBI網(wǎng)上獲得CsNAC56基因的片段序列，引物設(shè)計如表2所示，分別在CsNAC56基因的5’端和3’端加上GFP載體在BsaI/Eco31I酶切位點接頭，以漢麻的cDNA為模板，按照PCR反應(yīng)體系，獲得同源融合的膠回收片段。所述PCR反應(yīng)體系包括2.0μL 10×PCR buffer、2μLdNTP Mix(2mM)、1.0μL CsNAC56-F(10μM)、1.0μL CsNAC56-R(10μM)、0.4μL KOD(5U/μL)、0.8μL MgSO4(25mM)、0.1～0.2μg cDNA，并使用dd H2O補(bǔ)足至20μL；反應(yīng)程序為94℃5min循環(huán)1次，94℃30sec循環(huán)30次，50℃45sec循環(huán)30次，72℃71sec循環(huán)30次，72℃10min循環(huán)1次，16℃30min循環(huán)1次。
表2：GFP-CsNAC56載體構(gòu)建的CsNAC56基因引物設(shè)計
(3)目的片段與GFP線性化載體的連接
將上述步驟(2)得到的加完同源接頭的CsNAC56基因膠回收產(chǎn)物和步驟(1)得到的經(jīng)過BsaI/Eco31I雙酶切的GFP線性化產(chǎn)物，按照In-Fusion連接體系，50℃反應(yīng)15分鐘，然后將連接產(chǎn)物放-20℃保存?zhèn)溆没蛘咧苯佑糜谵D(zhuǎn)化。所述In-Fusion連接體系包括0.2～0.4μg GFP vector(Sma I)、1.5μL CsNAC56膠回收片段、5μL2×Assembly Master Mix，并使用dd H2O補(bǔ)足至10μL。
(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌及鑒定
將上步獲得的連接產(chǎn)物加入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞當(dāng)中，經(jīng)過熱擊轉(zhuǎn)化后在含有50mg/L卡那霉素的LB固體平板上進(jìn)行篩選，篩選出的單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測。檢測用CsNAC56的基因引物(表2)和GFP的載體引物(表3)。檢測成功的克隆，將菌液送北京華大基因進(jìn)行測序驗證。
表3：GFP-CsNAC56構(gòu)建的載體引物設(shè)計
為了確認(rèn)GFP-CsNAC56載體序列是否正確，選取2個樣品以GFP F/R為引物提交給華大基因有限公司測序部進(jìn)行測序，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與CsNAC56基因的DNA序列完全相同，表明此植物表達(dá)載體已經(jīng)構(gòu)建成功。
(5)擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
步驟一：25℃左右培養(yǎng)25-30d擬南芥幼苗(未抽薹)。
步驟二：取苗若干，加入5-10mL酶解液(Cellulase R10 0.15g、Mecerozyme R100.04g、D-mannitol 0.728g、200mM KCl 100μL、200mM MES1mL、1M CaCl2 100μL、BSA100μL)，全部浸泡組織為宜。24℃靜置酶解4h。MES指的是2-嗎啉乙磺酸；
步驟三：40μm濾網(wǎng)過濾后300rpm離心3min，去上清。
步驟四：用4℃預(yù)冷W5溶液(154mM NaCl 10mL、125mM CaCl2.H2O 12.5mL、5mM KCl250μL、2mM MES1mL)10mL洗滌2次，300rpm離心3min，離心溫度4-25℃均可。
步驟五：根據(jù)需要加入500μL MMG溶液(150mM MgCl2 1mL、200mM MES200μL、Mannitol 0.728g)懸浮，(每個樣品(2×105個/ml)，用100μL原生質(zhì)體)。鏡檢：40倍鏡下，每個視野20-40個左右。
步驟六：取100μL原生質(zhì)體懸液+20μL DNA(步驟(4)得到)(500ng以上的純化質(zhì)粒，共定位額外加10μL Marker共轉(zhuǎn))，取與DNA和原生質(zhì)體體積之和相等的PEG4000溶液(120μL)，輕柔均勻混合，室溫靜置30min。
