摘  要：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的CsbHLH100基因及其擴(kuò)增引物和檢測(cè)方法。本發(fā)明提供了工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的CsbHLH100基因，所述CsbHLH100基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明為工業(yè)大麻抗旱育種提供了候選基因。

權(quán)利要求書(shū)

1.工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的CsbHLH100基因，其特征在于，所述CsbHLH100基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述CsbHLH100基因的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物100Seq-F和下游引物100Seq-R，所述上游引物100Seq-F的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述下游引物100Seq-R的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

3.一種檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物100Q-F和下游引物100Q-R，所述上游引物100Q-F的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述下游引物100Q-R的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。

4.一種檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求3所述引物和反應(yīng)液。

5.一種檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)方法，其特征在于，包括以下步驟：

干旱脅迫處理工業(yè)大麻種子，提取總RNA，合成cDNA第一鏈，采用權(quán)利要求3所述引物，使用PCR方法，檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子中受干旱脅迫的差異表達(dá)情況。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述PCR方法為qRT-PCR時(shí)，所述擴(kuò)增的反應(yīng)體系每20μL包括：2×SYBRGreenMasterMix10μL，10μM上游引物100Q-F0.4μL，10μM下游引物100Q-R0.4μL，cDNA模板2μL，10×ROXreferencedye2μL，RNasefreeddH2O5.2μL。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增的反應(yīng)程序包括：95℃預(yù)變性120s；95℃變性5s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述工業(yè)大麻種子設(shè)為對(duì)照組和干旱脅迫組，對(duì)照組添加蒸餾水，干旱脅迫組添加20％PEG-6000模擬干旱脅迫，培養(yǎng)7d。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述qRT-PCR中，內(nèi)參基因?yàn)镋F1a。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，擴(kuò)增所述內(nèi)參基因EF1a的引物包括上游引物EF1a-F和下游引物EF1a-R，所述上游引物EF1a-F的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，所述下游引物EF1a-R的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的CsbHLH100基因及其擴(kuò)增引物和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

大麻(Cannabis sativa L.)為大麻科(Cannabaceae)大麻屬植物，又稱火麻、漢麻、線麻。工業(yè)大麻是指其任何部位四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)含量低于0.3%的大麻品種類型。為了不跟糧食爭(zhēng)地，工業(yè)大麻一般種植在山坡地等非糧地，易受到干旱脅迫的影響。

種子萌發(fā)和幼苗建成是植物生命周期的關(guān)鍵階段，也是對(duì)外界環(huán)境因子反應(yīng)最敏感的時(shí)期。在工業(yè)大麻實(shí)際生產(chǎn)中，經(jīng)常出現(xiàn)因干旱造成播種后出苗少或出苗不一致，甚至不出苗的問(wèn)題，幾乎每年都有發(fā)生，只能進(jìn)行重播、補(bǔ)種或者補(bǔ)苗，最終造成人力、物力和財(cái)力的損失，嚴(yán)重制約了工業(yè)大麻的發(fā)展。因此，大麻的抗旱育種是實(shí)現(xiàn)工業(yè)大麻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)發(fā)展所迫切需要解決的問(wèn)題，挖掘工業(yè)大麻的抗旱相關(guān)基因是其育種的基礎(chǔ)和前提。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的CsbHLH100基因及其擴(kuò)增引物和檢測(cè)方法。本發(fā)明提供了工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的CsbHLH100基因，本發(fā)明為工業(yè)大麻抗旱育種提供了候選基因。

本發(fā)明提供了工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的CsbHLH100基因，所述CsbHLH100基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

本發(fā)明還提供了擴(kuò)增上述技術(shù)方案所述CsbHLH100基因的引物，所述引物包括上游引物100Seq-F和下游引物100Seq-R，所述上游引物100Seq-F的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述下游引物100Seq-R的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)的引物，所述引物包括上游引物100Q-F和下游引物100Q-R，所述上游引物100Q-F的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述下游引物100Q-R的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)的試劑盒，包括上述技術(shù)方案所述引物和反應(yīng)液。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)方法，包括以下步驟：

