摘  要：SBP (Squamosa promoter binding protein)是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物的生長發(fā)育、次級代謝及形態(tài)建成等過程。為探究工業(yè)大麻SBP基因功能，本研究利用NCBI、ExPASy等網(wǎng)站及Tbtools、MEGA等軟件對CsSBPs家族成員進鑒定和分析。結(jié)果顯示，工業(yè)大麻基因組中共有16個SBP基因，不均勻的分布在7條染色體上，根據(jù)染色體定位信息命名為CsSBP1~CsSBPP16，理化性質(zhì)分析顯示，工業(yè)大麻SBP家族成員氨基酸數(shù)目在171~1053aa之間，相對分子量為19.12~116.71kD，等電點介于5.98~9.57之間；對擬南芥、水稻和工業(yè)大麻SBP蛋白進行聚類分析，51個SBP蛋白被分為11個亞組，16個CsSBPs分布于7個亞組中；在CsSBPs基因啟動子區(qū)域檢測到多個順式作用元件，包含光響應、激素誘導元件、逆境響應元件以及MYB結(jié)合位點，這暗示CsSBPs家族成員可能通過多種途徑影響工業(yè)大麻的生長發(fā)育及逆境應答過程。

關鍵詞：工業(yè)大麻；SBP 轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學分析

 

大麻(Cannabis sativa L.)為大麻科(Cannabinaceae)、大麻屬(Cannabis Linn.)一年生草本植物，是傳統(tǒng)藥物和紡織纖維的重要來源，在中國有著悠久的栽培歷史(車野等，2022)。按照國際規(guī)定，具有精神活性的毒性成分四氫大麻酚(tetrahydrocannabionl，THC)含量低于0.3%則被稱為工業(yè)大麻(趙浩含等，2020)。由于工業(yè)大麻所含THC含量極低，已不具備毒品利用價值，使其在醫(yī)藥、食品、紡織等領域的經(jīng)濟利用價值得到充分挖掘與發(fā)揮(張曉艷等，2020)。目前，在中國云南、黑龍江兩省已經(jīng)實現(xiàn)工業(yè)大麻種植加工合法化。

大麻素是大麻植物特有的次生代謝物質(zhì)，截止目前，已經(jīng)分離鑒定出至少115種大麻素(王椿清等，2022)。大麻素的種類不同，精神活性差異較大。相較于THC，大麻二酚(cannabichromene，CBD)不具精神活性和依賴性，其相關制品也具有更高的安全性(Boggs et al.，2018)。相關研究證實，CBD能夠治療多種人類疾病，如調(diào)解免疫、止痛、鎮(zhèn)靜等(Stasi?owicz et al.，2021)。但高CBD的工業(yè)大麻品種在中國十分匱乏，且工業(yè)大麻多為雌雄異株異花授粉作物，天然雜交率較高，在使育種工作量提高的同時也提升了育種難度。因此，應進一步在分子水平上解析工業(yè)大麻生長發(fā)育特性及遺傳作用機理，為工業(yè)大麻種質(zhì)資源創(chuàng)新提供新思路、新路徑。

SBP (Squamosa promoter binding protein)基因家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，由于能夠識別并結(jié)合MADS-box基因SQUAMOSA(SQUA)啟動子而被命名(Huijser et al.，1992)，該家族基因廣泛參與植物的生長發(fā)育及形態(tài)建成(Gou et al.，2011)。如最先在金魚草中被發(fā)現(xiàn)并克隆的SBP1和SBP2基因，在花序形成和發(fā)育過程中表達量增加(Preston and Hileman，2010; Shao et al.，2019)；擬南芥中，AtSPL8參與調(diào)控花粉囊的發(fā)育(Xing et al.，2013)，過量表達AtSPL9和AtSPL10均可以延長間隔期，降低葉片生成速率，最終導致葉片數(shù)量減少，葉面積增加(Wang et al.，2008)。目前，在擬南芥(Cardon et al.，1999)、水稻(Xie et al.，2006)、葡萄(崔夢杰等，2018)、蘋果(張曉輝，2014)、大豆和蒺藜苜蓿(李月穎等，2017)等多種植物中鑒定到SBP轉(zhuǎn)錄因子。但關于工業(yè)大麻中SBP家族基因的分析及研究均未見報道。本研究利用生物信息學方法對工業(yè)大麻SBP基因家族進行全基因組鑒定，并對其基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、順式作用元件、系統(tǒng)進化進行分析，為進一步研究工業(yè)大麻SBP家族基因功能奠定基礎。