步驟七：用1mL的W5稀釋終止反應(yīng)(稀釋轉(zhuǎn)化混合液，然后輕柔顛倒搖動離心管使之混合完好以終止轉(zhuǎn)化反應(yīng))。300rpm離心3min收集原生質(zhì)體，去上清。
步驟八：加入1mL W5洗滌1-2次。最后加入1mL W5溶液，28℃暗培養(yǎng)18-24h。
步驟九：去上清，只留100μL左右的原生質(zhì)體，熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡觀察。
三、酵母雙雜交Bait表達(dá)載體(pGBKT7-CsNAC56)的構(gòu)建
(1)帶有載體同源序列的CsNAC56基因的擴(kuò)增
根據(jù)CsNAC56基因的序列，設(shè)計構(gòu)建Bait表達(dá)載體引物(PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參見過表達(dá)GFP-CsNAC56載體的構(gòu)建中的參數(shù))。
以pROK2-CsNAC56質(zhì)粒為模板，pGBKT7-CsNAC56-F和pGBKT7-CsNAC56-R為引物，利用PCR的方法引入pGBKT7質(zhì)粒線性化末端的同源互補(bǔ)序列。
表4設(shè)計構(gòu)建pGBKT7表達(dá)載體引物
引物名稱 引物序列
pGBKT7-CsNAC56-F <![CDATA[5’-<u>CATGGAGGCCGAATTC</u>ATGGAGAGCACCGACTCCT-3’]]>
pGBKT7-CsNAC56-R <![CDATA[5’-<u>GCAGGTCGACGGATCC</u>TTATGAATACCAGTGCATTCC-3’]]>
注：下劃線代表載體同源序列
(2)pGBKT7質(zhì)粒雙酶切
使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系包括2.0μL 10×Buffer E、1.0μg pGBKT7質(zhì)粒、1.0μL EcoRI(12U/μL)、1.0μL BamH I(10U/μL)、0.2μL BSA，超純水補(bǔ)足體積至20μL，反應(yīng)條件：37℃，6h；
通過電泳檢測雙酶消化的結(jié)果，并通過凝膠回收試劑盒回收消化的質(zhì)粒，并對凝膠回收結(jié)果進(jìn)行電泳以確定濃度。
(3)CsNAC56基因與pGBKT7載體(雙酶切后的質(zhì)粒)的連接反應(yīng)
使用In-Fusion連接體系，In-Fusion連接體系具體為0.2～0.4μg pGBKT7 vector(SmaI)、1.5μL CsNAC56膠回收片段、5μL 2×Assembly Master Mix，并使用dd H2O補(bǔ)足至10μL。反應(yīng)條件：50℃，15min。
(4)連接產(chǎn)物的大腸桿菌轉(zhuǎn)化和鑒定
將上述步驟獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，在LB固體平板上(含有50mg/L卡那霉素)進(jìn)行篩選，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測。檢測用CsNAC56的基因引物(表4)。檢測到成功的克隆，將菌液送至北京華大基因進(jìn)行測序驗證。
四、雙雜交研究CsNAC56及缺失片段轉(zhuǎn)錄激活活性
(1)酵母感受態(tài)細(xì)胞制備
步驟一：將Y2H酵母菌在YPDA固體培養(yǎng)基上劃線，并在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d，在10mLYPDA液體培養(yǎng)基中挑取單個克隆并搖動過夜(30℃，220rpm)；
步驟二：取步驟一得到的10μL菌液置于50mLYPDA液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)約18h，直至OD600達(dá)到0.4-0.5；
步驟三：將步驟二得到的菌液置于50mL無菌的離心管中，室溫下1000g離心10min，棄去上清液，將下層細(xì)胞重懸于30mL無菌去離子水中；
步驟四：離心，沉淀細(xì)胞，棄去上清液，用1.5mL的1.1×TE/LiAc重懸細(xì)胞，將懸浮液分裝到2mL離心管中；
步驟五：高速離心15s，棄去上清液，用600μL的1.1×TE/LiAc重懸菌體，置于冰上，感受態(tài)細(xì)胞制備完成。
(2)酵母細(xì)胞的小量轉(zhuǎn)化