干旱脅迫處理工業(yè)大麻種子，提取總RNA，合成cDNA第一鏈，采用上述技術(shù)方案所述引物，使用PCR方法，檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子中受干旱脅迫的差異表達(dá)情況。

優(yōu)選的是，當(dāng)所述PCR方法為qRT-PCR時(shí)，所述擴(kuò)增的反應(yīng)體系每20μL包括：2×SYBRGreenMasterMix10μL，10μM上游引物100Q-F0.4μL，10μM下游引物100Q-R0.4μL，cDNA模板2μL，10×ROXreferencedye2μL，RNasefreeddH2O5.2μL。

優(yōu)選的是，所述擴(kuò)增的反應(yīng)程序包括：95℃預(yù)變性120s；95℃變性5s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)。

優(yōu)選的是，所述工業(yè)大麻種子設(shè)為對(duì)照組和干旱脅迫組，對(duì)照組添加蒸餾水，干旱脅迫組添加20％PEG-6000模擬干旱脅迫，培養(yǎng)7d。

優(yōu)選的是，所述qRT-PCR中，內(nèi)參基因?yàn)镋F1a。

優(yōu)選的是，擴(kuò)增所述內(nèi)參基因EF1a的引物包括上游引物EF1a-F和下游引物EF1a-R，所述上游引物EF1a-F的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，所述下游引物EF1a-R的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。

本發(fā)明提供了工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的CsbHLH100基因。本發(fā)明首次提出了工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的CsbHLH100基因，本發(fā)明為工業(yè)大麻抗旱育種提供了候選基因。試驗(yàn)結(jié)果表明，基因CsbHLH100在經(jīng)過(guò)干旱脅迫處理后在“云麻1號(hào)”和“云麻7號(hào)”中的相對(duì)表達(dá)量相較對(duì)照下降2.5倍和14倍，說(shuō)明該基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)受到干旱脅迫后表達(dá)量下降。基因CsbHLH100在經(jīng)過(guò)干旱脅迫處理后在“云麻7號(hào)”中的相對(duì)表達(dá)量相較“云麻1號(hào)”下降的倍數(shù)更多，而“云麻7號(hào)”種子的萌發(fā)抗旱性比“云麻1號(hào)”強(qiáng)(如圖3、4所示)，說(shuō)明基因CsbHLH100在工業(yè)大麻種子萌發(fā)受到干旱脅迫后能迅速的參與干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程，該基因通過(guò)表達(dá)量的下調(diào)從而調(diào)控工業(yè)大麻的萌發(fā)抗旱性。本發(fā)明為認(rèn)識(shí)工業(yè)大麻bHLH轉(zhuǎn)錄基因CsbHLH100的抗逆機(jī)制，以及工業(yè)大麻進(jìn)行分子育種提供了技術(shù)支撐。

本發(fā)明還提供了擴(kuò)增和檢測(cè)CsbHLH100基因的引物和方法，進(jìn)一步提供了一種檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)的方法。本發(fā)明為提高現(xiàn)有工業(yè)大麻的萌發(fā)抗旱性，使工業(yè)大麻在干旱逆境中能高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)從而適應(yīng)近年來(lái)氣候惡化的情況奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明提供的基因CsbHLH100的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；其中，M：DNAmakerDL2000；泳道1(Y1-CK)、泳道2(Y1-PEG)、泳道3(Y7-CK)、泳道4(Y7-PEG)分別為CsbHLH100的擴(kuò)增產(chǎn)物；Y1表示“云麻1號(hào)”(纖維用工業(yè)大麻品種，抗旱性弱)，Y7表示“云麻7號(hào)”(花葉用工業(yè)大麻品種，抗旱性強(qiáng))，CK表示對(duì)照組，PEG-6000表示干旱脅迫組；