 

1結(jié)果與分析

1.1大麻SBP基因的鑒定和理化性質(zhì)分析

大麻全基因組共鑒定獲得大麻SBP基因16個，理化性質(zhì)分析顯示，CsSBPs基因編碼的氨基酸數(shù)量在171(CsSBP7/10)~1053(CsSBP16)aa之間；相對分子量為19.12(CsSBP7)~116.71(CsSBP 16)kDa；等電點在5.98(CsSBP15/14)~9.57(CsSBP10)；亞細胞定位分析顯示：CsSBP3定位于葉綠體，CsSBP12和CsSBP13定位于細胞質(zhì)膜外，推測兩者在功能上更為接近，其余CsSBPs均定位于細胞核(81.25%)，表明該家族基因主要在細胞核內(nèi)發(fā)揮功能。

表1 CsSBPs基因及編碼蛋白的基本特征

  

  

  

圖1 工業(yè)大麻SBP基因在染色體上的位置

1.2擬南芥、水稻與工業(yè)大麻SBP家族蛋白聚類分析

為進一步闡明工業(yè)大麻SBP家族成員間的系統(tǒng)進化關系，本研究以模式植物擬南芥、水稻和工業(yè)大麻SBP蛋白進行聚類分析(圖2)。結(jié)果顯示，51個SBP家族成員分為11個亞組(Group1~11)，其中Group2、3、6、10中均沒有工業(yè)大麻SBP家族基因分布，Group11中有7個CsSBP成員，數(shù)量最多。除CsSBP16獨立形成分支外，其他CsSBP基因多與擬南芥SBP蛋白同處一個分支，這表明兩者親緣關系更近。

  

圖2 擬南芥，水稻，工業(yè)大麻SBP家族成員系統(tǒng)進化樹

1.3工業(yè)大麻SBP基因的共線性分析

為進一步了解大麻SBP基因的進化機制，體用TBtools構(gòu)建了大麻與擬南芥、水稻的SBP家族共線性關系圖譜(圖3)，工業(yè)大麻與擬南芥有5對同源基因，與水稻有4對同源基因。這與系統(tǒng)進化分析的結(jié)果一致。

  

圖3 擬南芥，水稻和工業(yè)大麻SBP基因共線性分析

1.4工業(yè)大麻SBP基因結(jié)構(gòu)及Motif分析

利用Tbtools中Gene structure view程序?qū)I(yè)大麻SBP家族的進化關系、Motif、UTR、CDS進行可視化分析(圖4)。結(jié)果顯示，16個工業(yè)大麻SBP蛋白序列共鑒定出8種不同的保守基序，除CsSBP10外的15個CsSBPs基因均含有Motif 1 (Zn-1結(jié)構(gòu)＋部分Zn-2)；除CsSBP10外，其余成員均具有Motif 2部分(部分Zn-2＋NLS)；另外，在CsSBP12、CsSBP15、CsSBP14的N-端所含的Motif結(jié)構(gòu)相同，這與蛋白聚類結(jié)果一致；CsSBP13中含有兩個Motif 6。所有家族成員均含有內(nèi)含子，數(shù)目為2~10個。

  

圖4 CsSBPs基因結(jié)構(gòu)及Motif

1.5工業(yè)大麻CsSBP家族基因啟動子順式作用元件分析

以工業(yè)大麻SBP家族基因轉(zhuǎn)錄起始位點ATG上游2000 bp作為啟動子區(qū)進行順式作用元件預測分析，并利用Tbtools進行可視化。結(jié)果顯示，家族成員除包含必須的CAAT-box、TATA-box核心元件外，還包含多個與非生物脅迫相關的的順式作用元件，如低溫、干旱、厭氧誘導等。此外還有多種激素類響應元件，如赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸及生長素等。在CsSBP5、CsSBP12、CsSBP14、CsSBP15中還含有參與類黃酮合成基因調(diào)控元件，此外，CsSBP1與CsSBP2及CsSBP14與CsSBP15兩對基因可能由于進化關系較近，所含順式作用元件也基本一致。

  

圖5 大麻CsSBPs基因啟動子區(qū)順式作用元件

注: A: MYB結(jié)合位點-參與干旱誘導; B: 赤霉素響應元件; C: 低溫響應元件；D: 厭氧誘導響應元件; E: 防御與脅迫應答元件; F: 生長素響應元件; G: 茉莉酸甲酯響應元件; H: 脫落酸響應元件; I: 水楊酸響應元件; J: 光響應元件; K: 調(diào)控分生組織表達的元件; L: MYB結(jié)合位點-參與類黃酮生物合成; M: 厭氧誘導增強子元件; N: MYB結(jié)合位點-參與光響應; O: 參與生長素的順式作用元件

