摘 要：本發(fā)明涉及植物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體提供了一種漢麻籽多肽的制備方法及其應(yīng)用。該方法包括：用堿提酸沉法制得漢麻籽蛋白；對(duì)漢麻籽蛋白進(jìn)行蛋白酶酶解處理、滅酶處理，干燥，得到漢麻籽多肽；所述蛋白酶包括中性蛋白酶；所述酶解處理時(shí)，酶解的溫度為50℃～65℃，pH為6.0～7.0，時(shí)間為60min～120min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法步驟簡(jiǎn)單、成本較低，得到的漢麻籽多肽，對(duì)促進(jìn)膠原蛋白分泌有顯著的效果。
技術(shù)要點(diǎn)
1.一種漢麻籽多肽的制備方法，其特征在于，包括：用堿提酸沉法制得漢麻籽蛋白；對(duì)漢麻籽蛋白進(jìn)行蛋白酶酶解處理、滅酶處理，干燥，得到漢麻籽多肽；
所述蛋白酶包括中性蛋白酶；
所述酶解處理時(shí)，酶解的溫度為50℃～65℃，pH為6.0～7.0，時(shí)間為60min～120min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漢麻籽多肽的制備方法，其特征在于，所述中性蛋白酶的用量為所述漢麻籽蛋白的8～15wt％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漢麻籽多肽的制備方法，其特征在于，所述酶解在超聲條件下進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的漢麻籽多肽的制備方法，其特征在于，所述超聲的功率為100W～300W，溫度為30℃～50℃，時(shí)間為20min～40min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漢麻籽多肽的制備方法，其特征在于，所述滅酶處理的溫度為90℃～100℃，時(shí)間為15min～25min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漢麻籽多肽的制備方法，其特征在于，所述堿提酸沉法包括以下步驟：
將漢麻籽與水混合，調(diào)節(jié)pH至9.0～9.5進(jìn)行堿提處理，得到提取液；調(diào)節(jié)提取液的pH至3.5～4.0進(jìn)行酸沉處理。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的漢麻籽多肽的制備方法，其特征在于，所述堿提處理的溫度為30℃～50℃，時(shí)間為1h～3h；
所述酸沉處理的時(shí)間為60min～90min。
8.權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的漢麻籽多肽的制備方法得到的漢麻籽多肽。
9.權(quán)利要求8所述的漢麻籽多肽在制備促進(jìn)膠原蛋白分泌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述漢麻籽多肽包括分子量＜10kD的漢麻籽多肽和/或分子量＞100kD漢麻籽多肽；
所述漢麻籽多肽在產(chǎn)品中的濃度為50～100μg/ml。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及植物提取技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種漢麻籽多肽的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
漢麻(Cannabis sativa L.)也稱為火麻。漢麻籽具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)元素以及生物活性成分，其開發(fā)前景已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注。漢麻全籽的蛋白質(zhì)含量一般在20～25％之間，而脫殼后籽仁的蛋白質(zhì)含量超過40％。漢麻種子是一種十分優(yōu)異的蛋白質(zhì)來源，具有很高的開發(fā)研究?jī)r(jià)值。