圖1

圖2為本發(fā)明提供的qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)基因CsbHLH100在不同抗旱性工業(yè)大麻品種種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)圖；其中，縱坐標(biāo)表示基因CsbHLH100的相對(duì)表達(dá)量，橫坐標(biāo)表示不同工業(yè)大麻品種的名稱；CK表示對(duì)照組，PEG-6000表示干旱脅迫組；**表示差異顯著水平達(dá)到P<0.01，****表示差異顯著水平達(dá)到P<0.0001；

圖2

圖3為本發(fā)明提供的不同抗旱性工業(yè)大麻品種種子萌發(fā)差異圖；其中，Y1表示“云麻1號(hào)”，Y7表示“云麻7號(hào)”；兩個(gè)品種均為干旱脅迫下的萌發(fā)狀態(tài)；

圖3

圖4為本發(fā)明提供的不同抗旱性工業(yè)大麻品種萌發(fā)種子形態(tài)指標(biāo)差異圖；其中縱坐標(biāo)表示各形態(tài)指標(biāo)，橫坐標(biāo)表示不同工業(yè)大麻品種的名稱；Y1表示“云麻1號(hào)”，Y7表示“云麻7號(hào)”，CK表示對(duì)照組，20％PEG-6000表示干旱脅迫組；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著水平達(dá)到P<0.05；

圖4

圖5為本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNAsequencing)檢測(cè)基因CsbHLH100在不同抗旱性工業(yè)大麻品種種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)圖；其中，縱坐標(biāo)表示基因CsbHLH100的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的FPKM值，橫坐標(biāo)表示不同工業(yè)大麻品種的名稱；CK表示對(duì)照組，PEG-6000表示干旱脅迫組；*表示差異顯著水平達(dá)到P<0.05，****表示差異顯著水平達(dá)到P<0.0001。

圖5

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的CsbHLH100基因，所述CsbHLH100基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：aacaaaataaaacccccaaaattatatttttatagaattaagtgtagagatgattaggtagctagtgacgatttctatcatgttcatacatatatatatacatacatatgtatgcatcgatcacttatttcattgaaagtattagtcaataagtgatatcaaattaagtaacccaaccaggcagatcgaccatattacaatttataacaatacaatgttggctttttctcctcctcctcctcctttgttttctaccaataagcccaataacattgtgggatggcctttcgatgatctaacacgctttgaagaccaaaactacttgttttcagactatgatcaataccccctcttatttctcaatacttataacctccacactttaccaccaccgtccgatcaacataataatcacaatcatcaacggttcgaagttgatcgctccgctacgccatcctcatccacggccaccgccattaacagtgatctgactatggtggagaagaagcttaatcataatgctagtgagcgtgatcgaagaaagaaagtcaaccatatgtattctgctcttcgttccctacttccaccttcagatcatacgaaaaaattgagcattccggcaacagtgtctcgtgtgctaaaatacgtaccagagctacaggaagaagtggagagtctagttcttaaaaaggaagagctattgtcaaaaataaattcaatgcagcaagggaaaacaattactgctactactactgctaatcaagagattaagaaagtaaaaaacataggtccaaactcattatcctctatttctgcaactcaactcagtgagaaagaaattgctgttcaaatattgtcttataaagccgacaacgacctcttgtctgaaatgttgcataattatgaaattgaaggcctttcattactccatgcctcttcatttgagtccattggaggaaggctcttccataatttacatcttcaggctgaggtatcatattgtatggaaagtgggactaccatagatgccaatcttttatctcttcacgacaataaggagaagttattggttgtgcaataactcttctagactttggatgtgtatgtaaactgaaggggatctctgtatcatatgtagtcttttagtttgttaagttttgttaattagaagctgttaaaaattaaagtggttgttttagttatctaactatatatataccggtgtattgatcttctcctatataaataacaggagtgttaatcactctattttacact。本發(fā)明以兩個(gè)不同抗旱性的工業(yè)大麻品種為對(duì)象，其中“云麻1號(hào)”抗旱性弱，“云麻7號(hào)”抗旱性強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，qRT-PCR檢測(cè)基因CsbHLH100在沒(méi)有干旱脅迫的情況下在工業(yè)大麻萌發(fā)種子中相對(duì)表達(dá)量為0.508(云麻1號(hào))和0.582(云麻7號(hào))，在經(jīng)過(guò)干旱脅迫處理后的工業(yè)大麻萌發(fā)種子中的相對(duì)表達(dá)量則明顯下降，分別下降2.5倍和14倍；說(shuō)明CsbHLH100屬于受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因，CsbHLH100在工業(yè)大麻種子萌發(fā)受到干旱脅迫后能迅速的參與干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程。CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)階段，響應(yīng)干旱脅迫進(jìn)行差異表達(dá)，本發(fā)明為大麻抗旱育種提供了候選基因。