 

2討論

轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物生長發(fā)育過程中非常重要的調(diào)控方式之一，轉(zhuǎn)錄因子可以通過靶向作用于下游基因啟動子區(qū)的順式作用元件，來控制下游基因的表達，參與逆境應答和生長發(fā)育(王超群等，2019)。隨著科學技術的不斷進步，越來越多的轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)與研究。SBP轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的重要轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育、逆境響應以及次級代謝等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

本研究首次利用生物信息學方法，在大麻基因組中篩選鑒定出16個CsSBP家族成員，16個成員不均勻的分布在7條染色體上。擬南芥、水稻和大麻SBP家族基因聚類分析顯示，51個SBP蛋白被分為11個亞組(Group1-11)，CsSBPs分布于7個亞組中(Gruop1，4，5，7，8，9，11)，其中Group11中分布的大麻SBP蛋白最多。值得關注的是CsSBP16單獨聚為一類，這暗示其生物學功能與其他成員可能有所差異。Motif分析顯示該家族成員除CsSBP10外的所有成員均含有Motif 1和Motif 2，說明CsSBPs具有一定程度的保守性。研究基因啟動子的結(jié)構(gòu)、功能和作用機制一直是解析基因調(diào)控模式和信號傳遞途徑的有效途徑之一(李濯雪等，2015)。在16個工業(yè)大麻SBP基因家族成員的啟動子區(qū)域檢測到多個順式作用元件，包含多個光響應元件、激素誘導元件、逆境響應元件以及MYB結(jié)合位點，表明CsSBPs家族成員可能參與大麻光周期變化、生長發(fā)育和逆境響應，并介導多種激素。這與銀杏(萇棒，2021)、谷子(杜曉芬等，2021)、杜仲(韋德蘭等，2022)的研究結(jié)果一致。

本研究通過生物信息學方法對工業(yè)大麻SBP家族轉(zhuǎn)錄因子進行全基因組鑒定，對染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序及順式作用元件進行預測分析，以期為工業(yè)大麻分子育種提供理論基礎，但目前該家族基因功能尚未解析，仍需進一步深入研究。

 

3材料與方法

3.1工業(yè)工業(yè)大麻SBP基因的鑒定

從NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載工業(yè)大麻基因組序列文件、基因組注釋文件。以擬南芥SBP蛋白序列作為參考序列，利用TBtools軟件進行雙向BLAST比對，刪除重復項，再利用NCBI protein blast功能對所獲得的SBP基因家族序列進行進一步的鑒定和確認。利用ExPASy在線工具與CellPLoc 2.0，分析預測工業(yè)大麻SBP基因家族成員的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點及亞細胞定位信息。

3.2工業(yè)大麻SBP家族基因的染色體定位分析

通過工業(yè)大麻基因組GFF注釋文件，獲得CsSBPs基因的位置信息，利用Tbtools軟件進行染色體定位可視化。

3.3工業(yè)大麻SBP基因家族聚類分析

下載擬南芥和水稻兩個物種的SBP蛋白序列，利用Clustal W軟件進行工業(yè)大麻與擬南芥、水稻SBP家族蛋白的多序列比對，采用MEGA-X最近鄰接法(nearest Nneighbor interactions， NNI)進行聚類分析，利用在線網(wǎng)站iTOL (http://itol.embl.de)進行美化。

3.4工業(yè)大麻SBP家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEGA-X(最近鄰接法)為工業(yè)大麻SBP家族蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹；以工業(yè)大麻基因組數(shù)據(jù)為基礎，使用Tbtools分析工業(yè)大麻SBP基因家族的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)；采用MEME在線網(wǎng)站獲得Motif分析數(shù)據(jù)。利用Tbtools的Gene Structure View (advanced)工具將上述分析進行可視化。

3.5工業(yè)大麻SBP基因啟動子順式作用元件分析

利用Tbtools提取大麻SBP家族基因起始密碼子ATG上游2 000 bp序列，通過PlantCARE在線程序獲取其順式作用元件分布情況，并利用Tbtools進行可視化。

參考文獻

[1] Boggs D.L., Nguyen J.D., and Morgenson D., 2018, Clinical and preclinical evidence for functional interactions of cannabidiol and Δ9-tetrahydrocannabinol, Neuropsychopharmacology, 43(1): 142-154.