植物蛋白生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)成本低，無動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)地限制，不產(chǎn)生溫室氣體，伴隨著世界人口增長(zhǎng)，耕地面積減少、全球變暖等問題出現(xiàn)，使用植物蛋白替代動(dòng)物蛋白正逐漸被越來越多的人所關(guān)注。植物蛋白常見的方法包括有機(jī)溶劑提取法、鹽溶提取法、反膠束萃取法等。有機(jī)溶劑提取法主要針對(duì)不溶于水、酸液、堿液和稀鹽溶液的蛋白質(zhì)，因?yàn)檫@類蛋白質(zhì)和脂質(zhì)結(jié)合牢固，只溶解于乙醇、丙酮等親脂性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑，且必須在低溫下進(jìn)行操作以防止蛋白質(zhì)變性。
植物蛋白多肽是植物蛋白在特定條件下水解后形成的一種小分子多肽。漢麻籽多肽是植物蛋白多肽的一種，目前還未有漢麻籽多肽在促進(jìn)膠原蛋白分泌的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種漢麻籽多肽的制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明的方法步驟簡(jiǎn)單、成本較低，得到的漢麻籽多肽，對(duì)促進(jìn)膠原蛋白分泌有顯著的效果。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種漢麻籽多肽的制備方法，包括：用堿提酸沉法制得漢麻籽蛋白；對(duì)漢麻籽蛋白進(jìn)行蛋白酶酶解處理，干燥，得到漢麻籽多肽；
所述蛋白酶包括中性蛋白酶；
所述酶解處理時(shí)，酶解的溫度為50℃～65℃，pH為6.0～7.0，時(shí)間為60min～120min。
優(yōu)選的，所述中性蛋白酶的用量為所述漢麻籽蛋白的8～15wt％，優(yōu)選為8wt％、10wt％或15wt％。
優(yōu)選的，所述酶解處理在超聲條件下進(jìn)行；所述超聲的功率為100W～300W，溫度為30℃～50℃，時(shí)間為20min～40min。
優(yōu)選的，所述酶解處理包括以下步驟：將漢麻籽蛋白的水分散液與蛋白酶混合后進(jìn)行酶解反應(yīng)；所述漢麻籽蛋白的水分散液的制備方法包括以下步驟：將漢麻籽蛋白粉末和水混合；所述漢麻籽蛋白粉末和水的料液比為1：(6～10)g/mL。
優(yōu)選的，所述漢麻籽蛋白粉末為脫脂漢麻籽蛋白粉末；所述脫脂漢麻籽蛋白粉末的制備方法包括：將漢麻籽粉末和石油醚按照1：(5～8)(g/mL)的比例混合，干燥。
優(yōu)選的，所述漢麻籽蛋白粉末的細(xì)度為80目；所述漢麻籽蛋白粉末的制備方法，包括以下步驟：將漢麻籽進(jìn)行粉碎過80目篩；所述漢麻籽優(yōu)選為脫殼漢麻籽，更優(yōu)選為干燥成熟的脫殼漢麻籽，長(zhǎng)為4-5.5mm，直徑為2.5-4mm。
優(yōu)選的，所述酶解處理還包括以下步驟：對(duì)酶解后的體系進(jìn)行滅酶處理。滅酶處理的溫度為90℃～100℃，時(shí)間為15min～25min；
所述酶解處理還包括以下步驟：將滅酶處理后的體系進(jìn)行離心處理，收集上清液得到酶解產(chǎn)物；滅酶處理后的離心的轉(zhuǎn)速為4000r/min～8000r/min，時(shí)間為10min～20min。
優(yōu)選的，所述堿提酸沉法包括以下步驟：
將漢麻籽與水混合，調(diào)節(jié)pH至9.0～9.5進(jìn)行堿提處理，得到提取液；調(diào)節(jié)提取液的pH至3.5～4.0進(jìn)行酸沉處理。
優(yōu)選的，用氫氧化鈉進(jìn)行所述堿提處理；所述堿提處理的溫度為30℃～50℃，時(shí)間為1h～3h。
優(yōu)選的，所述堿提酸沉法還包括以下步驟：對(duì)堿提處理后的提取液進(jìn)行離心處理，收集上清液；堿提處理后的離心的轉(zhuǎn)速為4000r/min～8000r/min，時(shí)間為10min～20min。
優(yōu)選的，酸沉處理采用加入酸溶液的方法調(diào)節(jié)pH，酸溶液優(yōu)選為檸檬酸溶液；檸檬酸溶液的濃度優(yōu)選為0.5mol/L～1mol/L；所述酸沉處理的時(shí)間為60min～90min；所述酸沉處理還包括以下步驟：對(duì)酸沉處理后的提取液進(jìn)行離心處理，酸沉處理后的離心的轉(zhuǎn)速為4000r/min～8000r/min，時(shí)間為10min～20min。
優(yōu)選的，所述滅酶處理后的干燥為真空冷凍干燥；真空冷凍干燥具體為：將滅酶處理后的體系在-80℃～-60℃下預(yù)凍4h～6h，再在真空度≤40Pa下干燥處理18h～20h。
本發(fā)明還提供了上述漢麻籽多肽的制備方法得到的漢麻籽多肽。
本發(fā)明還提供了上述漢麻籽多肽在制備促進(jìn)膠原蛋白分泌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，所述膠原蛋白包括I型膠原蛋白。
