摘  要：漢麻花葉用乙醇浸泡提取后的殘?jiān)?jīng)過水提醇沉后，得到漢麻多糖-I，水相濃縮至小體積用乙酸乙酯萃取后，水層直接減壓濃縮得到漢麻多糖-II，乙酸乙酯萃取后的水層繼續(xù)用正丁醇萃取，減壓濃縮得到漢麻多糖-III。用苯酚-硫酸法對(duì)3種漢麻多糖進(jìn)行多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定，并進(jìn)行DPPH、ABTS、羥基、超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，3種漢麻多糖對(duì)DPPH清除率和ABTS清除率都有良好的效果，漢麻多糖-II抗氧化活性最強(qiáng)，清除DPPH、ABTS、羥基、超氧陰離子自由基率的IC₅₀分別為0.012，0.043，0.138，1.857mg/mL。 

關(guān)鍵詞：漢麻花葉；多糖；抗氧化 

漢麻（Cannabis sativa L.）為?？拼舐閷僖荒晟荼局参?，又被稱為火麻、寒麻、線麻和魁麻等^[1]。致幻成分四氫大麻酚（THC）含量＜0.3%的非毒品利用價(jià)值的漢麻可以被大規(guī)模種植及加工利用^[2]。漢麻的纖維、籽粒、稈芯、花、葉和根一般都是紡織、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的重要來源。近幾年，我國(guó)漢麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展十分迅速，年產(chǎn)量平均增長(zhǎng)25%^[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，漢麻具有抗癲癇、抗抑郁及抗氧化等生物活性^[4]。但根據(jù)現(xiàn)有的漢麻提取加工技術(shù)，加工后殘余物中含有大量的漢麻多糖^[5]，據(jù)報(bào)道漢麻多糖具有抗氧化、保濕、抑菌^[6]等多種功效。因此，開發(fā)一種可以合理利用漢麻花葉殘?jiān)?，?shí)現(xiàn)資源高值化回收利用的方法具有重要意義。 1  實(shí)驗(yàn)部分

 

1.1 材料與儀器

乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、過氧化氫、鄰苯三酚、硫酸亞鐵均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水楊酸、抗壞血酸均為分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基>97.0%）、ABTS（2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽>98.0%），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。漢麻花葉由齊齊哈爾市塔哈鄉(xiāng)大馬崗村提供，采集后切碎晾干保存。SpectraMaxD3/iD5多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司。 

1.2 提取物的制備

取30.0kg干燥的漢麻花葉，加120.0L乙醇室溫浸泡3d后過濾，重復(fù)2次，得到濾渣。取干燥后的濾渣5.0kg，加入50.0L水，100℃加熱提取1h后過濾，重復(fù)2次，合并提取液并減壓濃縮至5.0L。常溫下向濃縮液中加入15.0L 95%乙醇，攪拌后放置沉淀12h后抽濾，得濾餅和濾液。濾餅為漢麻多糖-I。將濾液減壓濃縮至5.0L，每次用5.0L乙酸乙酯萃取2次，取水層3.0L減壓濃縮至恒重得到乙酸乙酯萃取后的水溶物（漢麻多糖-II），剩余的2.0L濾液每次用2.0L正丁醇萃取2次，將得到的水層減壓濃縮至恒重，得到正丁醇萃取后的水溶物（漢麻多糖-III）。

 

1.3 多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)^[7]，將配制好的0.10mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水稀釋為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10mg/mL的溶液，并標(biāo)記離心管編號(hào)1～10，分別在每支離心管中加入5%苯酚和濃硫酸，然后將離心管放入沸水煮30min后取出，分別從每支離心管中取2.0mL加入比色皿。最后，空白對(duì)照為同樣處理后的蒸餾水，標(biāo)記為0，用紫外分光光度計(jì)，在490nm處測(cè)定樣品的吸光度，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

1.3.2 多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

分別取3種漢麻多糖配制成0.10mg/mL樣品溶液。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法加入5%苯酚和濃硫酸，煮沸后，在490nm處測(cè)定其吸光度，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，將所得的吸光度代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出3種漢麻多糖中多糖質(zhì)量濃度ρ，計(jì)算3種漢麻多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)=（1）