本發(fā)明還提供了擴(kuò)增上述技術(shù)方案所述CsbHLH100基因的引物，所述引物包括上游引物100Seq-F和下游引物100Seq-R，所述上游引物100Seq-F的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：5'-aaccaggcagatcgaccata-3'，所述下游引物100Seq-R的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：5'?tgatacagagatccccttcagttt?3'。本發(fā)明優(yōu)選利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT?PCR)技術(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增。在本發(fā)明中，所述RT?PCR的反應(yīng)體系每20μL優(yōu)選包括：2×EsTaqMasterMix(Dye)10μL；10μM上游引物100Seq?F1μL；10μM下游引物100Seq?R1μL；cDNA1μL；ddH2O7μL。在本發(fā)明中，所述RT?PCR的反應(yīng)程序優(yōu)選包括：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃,2min。本發(fā)明擴(kuò)增結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物優(yōu)選4℃保存。本發(fā)明所述RT?PCR擴(kuò)增前，優(yōu)選進(jìn)行總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成的步驟。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)的引物，所述引物包括上游引物100Q?F和下游引物100Q?R，所述上游引物100Q?F的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示：5'?aacacgctttgaagacca?3'，所述下游引物100Q?R的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示：5'?tcgaaccgttgatgattg?3'。本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異引物在qRT?PCR中特異性強(qiáng)，無(wú)雜帶產(chǎn)生，熔解曲線顯示無(wú)引物二聚體產(chǎn)生。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)的試劑盒，包括上述技術(shù)方案所述引物和反應(yīng)液。在本發(fā)明中，所述反應(yīng)液優(yōu)選包括2×SYBRGreenMasterMix和10×ROXreferencedye。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)方法，包括以下步驟：

干旱脅迫處理工業(yè)大麻種子，提取總RNA，合成cDNA第一鏈，采用上述技術(shù)方案所述引物，使用PCR方法，檢測(cè)CsbHLH100基因在工業(yè)大麻種子中受干旱脅迫的差異表達(dá)情況。

在本發(fā)明中，當(dāng)所述PCR方法為qRT?PCR時(shí)，所述擴(kuò)增的反應(yīng)體系優(yōu)選每20μL包括：2×SYBRGreenMasterMix10μL，10μM上游引物100Q?F0.4μL，10μM下游引物100Q?R0.4μL，cDNA模板2μL，10×ROXreferencedye2μL，RNasefreeddH2O5.2μL。在本發(fā)明中，所述擴(kuò)增的反應(yīng)程序優(yōu)選包括：95℃預(yù)變性120s；95℃變性5s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物優(yōu)選4℃保存。qRT?PCR采用SYBRGreenI嵌合熒光法進(jìn)行，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好等特點(diǎn)。在本發(fā)明中，所述工業(yè)大麻種子優(yōu)選設(shè)為對(duì)照組和干旱脅迫組，對(duì)照組添加蒸餾水，干旱脅迫組添加20％PEG?6000模擬干旱脅迫，培養(yǎng)7d。

