摘 要:本研究以一氧化氮（NO）為供體，在鹽脅迫條件下研究其對羅布麻葉片生長、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、黃酮類化合物合成的影響。結果表明：在150mmol/LNaCl脅迫下，施用250μmol/LSNP可顯著提高羅布麻葉片PAL活性、黃酮類化合物含量；NO清除劑血紅蛋白（hemoglobin）可抑制鹽脅迫下SNP對羅布麻葉片PAL活性、黃酮類化合物合成的促進作用，說明SNP是通過其分解產物NO影響這些物質的合成。推測在NaCl脅迫下，NO通過促進羅布麻黃酮類物質等次生代謝產物的合成來緩解NaCl脅迫對羅布麻的傷害。
關鍵詞:一氧化氮；羅布麻；鹽脅迫；PAL活性；黃酮類物質
近年來，一氧化氮（NO）在植物耐鹽性方面的作用引起了人們的廣泛關注。已有研究證明，NO在多種植物抗鹽脅迫中發(fā)揮作用[1-2]。在鹽脅迫條件下，用NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）進行預處理，不僅可以促進水稻幼苗生長[3]，還可以促進玉米幼苗生長和增加玉米幼苗的干重[4]。一些研究結果顯示，NO參與環(huán)境脅迫誘導的次生代謝產物的產生[5-6]，說明NO介導的信號通路參與逆境脅迫誘導植物次級代謝產物的生物合成。植物在逆境脅迫下誘導NO合成，繼而通過促進苯丙氨酶解氨酶（PAL）活性的增加來促進次生代謝產物的合成[2，7]。
羅布麻（Apocynum venetum）為夾竹桃科多年生半灌木，具有耐鹽、耐旱等特性。黃酮類化合物是植物體內廣泛存在的一類次生代謝產物，也是羅布麻葉片中的主要活性化合物，已被用于治療心臟病、高血壓等疾病[8-9]，在植物生長發(fā)育及抵御逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用。本研究以羅布麻為材料，以SNP作為NO供體，以血紅蛋白（hemoglobin）作為NO清除劑，研究鹽脅迫下NO對羅布麻黃酮類物質合成的影響及其抗鹽機理，以期為了解羅布麻品質的形成奠定理論基礎。
1材料與方法
1.1試驗材料
2021年6月，在山東第一醫(yī)科大學藥用植物園收集多株羅布麻的主根，剪成長度為5cm的根段，植于育苗缽中培養(yǎng)，1個月后選取長勢基本一致（高約10cm）的羅布麻幼苗移栽至塑料盆中，在溫室條件下培養(yǎng)半個月后用于試驗處理。
1.2試驗方法
分別采用NaCl濃度為0（CK1）、50、100、150、200mmol/L的Hoagland營養(yǎng)液澆灌羅布麻，每天澆灌2次。NaCl脅迫處理16d后取樣，測定羅布麻生物量和黃酮類物質含量，篩選適宜的NaCl脅迫濃度。
用合適濃度的NaCl對羅布麻進行鹽脅迫處理，同時施用NO供體SNP濃度為0（CK2）、50、100、150、200、250、300μmol/L的Hoagland營養(yǎng)液，每隔4d施用一次。SNP處理16d后取樣，用于測定羅布麻葉片的生物量，篩選合適的SNP濃度。
在篩選出合適的NaCl濃度和SNP濃度的基礎上，以血紅蛋白（hemoglobin）作為NO清除劑，設6個處理開展試驗，研究NO對鹽脅迫下羅布麻PAL活性和黃酮類物質含量的影響。