[2] Cardon G., Ho¨hmann S., Klein J., Nettesheim K., Saedler H., and Huijser P., 1999, Molecular characterisation of the Arabidopsis SBP-box genes, Gene, 237(1): 91-104.

[3] Chang B., 2021, Bioinformatics analysis of Ginkgo SBP box gene family and functional research of GbSBP1/9/13, Thesis for M.S., Yangzhou University, Supervisor: Jin B., pp.12-36. (萇棒, 2021, 銀杏SBP-box基因家族生物信息學分析及GbSBP1/9/13功能研究, 碩士學位論文, 揚州大學, 導師:金飚, pp.12-36.)

[4] Che Y., Guo L., Wang M.Z., Li Z.Y., Zhang L., Jiang Z.Y., and Jie S.Y., 2022, The development status and existing problems of industrial cannabis in China, Heilongjiang Nongye Kexue (Heilongjiang Agricultural Science), 339(9): 105-110. (車野, 郭麗, 王明澤, 李澤宇, 張玲, 姜澤宇, 接思源, 2022, 我國工業(yè)大麻發(fā)展現(xiàn)狀及存在的問題, 黑龍江農(nóng)業(yè)科學, 339(9): 105-110.)

[5] Cui M.J., Wang C., Leng X.P., Wu W.M., Tang W., Zhang W.Y., Zhu X.D., Jia H.F., Shen W.B., and Fang J.G., 2018, Bioinformatics analysis of the SBP-box transcription factor family in grapes and its response to hormone regulation of grape fruit ripening. Nanjing Nongye Daxue Xuebao (Journal of Nanjing Agricultural University), 41(3): 429-439. (崔夢杰, 王晨, 冷翔鵬, 吳偉民, 湯崴, 張文穎, 朱旭東, 賈海鋒, 沈文飚, 房經(jīng)貴, 2018, 葡萄SBP-box轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學分析及其應答激素調(diào)控葡萄果實成熟的作用, 南京農(nóng)業(yè)大學學報, 41(3): 429-439.)

[6] Du X.F., Han K.N., Li Y.X., Wang Z.L., Lian S.C., and Wang J., 2021, Expression analysis of SBP transcription factor family genes in foxtail millet, Shanxi Nongye Kexue (Shanxi Agricultural Science), 49 (12): 1474-1482. (杜曉芬, 韓康妮, 李禹欣, 王智蘭, 連世超, 王軍, 2021, 谷子SBP轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達分析, 山西農(nóng)業(yè)科學, 49(12): 1474-1482.)

[7] Gou J.Y., Felippes F.F., Liu C.J., Weigel D., and Wang J.W., 2011, Negative regulation of anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis by a miR156-Targeted SPL transcription factor, The Plant Cell, 23(4) : 1512-1522.

[8] Huijser P., Klein J., Lönnig W.E., Meijer H., Saedler H., and Sommer H., 1992, Bracteomania, an inflorescence anomaly, is caused by the loss of function of the MADS-box gene squamosa inAntirrhinum majus, The EMBO Journal, 11(4): 1239-1249.

[9] Li Y.Y., Li J., and Liu C.N., 2017, Genome wide analysis of SBP box transcription factor gene family inMedicago truncatula, Hunan Shifan Daxue Zirang Kexue Xuebao (Journal of Natural Science of Hunan Normal University), 40(6): 24-33, 95. (李月穎, 李菁, 劉長寧, 2017,蒺藜苜蓿SBP-box轉(zhuǎn)錄因子基因家族全基因組分析, 湖南師范大學自然科學學報, 40(6):24-33+95.)

[10] Li Z.X., and Chen X.B., 2015, Research progress on plant inducible promoters and related cis acting elements, Shengwu Jishu Tongbao (Biotechnology Bulletin), 31(10): 8-15. (李濯雪, 陳信波, 2015, 植物誘導型啟動子及相關順式作用元件研究進展, 生物技術通報, 31(10): 8-15.)

[11] Preston J.C., and Hileman L.C., 2010, SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN 1 initiates flowering inAntirrhinum majus through the activation of meristem identity genes, The Plant Journal, 62(4): 704-712.

[12] Shao Y.L., Zhou H.Z., Wu Y.R., Zhang H., Lin J., Jiang X.Y., He Q.J., Zhu J.S., Li Y., Yu H., and Mao C.Z., 2019, OsSPL3, an SBP-domain protein, regulates crown root development in rice, The Plant Cell, 31(6): 1257-1275.