式中：ρ為3種樣品中多糖質(zhì)量濃度；V為3種樣品體積（mL）；m為3種樣品質(zhì)量（mg）。

 

1.4 抗氧化活性測(cè)試

1.4.1 DPPH自由基清除率

根據(jù)文獻(xiàn)^[8]，分別取3種漢麻多糖配制成10.00mg/mL樣品溶液，稀釋濃度為0.01，0.025，0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mg/mL，從稀釋后的3種樣品溶液與提前配制好的DPPH乙醇溶液等比例混合后在28℃避光反應(yīng)30min。在517nm處測(cè)定樣品的吸光度A₁；對(duì)照組是以無水乙醇代替DPPH溶液，測(cè)定相應(yīng)的吸光度A₂；空白組是以無水乙醇代替樣品溶液，測(cè)定相應(yīng)的吸光度A₀。V_c作為陽(yáng)性對(duì)照，按上述方法測(cè)定DPPH自由基清除率。 1.4.2 ABTS自由基清除率

根據(jù)文獻(xiàn)^[9]，分別取3種漢麻多糖配制成10.00mg/mL樣品溶液，進(jìn)行稀釋（與1.4.1一致），精確量取稀釋后的3種樣品溶液0.8mL，加入提前配制好的ABTS乙醇溶液3.2mL，混合均勻后在25℃下避光反應(yīng)10min。在734nm處測(cè)定樣品的吸光度A₁；對(duì)照組是精確量取稀釋后的樣品溶液0.8mL與3.2mL無水乙醇混合，測(cè)定相應(yīng)的吸光度A₂；空白組是ABTS乙醇溶液與無水乙醇等比例混合，測(cè)定相應(yīng)的吸光度A₀。V_c作為陽(yáng)性對(duì)照，按上述方法測(cè)定ABTS自由基清除率。

 

1.4.3 羥基自由基清除率

根據(jù)文獻(xiàn)^[10-11]，分別取3種漢麻多糖配制成10.00mg/mL樣品溶液，進(jìn)行稀釋（與1.4.1一致），精確量取稀釋后的樣品溶液、9mmol/L水楊酸乙醇溶液和9mmol/L硫酸亞鐵溶液各0.5mL，混合均勻，加入8.8mmol/L雙氧水溶液0.5mL，在37℃下反應(yīng)30min。在510nm處測(cè)定樣品的吸光度A₁；對(duì)照組用等體積去離子水代替雙氧水溶液，測(cè)定相應(yīng)的吸光度A₂；空白組用等體積去離子水代替樣品溶液，測(cè)定相應(yīng)的吸光度A₀。V_c作為陽(yáng)性對(duì)照，按上述方法測(cè)定羥基自由基清除率。

 

1.4.4 超氧陰離子自由基清除率

根據(jù)文獻(xiàn)^[12-13]，分別取3種漢麻多糖配制成10.00mg/mL樣品溶液，進(jìn)行稀釋，（與1.4.1一致），在25℃的水浴鍋中預(yù)熱配制好的Tris-HCl緩沖液20min。取預(yù)熱后的Tris-HCl緩沖液4.5mL，再加入稀釋后的樣品溶液各1.0mL和25mmol/L鄰苯三酚溶液0.4mL。混合后的溶液在25℃水浴中反應(yīng)4min，然后加入8%鹽酸溶液1.0mL終止反應(yīng)，在320nm處測(cè)定樣品的吸光度A₁；對(duì)照組用去離子水代替鄰苯三酚溶液，測(cè)定相應(yīng)的吸光度A₂；空白組用去離子水代替樣品溶液，測(cè)定相應(yīng)的吸光度A₀。V_c作為陽(yáng)性對(duì)照，按上述方法測(cè)定超氧陰離子自由基清除率。

 

1.4.5 自由基清除率和 IC₅₀值的計(jì)算

DPPH、ABTS、羥基、超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式為

清除率=（2）

式中：A₀為空白組吸光度值；A₁為樣品組吸光度值；A₂為對(duì)照組吸光度值。

采用IBM SPSS Statistics對(duì)各濃度所對(duì)應(yīng)的清除率進(jìn)行分析計(jì)算，得出不同自由基清除率的IC₅₀值。