優(yōu)選的，本發(fā)明提供了漢麻籽多肽在制備促進(jìn)細(xì)胞膠原蛋白分泌的產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述細(xì)胞包括HFF-1細(xì)胞。
優(yōu)選的，所述產(chǎn)品的劑型包括溶液劑、洗劑、乳劑、粉劑、軟膏中的一種或多種；所述產(chǎn)品可以應(yīng)用在藥物、寵物食品、寵物洗護(hù)等領(lǐng)域；所述藥物包括外用藥物；所述寵物洗護(hù)包括寵物洗發(fā)水、寵物染發(fā)劑、寵物沐浴露中的一種或多種；所述寵物食品包括寵物干糧、寵物濕糧、寵物零食中的一種或多種。
優(yōu)選的，所述漢麻籽多肽包括分子量＜10kD的漢麻籽多肽和/或分子量＞100kD漢麻籽多肽。
優(yōu)選的，所述分子量＜10kD的漢麻籽多肽的制備方法包括：
用堿提酸沉法制得漢麻籽蛋白；對(duì)漢麻籽蛋白進(jìn)行蛋白酶酶解處理、滅酶處理，干燥，得到漢麻籽多肽；使用截留分子量為10kD的分離裝置對(duì)所述漢麻籽多肽進(jìn)行分離。
優(yōu)選的，所述分子量＞100kD漢麻籽多肽的制備方法包括：用堿提酸沉法制得漢麻籽蛋白；對(duì)漢麻籽蛋白進(jìn)行蛋白酶酶解處理、滅酶處理，干燥，得到漢麻籽多肽；使用截留分子量為100kD的分離裝置對(duì)所述漢麻籽多肽進(jìn)行分離。
優(yōu)選的，所述漢麻籽多肽在產(chǎn)品中的濃度為50～100μg/ml，優(yōu)選為50μg/ml或100μg/ml。
本發(fā)明的漢麻籽多肽的制備方法步驟簡(jiǎn)單、成本較低；首先用堿提酸沉法制得漢麻籽蛋白，再對(duì)漢麻籽蛋白依次進(jìn)行蛋白酶酶解處理、滅酶處理，最后進(jìn)行干燥，得到的漢麻籽多肽，對(duì)促進(jìn)膠原蛋白分泌有顯著的效果。經(jīng)過本發(fā)明試驗(yàn)例證實(shí)，本發(fā)明的方法制得的漢麻籽多肽(分子量大于100kD與小于10kD)對(duì)HFF-1細(xì)胞的I型膠原蛋白(COL-I)分泌量呈現(xiàn)顯著性上調(diào)的作用。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，下面通過以下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明以下實(shí)施例所用的原料均為市售商品。
本發(fā)明實(shí)施例和對(duì)比例使用的漢麻籽購(gòu)買自安國(guó)市鵬碩藥材行，商品名為白火麻仁；中性蛋白酶購(gòu)買自南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司，貨號(hào)為中性蛋白酶001，酶活力為20萬U/g。
實(shí)施例1
本實(shí)施例的漢麻籽多肽的制備方法，包括以下步驟：
(1)選擇干燥成熟、呈卵圓形的脫殼漢麻籽，長(zhǎng)4-5.5mm，直徑2.5-4mm，表面為淺黃色，機(jī)械粉碎過80目篩得到粉末，在室溫下將粉末和石油醚按照1:5(g/mL)的比例混合除去脂類物質(zhì)，自然風(fēng)干后得到脫脂粉末。
(2)將步驟(1)中的脫脂粉末和去離子水按1：20(g/mL)的比例混合，得到混合液，加入0.1mol/L的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH至9.0，隨后，在30℃下水浴加熱3h，反應(yīng)結(jié)束后，在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，收集上清液。
(3)將步驟(2)中得到的上清液，用0.5mol/L的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.5，沉淀漢麻籽蛋白，沉淀時(shí)間為60min，沉淀反應(yīng)結(jié)束后，在4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心20min，收集漢麻籽蛋白。
(4)將漢麻籽蛋白和去離子水按1：6(g/mL)的比例混合得到分散液，對(duì)分散液進(jìn)行超聲處理，超聲的功率設(shè)置為100W，超聲的溫度為30℃，超聲的時(shí)間為40min。
(5)向超聲后的分散液中加入中性蛋白酶，中性蛋白酶的加入量為漢麻籽蛋白的10wt％，調(diào)節(jié)分散液的pH至6.5，然后在50℃下酶解120min。
(6)酶解反應(yīng)結(jié)束后，在90℃下水浴加熱25min進(jìn)行滅酶反應(yīng)處理，然后在8000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液。
