摘 要：本發(fā)明公開了一種合成大麻素的檢測系統(tǒng)及其應用。所述檢測系統(tǒng)包括檢測合成大麻素的探針和免疫層析試紙條，所述探針為膠體金溶液或熒光微球溶液與識別合成大麻素的單克隆抗體共反應得到的檢測探針，所述免疫層析試紙條檢測線上噴涂有合成大麻素包被抗原，質(zhì)控線上噴涂有二抗。本發(fā)明采用膠體金的比色免疫層析試紙條和基于熒光微球的熒光免疫層析試紙用于吲唑酰胺類合成大麻素的現(xiàn)場檢測，裝配簡單，使用方便，能夠快捷高效完成對吲唑酰胺類合成大麻素的定性和定量檢測；極大地節(jié)約了檢測時間和檢測成本，并且對吲唑酰胺類合成大麻素具有普遍適用性。
技術要點
1.一種合成大麻素的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測系統(tǒng)包括檢測合成大麻素的探針和免疫層析試紙條，所述探針為膠體金溶液或熒光微球溶液與識別合成大麻素的單克隆抗體共孵育得到的檢測探針，所述免疫層析試紙條檢測線上噴涂有合成大麻素包被抗原，質(zhì)控線上噴涂有二抗。
2.根據(jù)權利要求1所述合成大麻素的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述合成大麻素為ADB?BUTINACA(N?(1?氨甲酰基?2,2?二甲基丙基)?1?丁基吲唑?3?甲酰胺)、ADB?4en?PINACA(N?(1?氨基?3,3?二甲基?1?氧代丁烷?2?基)?1?(4?戊烯?1?基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)或4CNCUMYL?BUTINACA(1?(4?氰基丁基)?N?(1?甲基?1?苯乙基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)中任意一種。
3.根據(jù)權利要求1所述合成大麻素的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述膠體金溶液濃度為50?100μg/mL，所述熒光微球溶液濃度為1?10mg/mL，所述探針濃度為1?5mg/mL。
4.根據(jù)權利要求1所述合成大麻素的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述識別合成大麻素的單克隆抗體序列如SEQ ID NO.1所示，所述單克隆抗體濃度為1?3mg/mL，孵育時間為4?6h。
5.根據(jù)權利要求1所述合成大麻素的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述免疫層析試紙條的結構為：包括樣品墊(1)、硝酸纖維素膜(2)、吸收墊(5)、聚氯乙烯平板(6)，所述硝酸纖維素膜(2)的表面設置一條檢測線(3)以及一條質(zhì)控線(4)。
6.根據(jù)權利要求1所述合成大麻素的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述合成大麻素包被抗原的濃度為0.8?1mg/mL，包被量為1?2μL/cm；所述二抗?jié)舛葹?/font>0.8?1.2mg/mL，包被量為1?2μL/cm。
7.一種權利要求1所述合成大麻素的檢測系統(tǒng)在檢測合成大麻素中的應用。
8.一種權利要求1所述合成大麻素的檢測系統(tǒng)在檢測吲哚酰胺類合成大麻素中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述應用，其特征在于，包括如下步驟：
(1)將權利要求1所述檢測探針加入待測樣品中，混合均勻后，靜置，得到目標物與檢測探針形成的免疫復合物；
(2)將步驟(1)得到的免疫復合物滴加于試紙條的樣品墊，樣品液在毛細管力的作用下往吸收墊移動，未與目標物結合的檢測探針與檢測線上的包被抗原進行特異性抗原抗體識別，將膠體金/熒光微球聚集于檢測線，多余探針聚集于質(zhì)控線；用Color Picker軟件分析比色試紙T線RGB值，用ImageJ軟件分析熒光試紙T線灰度值，分別與其對應的標準曲線對比，實現(xiàn)對待測樣品中吲唑酰胺類合成大麻素濃度的定量判斷。
10.根據(jù)權利要去9所述應用，其特征在于，所述步驟(1)待測樣品濃度大于等于5ng/mL，靜置時間為5?20min。
技術領域
本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其涉及一種合成大麻素的檢測系統(tǒng)及其和應用。
背景技術