6個處理分別為：對照（CK3），施用Hoagland營養(yǎng)液，每隔4d施用一次；SNP處理，施用SNP濃度為250μmol/L的Hoagland營養(yǎng)液，每隔4d施用一次；HG處理，施用血紅蛋白濃度為0.1%的Hoagland營養(yǎng)液，每隔4d施用一次；NaCl處理，施用NaCl濃度為150mmol/L的Hoagland營養(yǎng)液，每隔4d施用一次；SNP+NaCl處理，施用NaCl濃度為150mmol/L、SNP濃度為250μmol/L的Hoagland營養(yǎng)液，每隔4d施用一次；SNP+NaCl+HG處理，施用NaCl濃度為150mmol/L、SNP濃度為250μmol/L、HG濃度為0.1%的Hoagland營養(yǎng)液，每隔4d施用一次。在處理4d、8d、12d和16d時取樣，用于羅布麻葉片PAL活性和黃酮類物質含量的測定，每個指標重復3次。
1.3測定內容及方法
1.3.1羅布麻生長速率和葉片生物量比測定
將各處理的羅布麻葉片、根、莖于100℃下烘1h，再于80℃下烘至恒重。每個重復3株，按如下方法計算葉片生物量比：
葉片生物量比（%）=葉片生物量/總生物量×100。
1.3.2 PAL活性測定
取羅布麻葉片，按1∶2（質量體積比）的比例加入提取液（50mmol/LpH值8.0的Tris-HC1緩沖液，4mmol/LEDTA，l0mmol/L巰基乙醇，1μmol/L亮抑蛋白酶肽），冰浴研磨，4℃下10000r/min離心15min。取上清液1mL，按郝崗平等[2]的方法測定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，將A290變化0.01所需酶量計為1個酶活性單位（U）。
1.3.3羅布麻葉片總黃酮含量測定
準確稱取1g烘干樣品，置于索氏提取器中，用甲醇浸提8h，黃酮類化合物的提取和測定方法參照郝崗平等[2]的方法。以蘆丁為標樣測定黃酮類物質的含量，經比色液顯色之后，在510nm下比色測定吸光度值（A），按照標準曲線計算總黃酮含量。
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法
使用Excel2019和SPSS26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和處理。使用One-WayANOVA比較不同處理間各項指標的差異。
2結果與分析
2.1鹽脅迫對羅布麻葉片生物量比和黃酮類物質含量的影響
鹽脅迫對羅布麻生長狀態(tài)的影響采用葉片生物量比的指標來表示。試驗結果顯示，不同鹽脅迫處理之間羅布麻葉片生物量比存在差異，且隨著鹽濃度的增加，葉片生物量比逐漸降低。由圖1可以看出，當鹽濃度增加到100mmol/L時，葉片生物量比與CK1差異顯著（P<0.05）。
圖1 鹽脅迫對羅布麻葉片生物量比的影響
注：圖柱上不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。下同。
隨著鹽濃度的增加，羅布麻葉片中黃酮類物質的含量總體呈增高趨勢，表明鹽脅迫可誘導羅布麻葉片中黃酮類物質的合成。當NaCl濃度為100~200mmol/L時，羅布麻葉片中黃酮類物質的含量與CK1差異達到顯著水平（P<0.05）。其中，在150mmol/LNaCl脅迫下，黃酮類物質的含量最高（圖2）。因此，選取150mmol/LNaCl作為鹽脅迫濃度開展外源施用SNP試驗。
圖2 鹽脅迫對羅布麻葉片中黃酮類物質含量的影響
2.2外源SNP對羅布麻葉片生物量積累速率的影響
由圖3可以看出，在150mmol/LNaCl脅迫處理下，施加不同濃度的SNP可以不同程度地提高羅布麻葉片的生物量積累速率。其中，當SNP濃度達到150~300μmol/L時，羅布麻葉片的生物量積累速率與CK2之間差異達到顯著水平（P<0.05），以250μmol/LSNP處理羅布麻葉片的生物積累速率最高。故以下試驗選用250μmol/LSNP作為外源NO處理濃度。