(7)分離：
a)使用截留分子量100kD規(guī)格的超濾離心管對(duì)步驟(6)中得到的上清液進(jìn)行離心(3800r/min，30min)，收集分子量大于100kD的漢麻籽多肽截留液；
b)將步驟a)的透過液，用截留分子量50kD的超濾離心管進(jìn)行分離處理，收集分子量在50kD～100kD的漢麻籽多肽截留液；
c)將步驟b)的透過液，用截留分子量10kD的超濾離心管進(jìn)行分離處理，即可得分子量小于10kD以及10kD～50kD的漢麻籽多肽液。
(8)將步驟(7)獲得的不同分子量的漢麻籽多肽液在-80℃下預(yù)凍4h，然后在真空度40Pa條件下干燥處理20h，得到漢麻籽多肽。
實(shí)施例2
本實(shí)施例參照實(shí)施例1的方法，區(qū)別僅在于，本實(shí)施例將中性蛋白酶的加入量調(diào)整為漢麻籽的8wt％。其余步驟參照實(shí)施例1進(jìn)行。
實(shí)施例3
本實(shí)施例參照實(shí)施例1的方法，區(qū)別僅在于，本實(shí)施例將中性蛋白酶的加入量調(diào)整為漢麻籽的15wt％。其余步驟參照實(shí)施例1進(jìn)行。
試驗(yàn)例不同分子量的漢麻籽多肽對(duì)HFF-1細(xì)胞的I型膠原蛋白分泌量的影響
(1)將HFF-1細(xì)胞按10000個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24h。設(shè)置空白對(duì)照組和樣品組(實(shí)施例1制得的不同分子量的漢麻籽多肽，濃度分別為50μg/ml、100μg/ml)，各組各設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。以完全培養(yǎng)基為稀釋液，按照樣品試驗(yàn)濃度表配制不同濃度的樣品工作液，100μL/孔，空白組加等量完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
(2)取孔板中的上清，通過ELISA法檢測(cè)膠原含量，操作步驟如下：
A、標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：用標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為500，250，125，62.5，0ng/mL。
B、收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液到無菌離心管中，離心取上清后，適當(dāng)濃度稀釋作為檢測(cè)樣本。
C、各反應(yīng)孔中加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品工作液及檢測(cè)樣本(稀釋1倍)，各組均設(shè)2個(gè)復(fù)孔，于37℃孵箱孵育90min。
D、棄去液體，甩干，各反應(yīng)孔中加入100μL生物素標(biāo)記抗體工作液至反應(yīng)孔中，于37℃孵箱孵育60min。
E、棄去液體，甩干，各反應(yīng)孔中加入300μL洗滌液，浸泡1-2min后甩干。重復(fù)4次。
F、各反應(yīng)孔中加入100μL HRP標(biāo)記鏈霉親和素工作液至反應(yīng)孔中，孵育30min。
通過ELISA檢測(cè)各組膠原含量，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝0.0006X+0.0924，R2＝0.9951(橫坐標(biāo)X為樣品組產(chǎn)生的膠原含量，縱坐標(biāo)Y為吸光度)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度反推膠原含量，其結(jié)果如表1所示。
表1
以空白組產(chǎn)生的膠原含量作為對(duì)照，不同分子量的漢麻籽多肽對(duì)HFF-1細(xì)胞的I型膠原蛋白(COL-I)分泌量都有一定的促進(jìn)作用。然而，相較于其他分子量區(qū)間的漢麻籽多肽；分子量大于100kD與小于10kD的漢麻籽多肽對(duì)HFF-1細(xì)胞的I型膠原蛋白(COL-I)分泌量呈現(xiàn)顯著性上調(diào)的作用。
所公開的實(shí)施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。
摘自國(guó)家發(fā)明專利，發(fā)明人：麥力艷；麥名琳；陳潔；麥勇；羅美秀，申請(qǐng)?zhí)枺?/font>CN202410588037.4，申請(qǐng)日：2024.05.13