合成大麻素(synthetic cannabinoids,SCs)是一類人工合成的大麻素受體激動劑，現(xiàn)已成為規(guī)模最大、結構最多樣化的一類新精神活性物質(zhì)。SCs對人體具有較強的致幻作用，同時伴隨著精神錯亂、心臟毒性、癲癇等副作用，嚴重威脅著人類的身體健康、經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定。目前，合成大麻素的檢測方法主要包括高效液相色譜?質(zhì)譜、氣相色譜?質(zhì)譜、表面增強拉曼光譜、電化學方法等，多采用大型器設備對合成大麻進行檢測，這些檢測技術大多依賴于實驗室環(huán)境，過程繁瑣耗時，使其現(xiàn)場分析應用受到嚴重限制，耗時費力，且需要復雜的前處理過程以及專業(yè)人員操作，不利于民警的現(xiàn)場勘查工作。因此，開發(fā)一種快速、準確、靈敏度令人滿意的SCs現(xiàn)場檢測方法，作為毒品犯罪的高效取證工具，對公安工作具有重要意義。
側流免疫層析技術(LFIA)是一種將色譜層析技術與免疫分析技術相結合的快速分析方法，具有穩(wěn)定性高、快速、便攜、簡單和用戶友好等優(yōu)點，已廣泛用于目標分析物的定性及半定量檢測，是目前最常用的即時檢測(POCT)平臺。膠體金是一種帶負電的球形納米顆粒，合成簡單且性質(zhì)穩(wěn)定，可通過非共價作用與抗體偶聯(lián)。在免疫層析過程中，聚集在T、C 線上產(chǎn)生鮮艷的紅色，形成裸眼可見的比色信號。目前，基于膠體金的LFIA已成功應用于疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測和食品質(zhì)量檢測等多個領域。
熒光微球是一類特殊的功能化微球，是指標記有熒光物質(zhì)，在一定的激發(fā)下能產(chǎn)生熒光的聚合物，粒徑通常在納米至微米級。目前已開發(fā)了負載有不同熒光物質(zhì)的熒光聚合物，如摻雜稀土元素、有機染料、量子點等的聚合物微球。由于熒光微球具有穩(wěn)定的形態(tài)結構、良好的單分散性和高效的發(fā)光效率，現(xiàn)已廣泛應用于免疫層析技術。。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的：為了解決上述技術問題，本發(fā)明旨在提供一種合成大麻素的檢測系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)能夠快捷高效完成對吲唑酰胺類合成大麻素的定性和定量檢測。
本發(fā)明還提供了一種合成大麻素檢測系統(tǒng)的制備方法和應用。
技術方案：為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種合成大麻素的檢測系統(tǒng)，所述檢測系統(tǒng)包括檢測合成大麻素的探針和免疫層析試紙條，所述探針為膠體金溶液或熒光微球溶液與識別合成大麻素的單克隆抗體共孵育得到的檢測探針，所述免疫層析試紙條上檢測線上噴涂有合成大麻素包被抗原，質(zhì)控線上噴涂有二抗。
進一步地，所述合成大麻素為ADB?BUTINACA(N?(1?氨甲酰基?2,2?二甲基丙基)?1?丁基吲唑?3?甲酰胺)、ADB?4en?PINACA(N?(1?氨基?3,3?二甲基?1?氧代丁烷?2?基)?1?(4?戊烯?1?基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)或4CN?CUMYL?BUTINACA(1?(4?氰基丁基)?N?(1?甲基?1?苯乙基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)中任意一種。
進一步地，所述膠體金溶液濃度為50?100μg/mL，所述熒光微球溶液濃度為1?10mg/mL，所述探針濃度為1?5mg/mL。
進一步地，所述識別合成大麻素的單克隆抗體序列如SEQ ID NO.1所示，所述單克隆抗體濃度為1?3mg/mL，孵育時間為4?6h。
進一步地，所述免疫層析試紙條的結構為：包括樣品墊(1)、硝酸纖維素膜(2)、吸收墊(5)、聚氯乙烯平板(6)，所述硝酸纖維素膜(2)的表面設置一條檢測線(3)以及一條質(zhì)控線(4)。
作為優(yōu)選，所述免疫層析試紙條的結構為：將硝酸纖維素膜(2)黏貼到聚氯乙烯平板(6)背襯底板上，聚氯乙烯平板(6)背襯底板的兩側設置有樣品墊(1)和吸收墊(5)，樣品墊(1)和吸收墊(5)分別與硝酸纖維素膜(2)重疊2?4mm，所述硝酸纖維素膜(2)的表面設置一條檢測線(3)以及一條質(zhì)控線(4)。