步驟一：取兩個預(yù)先冷卻的1.5mL離心管(一個pGBKT7-CsNAC56實驗組，一個pGBKT7對照組)，按體系加入：
Y2H感受態(tài)細(xì)胞50μL
pGBKT7-CsNAC56(or pGBKT7)100ng
變性鯡魚精DNA(10μg/μL)5μL
輕柔混勻；
步驟二：向混合體系中加入500μLPEG/LiAc，充分混勻，在30℃下水浴30min(每隔10min混勻一次)；
步驟三：加入DMSO 20μL，混勻，42℃水浴15min(期間每隔5min混勻一次)；
步驟四：高速離心15s，棄上清，1mLYPD Plus Medium重懸菌體；
步驟五：30℃，200rpm震蕩培養(yǎng)30min；
步驟六：高速離心15秒，棄去上清液，將菌體重懸于1mL0.9％ NaCl溶液中；
步驟七：涂平板：將100μL的菌液涂布到直徑為90mm的SD/-Trp上，并在30℃下培養(yǎng)3-5d。
步驟八：平板生長出單克隆后，挑菌于SD/-Trp液體培養(yǎng)基，待菌渾濁后，調(diào)整OD值為1，點點于SD/-Ade/-His/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d，檢測Bait自激活活性。
(3)重組pGBKT7載體轉(zhuǎn)化到酵母Y2H細(xì)胞中
將上述步驟(4)連接產(chǎn)物的大腸桿菌轉(zhuǎn)化和鑒定中構(gòu)建好的含有不同缺失片段的pGBKT7重組載體轉(zhuǎn)化到上述(1)制備的酵母細(xì)胞Y2H中，轉(zhuǎn)化方法同(2)酵母細(xì)胞的小量轉(zhuǎn)化，點點于SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal平板上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d，觀察結(jié)果。
五、結(jié)果與分析
(1)表達(dá)模式分析
為研究CsNAC56是否響應(yīng)非生物脅迫，利用水、300mM Mannitol、100mM NaHCO3、和200mM NaCl處理漢麻幼苗，水處理為對照。利用qRT-PCR來研究CsNAC56基因的表達(dá)。如圖3所示，CsNAC56可以響應(yīng)多種非生物脅迫，在NaHCO3處理下，其表達(dá)量最高，是水處理的11倍；在甘露醇及NaCl處理下的表達(dá)量分別是對照處理的6倍及9倍。以上結(jié)果表明在葉中CsNAC56能夠積極響應(yīng)多種非生物逆境脅迫，很可能在不同逆境途徑的交叉信號途徑中發(fā)揮作用。
(2)CsNAC56的亞細(xì)胞定位分析
為了進(jìn)一步確定CsNAC56轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞中的定位，通過原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化，在顯微鏡下觀察定位情況。如圖4所示，35S驅(qū)動的GFP蛋白在整個表皮細(xì)胞中都有表達(dá)，而CsNAC56蛋白只在細(xì)胞核中表達(dá)，因此，該蛋白定位于細(xì)胞核。
(3)CsNAC56轉(zhuǎn)錄自激活活性驗證
為驗證CsNAC56是否具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，將CsNAC56 CDS的完整序列克隆到pGBKT7載體中(圖5)。然后將不同的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到Y2H酵母細(xì)胞中并檢測它們的轉(zhuǎn)錄激活活性。所有轉(zhuǎn)化體在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長良好，表明這些構(gòu)建體已成功轉(zhuǎn)化為Y2H細(xì)胞。在含有X-α-Gal的SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基上，攜帶CsNAC56(氨基酸1-393)的全長CDS的細(xì)胞是藍(lán)色的(圖5右下角)，表明CsNAC56的完整CDS具有轉(zhuǎn)錄激活能力。
(4)結(jié)論