圖3 SNP對鹽脅迫下羅布麻葉片生物量積累速率的影響
2.3 NO對鹽脅迫下羅布麻葉片PAL活性的影響
苯丙氨酸解氨酶（PAL）作為苯丙烷代謝途徑的關鍵酶之一，對黃酮類物質合成起關鍵作用。由圖4可以看出：鹽脅迫第8天時，SNP處理羅布麻葉片PAL活性升高，但與CK3差異不顯著；SNP+NaCl處理促進了羅布麻葉片PAL活性的增加，達到180.6nmol/（mg·h），顯著高于其他處理（P<0.05）；NaCl處理羅布麻葉片PAL活性為141.1nmol/（mg·h），與CK3差異顯著（P<0.05）；SNP處理羅布麻葉片PAL活性較CK3有一定程度的升高，但差異不顯著；SNP+NaCl+HG處理羅布麻葉片PAL活性較CK3升高，但較SNP+NaCl處理顯著降低（P<0.05）。說明SNP來源的NO促進了鹽脅迫下羅布麻葉片PAL活性的升高。
圖4 不同處理羅布麻葉片PAL活性
2.4 NO對鹽脅迫下羅布麻黃酮類物質的影響
在150mmol/LNaCl脅迫處理下，外源施加SNP處理第4天時，羅布麻葉片中黃酮類物質含量開始增加；第12天時，黃酮類物質為單獨鹽脅迫處理的131%。由圖5可以看出：SNP處理羅布麻葉片中黃酮類物質的含量較CK3略有升高，差異不顯著；HG處理羅布麻葉片中黃酮類物質的含量沒有提高；SNP+NaCl處理羅布麻葉片中黃酮類物質含量最高，與其他處理差異均達到顯著水平（P<0.05）；SNP+NaCl+HG處理羅布麻葉片中黃酮類物質含量顯著高于CK3（P<0.05），但較SNP+NaCl處理顯著降低（P<0.05）。說明血紅蛋白和SNP協(xié)同處理時降低了鹽脅迫下SNP對黃酮物質合成的促進作用，同時也說明鹽脅迫下羅布麻黃酮類物質的促進作用是通過SNP來源的NO介導的。
圖5 不同處理羅布麻葉片中黃酮類物質含量
3結論與討論
近年來，許多研究表明，NO廣泛參與植物抗生物和非生物脅迫應答，如抗鹽堿、耐干旱、抗病等[10-12]。另外，NO也廣泛參與一些藥用植物的次生代謝產物的合成，說明NO可能是通過誘導植物次生代謝產物的合成來提高植物抵抗逆境脅迫的能力[6，13]。本研究結果表明：鹽脅迫可誘導羅布麻黃酮類物質的合成；在鹽脅迫的同時再施用外源NO供體SNP，羅布麻葉片生物量積累速率、PAL活性、黃酮類物質含量等均顯著高于單獨鹽脅迫時的各項指標。在SNP協(xié)同鹽脅迫條件下施用NO清除劑血紅蛋白，可以降低SNP協(xié)同鹽脅迫對羅布麻葉片PAL活性、黃酮類物質合成的促進作用。這些結果表明，SNP來源的NO介導了鹽脅迫下羅布麻次生代謝物質合成。
NO對鹽脅迫下羅布麻葉片中黃酮類物質合成的促進作用可能是由于NO介導了羅布麻對鹽脅迫的系統(tǒng)性防御反應。已有一些研究發(fā)現(xiàn)，逆境脅迫誘導植物NO產生增加，NO又介導植物細胞壁組成物質木質素等的合成，同時NO也參與逆境脅迫下次生代謝產物的合成，這樣通過細胞壁組成物質合成的增加和次生代謝產物的增加來緩解鹽堿、干旱、病原物等逆境脅迫對植物的傷害作用，如NO參與煙草、水稻、擬南芥等植物在鹽堿和病原物脅迫下的防衛(wèi)反應[7，14-15]。推測在NaCl脅迫下，SNP來源的NO通過誘導羅布麻PAL活性升高來提高黃酮類物質的產生，調節(jié)滲透壓，從而緩解鹽脅迫的傷害。這與郝崗平等[2]在銀杏上和楊秀紅等[16]在藥用植物甘草上的研究結果相似，干旱脅迫下NO誘導的銀杏黃酮和鹽脅迫下NO誘導的甘草酸的作用類似于滲透調節(jié)物質，抵抗干旱和鹽堿等逆境脅迫。
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