進一步地，所述合成大麻素包被抗原的濃度為0.8?1mg/mL，包被量為1?2μL/cm；所述二抗?jié)舛葹?/font>0.8?1.2mg/mL，包被量為1?2μL/cm。
本發(fā)明所述合成大麻素的檢測系統(tǒng)在檢測合成大麻素中的應用。
本發(fā)明所述合成大麻素的檢測系統(tǒng)在檢測吲哚酰胺類合成大麻素中的應用。
進一步地，所述檢測吲哚酰胺類合成大麻素中的應用，包括如下步驟：
(1)將所述檢測探針加入待測樣品中，混合均勻后，靜置，得到目標物與檢測探針形成的免疫復合物；
（2)將步驟(1)得到的免疫復合物滴加于試紙條的樣品墊，樣品液在毛細管力的作用下往吸收墊移動，未與目標物結合的檢測探針與檢測線上的包被抗原進行特異性抗原抗體識別，將膠體金/熒光微球聚集于檢測線，多余探針聚集于質(zhì)控線；用Color Picker軟件分析比色試紙T線RGB值，用ImageJ軟件分析熒光試紙T線灰度值，分別與其對應的標準曲線對比，實現(xiàn)對待測樣品中吲唑酰胺類合成大麻素濃度的定量判斷。
進一步地，所述步驟(1)待測樣品濃度大于等于5ng/mL，靜置時間為5?20min。
作為優(yōu)選，所述免疫層析試紙條制備方法，包括如下步驟：
(1)將吸水紙剪裁為寬20?30mm吸收墊；
(2)將吲唑酰胺類合成大麻素包被抗原配制成噴涂液，噴涂在硝酸纖維素膜上形成檢測線；
(3)將二抗配成噴涂液，噴涂于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線；
(4)將聚酯膜剪裁為寬20?30mm，并用含3～5％的蔗糖、0.05～2％的曲拉通?100、0.05?0.1mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、磷酸緩沖鹽溶液浸泡2?4h，在35?42℃烘1?3h，得到樣品墊；
(5)將硝酸纖維素膜黏貼到聚氯乙烯背襯底板上，再從聚氯乙烯背襯底板的一側向另一側依次黏貼樣品墊和吸收墊，樣品墊和吸收墊分別與硝酸纖維素膜重疊2?4mm。
本發(fā)明提供了比色和熒光兩種免疫層析試紙條用于合成大麻素的現(xiàn)場檢測，本發(fā)明采用樣品墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、聚氯乙烯背襯底板共同組成了免疫層析試紙條，且樣品墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次粘貼在聚氯乙烯背襯底板上，相鄰處重疊，硝酸纖維素膜分別設置了一條檢測線和一條質(zhì)控線，檢測線上噴涂牛血清白蛋白包被的吲唑酰胺類合成大麻素抗原，質(zhì)控線上噴涂二抗。在檢測過程中，待測樣本與檢測探針共孵育，目標物與檢測探針結合，形成免疫復合物，檢測探針上識別位點減少，使檢測探針與檢測線上包被抗原的結合減少，聚集在檢測線的膠體金/熒光微球少，導致檢測線產(chǎn)生的比色/熒光信號弱，多余的探針與質(zhì)控線上的二抗結合，將膠體金/熒光微球聚集于質(zhì)控線而顯色/熒光。
有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點：
(1)本發(fā)明首次提供了比色和熒光兩種免疫層析試紙條試同時用于對吲唑酰胺類合成大麻素的現(xiàn)場快速檢測，裝配簡單，使用方便，能夠快捷高效完成對吲唑酰胺類合成大麻素的定性和定量檢測；極大地節(jié)約了檢測時間和檢測成本，并且對吲唑酰胺類合成大麻素具有普遍適用性；
(2)本發(fā)明基于膠體金的比色試紙可以裸眼讀出檢測結果，比色試紙檢測限為 20ng/mL，而基于熒光微球的熒光試紙在配套便攜式紫外手電使用時，能夠在比色試紙的基礎上，進一步提高檢測靈敏度，更有利于民警對是否吸毒進行準確判斷，本發(fā)明熒光試紙最低可檢測到的吲唑酰胺類合成大麻素濃度為5ng/ml，在15min內(nèi)即可完成全部檢測。
(3)本發(fā)明對合成大麻素的檢測靈敏度高、使用方便，且過程簡便快捷，結果可靠。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的側流層析試紙條的示意圖，其中1為樣品墊、2為硝酸纖維素膜、3為檢測線、4為質(zhì)控線、5為吸收墊、6為聚氯乙烯平板；
圖1
圖2為本發(fā)明的AuNPs的透射電鏡圖；
圖2
圖3為本發(fā)明的熒光微球的透射電鏡圖；
圖3
圖4為AuNPs的紫外可見吸收光譜圖；
圖4
圖5為熒光微球的熒光光譜圖及紫外手電照射下的圖片；
圖5