通過對CsNAC56表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄自激活活性分析發(fā)現(xiàn)，該基因定位于細(xì)胞核，CsNAC56能夠不同程度的響應(yīng)非生物脅迫，并且全長具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，能夠作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能。
本發(fā)明構(gòu)建的過表達(dá)GFP-CsNAC56載體在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化，對所得菌液進(jìn)行測序得到以下兩個序列
序列1
>gene-LOC115706270 CsNAC56
MESTDSSAGSQQLQNHHQPNLPPGFRFHPTDEELVVHYLKKKVISAPLPVSIIAEVDLYKFDPWELPAKATFGEQEWYFFSPRDRKYPNGARPNRAATSGYWKATGTDKPVLTSGGSQKVGVKKALVFYGGKPPKGIKTNWIMHEYRLAENKAINKPPPGCDLGNKKNSLRLDDWVLCRIYKKNNTNRAVMDHERDQEAMEELLGPMNSNNHNHNHSHNNIPVPHPMGPHNGKLQLLLPKAATLLNYGALNENDHNLFDGMLSNDHANINSNTTNTTNNASLLLPPSSNMSLKRSLIHGLYWPNEIVDDEEAAAAGPLSSSSSKRLQLDDSCTAATTTTSMGEGNQSTSIASLLSQLPNQTASLHQQTMLGALGGSDGLFRGSYQLPGMHWYS*
序列2
>LOC115706270 CsNAC56
ATGGAGAGCACCGACTCCTCCGCCGGTTCCCAACAATTACAGAATCATCATCAGCCAAACCTCCCGCCAGGGTTCCGCTTCCATCCGACCGACGAGGAGCTCGTGGTTCACTATCTCAAGAAGAAGGTTATCTCAGCTCCTCTCCCTGTTTCTATCATCGCCGAAGTCGATCTATACAAGTTTGATCCATGGGAGCTTCCAGCTAAGGCGACGTTTGGAGAACAGGAGTGGTACTTTTTCAGTCCACGAGATCGGAAGTATCCGAACGGAGCCAGGCCCAATCGGGCGGCGACGTCCGGGTACTGGAAGGCAACTGGCACGGATAAGCCTGTATTAACTTCTGGAGGATC
TCAGAAGGTCGGCGTTAAAAAGGCGCTCGTCTTCTATGGCGGTAAACCTCCGAAAGGGATTAAAACCAATTGGATTATGCACGAATACAGACTCGCTGAAAACAAAGCCATAAACAAACCTCCTCCAGGTTGCGATTTGGGCAACAAGAAAAACTCTCTCAGACTTGATGATTGGGTACTGTGTCGAATCTACAAGAAGAACAACACGAATAGGGCAGTGATGGATCACGAGAGGGATCAAGAAGCGATGGAGGAGTTGTTGGGGCCAATGAACAGCAATAATCATAATCACAATCACAGTCATAATAATATTCCAGTACCTCATCCGATGGGCCCACATAATGGCAAGC
TACAACTACTACTACCAAAGGCGGCGACACTACTAAATTATGGGGCGTTGAACGAAAATGACCACAACCTGTTCGATGGAATGCTAAGCAATGATCATGCCAATATTAATAGCAATACAACAAATACTACTAACAATGCTTCACTGCTCTTGCCACCTTCTTCAAATATGTCCCTCAAACGCTCACTCATTCACGGTCTTTACTGGCCCAACGAGATTGTGGACGATGAAGAAGCAGCGGCTGCTGGGCCCTTATCGTCTTCCTCAAGCAAAAGACTGCAACTGGATGATAGTTGTACGGCCGCCACAACGACCACCTCGATGGGCGAGGGAAATCAATCGACTTCAATAGCCTCACTGCTTAGCCAGCTCCCGAACCAAACGGCGTCGTTGCACCAACAGACAATGCTCGGAGCATTGGGGGGATCTGATGGGCTATTCCGGGGATCTTATCAATTGCCCGGAATGCACTGGTATTCATAA
摘自國家發(fā)明專利，發(fā)明人：邊境、張曉艷、田媛、孫凱旋、肖湘、王曉楠、趙越、高宇、王云云、孫宇峰，申請?zhí)枺?/font>202311487666.X，申請日：2023.11.09