 2  結(jié)果與討論

 

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過苯酚-硫酸法測(cè)得葡萄糖的吸光度，結(jié)果如表1所示。以葡萄糖濃度為x軸，吸光度為y軸，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=16.0809x+0.04514，相關(guān)系數(shù)為R²=0.999，表明兩者存在較好的線性關(guān)系。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度測(cè)定數(shù)值表

  

 2.2 3種漢麻多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

對(duì)3種漢麻多糖中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，乙酸乙酯萃取后的水層（漢麻多糖-II）中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次是正丁醇萃取后的水層（漢麻多糖-III）和漢麻醇沉產(chǎn)物（漢麻多糖-I）。

表2 3種漢麻多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

  

 

2.3 多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

以V_c為對(duì)照，測(cè)定3種漢麻多糖對(duì)DPPH的清除能力，并計(jì)算IC₅₀值，結(jié)果如表3所示。由表3可知，3種漢麻多糖對(duì)DPPH都具有一定的清除能力，其IC50值從大到小依次為：漢麻多糖-II>V_c>漢麻多糖-III>漢麻多糖-I。其中，漢麻多糖-II在1.00mg/mL濃度下對(duì)DPPH的清除能力達(dá)到90.82%，小于陽(yáng)性對(duì)照Vc。

表3 3種漢麻多糖對(duì)DPPH自由基清除率的IC₅₀值

 

 

2.4 多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力

以V_c為對(duì)照，測(cè)定3種漢麻多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力，并計(jì)算IC₅₀值，結(jié)果如表4所示。由表4可知，3種漢麻多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力從大到小依次為：V_c>漢麻多糖-II>漢麻多糖-III>漢麻多糖-I。其中，漢麻多糖-II在1.00mg/mL濃度下的清除率達(dá)到99.34%，僅次于陽(yáng)性對(duì)照V_c。

表4 3種漢麻多糖對(duì)ABTS自由基清除率的IC₅₀值

  

 

2.5 多糖對(duì)羥基自由基的清除能力

以V_c為對(duì)照，測(cè)定3種漢麻多糖對(duì)羥基自由基的清除能力，并計(jì)算IC₅₀值，結(jié)果如表5所示。3種漢麻多糖對(duì)羥基自由基都具有一定的清除能力，3種漢麻多糖對(duì)羥基自由基清除能力的IC₅₀值，從大到小依次為：V_c>漢麻多糖-II>漢麻多糖-III>漢麻多糖-I。其中，漢麻多糖-II在1.00mg/mL濃度下的清除率達(dá)到74.52%。

表5 3種漢麻多糖對(duì)羥基自由基清除率的IC₅₀值

  

 

2.6 多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

以V_c為對(duì)照，測(cè)定3種漢麻多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力，并計(jì)算IC₅₀值，結(jié)果如表6所示。3種漢麻多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除能力從大到小依次為：V_c>漢麻多糖-II>漢麻多糖-III>漢麻多糖-I。其中，漢麻多糖-II在1.00mg/mL濃度下的清除率達(dá)到35.18%，小于陽(yáng)性對(duì)照V_c。另外，與前3種相比，3種漢麻多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除能力均較弱。

表6 3種漢麻多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除率的IC₅₀值

   

 

3 結(jié)論

通過苯酚-硫酸法對(duì)3種漢麻多糖進(jìn)行多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定，其中，漢麻多糖-II的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為16.10%。對(duì)3種漢麻多糖進(jìn)行DPPH、ABTS、羥基、超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)，3種漢麻多糖對(duì)DPPH和ABTS清除率都有良好的效果，它們的活性順序?yàn)椋簼h麻多糖-II>漢麻多糖-III>漢麻多糖-I，其中，漢麻多糖-II抗氧化活性最強(qiáng)。利用該特性，可將漢麻多糖應(yīng)用于化妝品和飼料等相關(guān)領(lǐng)域。

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