在本發(fā)明中，所述qRT?PCR中，內(nèi)參基因優(yōu)選為EF1a。本發(fā)明選擇較合適工業(yè)大麻種子萌發(fā)的內(nèi)參基因EF1a，其穩(wěn)定性更高。在本發(fā)明中，擴(kuò)增所述內(nèi)參基因EF1a的引物包括上游引物EF1a?F和下游引物EF1a?R，所述上游引物EF1a?F的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示：5'?cagttgagatgcaccacgag?3'，所述下游引物EF1a?R的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示：5'?ttgccaatttgaccagggtg?3'。

本發(fā)明檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)大麻種子萌發(fā)階段，基因CsbHLH100響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)情況。

為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的CsbHLH100基因及其擴(kuò)增引物和檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)地描述，但不能將它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)驗(yàn)材料：纖維用工業(yè)大麻品種“云麻1號(hào)”和花葉用工業(yè)大麻品種“云麻7號(hào)”。抗旱性驗(yàn)證結(jié)果如圖3和圖4所示。根據(jù)圖3可知，“云麻7號(hào)”在干旱脅迫下的萌發(fā)狀態(tài)比“云麻1號(hào)”好。根據(jù)圖4可知，“云麻1號(hào)”干旱脅迫組的胚軸長(zhǎng)相較對(duì)照組下降了85.76％，而“云麻7號(hào)”下降了78.90％；“云麻1號(hào)”干旱脅迫組的鮮重相較對(duì)照組下降了61.39％，“云麻7號(hào)”下降了53.51％；在發(fā)芽勢(shì)上，“云麻1號(hào)”和“云麻7號(hào)”分別下降了45.76％和30.88％；在發(fā)芽率上，“云麻1號(hào)”和“云麻7號(hào)”分別下降了57.25％和38.27％。以上結(jié)果均表明，“云麻1號(hào)”抗旱性弱，“云麻7號(hào)”抗旱性強(qiáng)。

實(shí)施例1

工業(yè)大麻種子萌發(fā)響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)的基因CsbHLH100的獲得：

一、設(shè)計(jì)擴(kuò)增工業(yè)大麻CsbHLH100基因全長(zhǎng)序列的專用引物

根據(jù)前期工業(yè)大麻干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，bHLH100的同源基因CsbHLH100為差異表達(dá)基因，且在“云麻1號(hào)”和“云麻7號(hào)”的表達(dá)量均顯著下降(圖5)，暗示CsbHLH100基因與工業(yè)大麻的萌發(fā)抗旱密切相關(guān)。據(jù)于此，利用生物軟件Primer5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因CsbHLH100的專用引物。CsbHLH100專用引物由上游引物100Seq?F和下游引物100Seq?R組成(上游引物100Seq?F的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：5'?aaccaggcagatcgaccata?3'，下游引物100Seq?R的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：5'?tgatacagagatccccttcagttt?3')，引物由北京擎科生物科技股份有限公司昆明分公司合成。

二、工業(yè)大麻種子萌發(fā)幼苗的總RNA提取(用美基生物公司提供的HiPurePlantRNAMiniKit進(jìn)行總RNA的提取)

(1)干旱脅迫處理：挑選大小、外形一致“云麻1號(hào)”和“云麻7號(hào)”的種子，使用70%酒精消毒，蒸餾水沖洗干凈并晾干備用。隨機(jī)挑選30粒種子，均勻擺放于9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，正常萌發(fā)處理(對(duì)照組)加入蒸餾水9ml，干旱脅迫處理(干旱脅迫組)加入20％聚乙二醇6000(PEG?6000)溶液9ml。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)3d后；于光照12h，溫度25℃,黑暗12h，溫度20℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4d。在培養(yǎng)7d時(shí)取萌發(fā)種子或幼苗，每組不同處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣后放至液氮中速凍，于?80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/font>