[13] Stasi?owicz A., Tomala A., Podolak I., and Cielecka-Piontek J., 2021,Cannabis sativa L. as a natural drug meeting the criteria of a multitarget approach to treatment, Int. J. Mol. Sci., 22(2): 778.

[14] Wang C.Q., Liang Y.C., Chen S.L., Li M.Z., and Dong L.L., 2019. Molecular genetic mechanism of stress resistance in medicinal plants, Zhongguo Xiandai Zhongyao (Modern Chinese Medicine), 21(11): 1445-1455. (王超群, 梁乙川, 陳士林, 李孟芝, 董林林, 2019, 藥用植物抗逆性反應的分子遺傳機制研究, 中國現(xiàn)代中藥, 21(11): 1445-1455.)

[15] Wang C.Q., Zhang Y.Y., Li Q., Du L.N., and Jin G.Y., 2022, Research progress on pharmacological effects and structure-activity relationships of common cannabinoids, Zhongguo Yaowu Jingjie (China Pharmacovigilance), 19(12): 1388-1392. (王椿清, 張圓圓, 李倩, 杜麗娜, 金光義, 2022, 常見大麻素類化合物藥理作用及構(gòu)效關系研究進展, 中國藥物警戒, 19(12): 1388-1392.)

[16] Wang J.W., Schwab R., Czech B., Mica E. and Weigel D., 2008, Dual effects of miR156-targeted SPL genes and CYP78A5/KLUH on plastochron length and organ size inArabidopsis thaliana, The Plant Cell, 20(5): 1231-1243.

[17] Wei D.L., Zhang B.H., Yao X.Z., Liu Y.G., and Lü L.T., 2022, Identification of Eucommia ulmoides SBP box gene family and expression analysis under non Biotic stress, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 20(5): 1505-1513. (韋德蘭, 張寶會, 姚新轉(zhuǎn), 劉洋, 呂立堂, 2022, 杜仲SBP-box基因家族鑒定及非生物脅迫下表達分析, 分子植物育種, 20(5): 1505-1513.)

[18] Xie K.B., Wu C.Q., and Xiong L.Z., 2006, Genomic organization, differential expression, and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice , Plant Physiology, 142(1): 280-293.

[19] Xing S.P., Salinas M., Garcia-Molina A., Höhmann S., Berndtgen R., and Huijser P., 2013, SPL8 and miR156-targetedSPL genes redundantly regulate Arabidopsis gynoecium differential patterning, Plant Journal, 75(4): 566-577.

[20] Zhang X.H., Wei X.C., Li X.X., Sun Y.Y., Wang G., Chang Z.J., Liu G.Q., Qiu Y., Song J.P., Wang H.G., Shen D., Wang D.J., and Han Y.P., 2014, Apple genome wide SBP box gene family analysis and molecular cloning of representative members, Yuanyi Xuebao (Journal of Horticulture), 41(2): 215-226. (張曉輝, 魏小春, 李錫香, 孫玉燕, 王冠, 常兆晶, 劉冠群, 邱楊, 宋江萍, 王海平, 沈鏑, 王大江, 韓月澎, 2014, 蘋果全基因組SBP-box基因家族分析及代表成員的分子克隆, 園藝學報, 41(2): 215-226.)

[21] Zhang X.Y., Wang X.N., Cao K., and Sun Y.F., 2020, Correlation analysis of fiber yield and yield components of five industrial hemp varieties (strains), Zuowu Zazhi (Journal of Crops), (4): 121-126. (張曉艷, 王曉楠, 曹焜, 孫宇峰, 2020, 5個工業(yè)大麻品種(系)纖維產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素的相關性分析, 作物雜志, (4): 121-126.)

[22] Zhao H.H., Chen J.K., and Xiong H.P., 2020, Research on Innovative Development Strategies of China's Industrial Cannabis Seed Industry, Nongye Xiandaihua Yanjiu (Agricultural Modernization Research), 41(5): 765-771. (趙浩含, 陳繼康, 熊和平, 2020,中國工業(yè)大麻種業(yè)創(chuàng)新發(fā)展策略研究, 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究, 41(5): 765-771.)

 

文章摘自：楊威,車野,王明澤,等.工業(yè)大麻SBP家族轉(zhuǎn)錄因子全基因組鑒定及分析[J/OL].分子植物育種:1-8[2024-05-07].http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20240423.1725.015.html.