圖6為基于AuNPs的比色免疫層析試紙條檢測吲唑酰胺類合成大麻素ADB?BUTINACA的顯色檢測結果，可視化檢測結果為20ng/mL；
圖6
圖7基于熒光微球的熒光免疫層析試紙條檢測吲唑酰胺類合成大麻素ADB?BUTINACA的顯色檢測結果，可視化檢測結果為5ng/mL；
圖7
圖8為基于AuNPs檢測的標準曲線圖；
圖8
圖9為基于熒光微球檢測的標準曲線圖；
圖9
圖10為TRF?LFIA中(A)T線ADB?BSA噴涂濃度、(B)探針加入體積、(C)樣本加入體積的優(yōu)化；CM?LFIA中(D)T線ADB?BSA噴涂濃度、(E)探針加入體積、(F)樣本加入體積的優(yōu)化。
圖10
具體實施方式
下面結合附圖對本發(fā)明的技術方案作進一步說明。
下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠家建議的條件。
本發(fā)明中技術術語的縮寫如下：
LFIA：側流免疫層析技術；
AuNPs：金納米顆粒；
ADB?BUTINACA：N?(1?氨甲酰基?2,2?二甲基丙基)?1?丁基吲唑?3?甲酰胺；
SCs：合成大麻素；
POCT：即時檢測；
4CN?CUMYL?BUTINACA：1?(4?氰基丁基)?N?(1?甲基?1?苯乙基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)；
1?(3?二甲基氨基丙基)?3?乙基碳二亞胺/N?羥基琥珀酰亞胺的磷酸鹽緩沖液：分別稱取10mg 1?(3?二甲基氨基丙基)?3?乙基碳二亞胺和10mg N?羥基琥珀酰亞胺溶于1mL 磷酸鹽緩沖液中；
吸水紙：廠家BLS，貨號XSZ301244；聚酯膜：廠家：BLS，貨號：6613；硝酸纖維素膜：廠家：sartorius，貨號：CN95；聚氯乙烯平板：廠家：BLS，貨號DB630；
二抗(AffiniPureTM Mouse Anti?Goat IgG(H+L))：廠家Jackson ImmunoResearch，貨號205?005?018；
樣品ADB?BUTINACA(N?(1?氨甲?；?/font>?2,2?二甲基丙基)?1?丁基吲唑?3?甲酰胺)、 ADB?4en?PINACA(N?(1?氨基?3,3?二甲基?1?氧代丁烷?2?基)?1?(4?戊烯?1?基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)和4CN?CUMYL?BUTINACA(1?(4?氰基丁基)?N?(1?甲基?1?苯乙基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)已于[1]劉生鳳,張嵐,劉書丞,等.4種酰胺類合成大麻素在人肝微粒體中Ⅰ相代謝規(guī)律研究[J].中國藥科大學學報,2022,53(05):577?590.[2]接昭瑋,張文芳,王繼芬,等.新型合成大麻素ADB?BUTINACA在不同時間段斑馬魚體內(nèi)的代謝組學分析[J].分析測試學報,2023,42(05):568?576.公開報道，本發(fā)明實驗樣品均取自國家毒品實驗室，且在公安局備案；
抗ADB?BUTINACA的單克隆抗體：由國家禁毒委員會辦公室中國藥科大學禁毒關鍵技術聯(lián)合實驗室提供，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：ENVLTQSPAIISASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQRSSTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSMEAEDVATYYCFQGSGYPLTFGSGTKLEIKQVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKGKTTLTAD KSSSTAYMLLSSLTSEDSAIYFCVGYYRYDRYHFDYWGQGTTLTVSS，由生物公司直接合成；
吲唑酰胺類合成大麻素ADB?BUTINACA包被抗原(制備方法參考中國專利CN118063385A，包被抗原BSA?H08)，濃度為0.8mg/mL。
實施例1
(1)AuNPs的制備：
在磁力攪拌下，加熱100mL 0.3mM的氯金酸溶液至100℃，向其加入4mL檸檬酸鈉(1％)還原溶液。反應體系顏色在1?2min內(nèi)變成酒紅色，待顏色穩(wěn)定，繼續(xù)反應10min，即得 AuNPs溶液，濃度為50μg/mL，用鋁箔覆蓋于反應瓶口并冷卻至室溫，置于4℃?zhèn)溆谩Ｈ鐖D2所示，為AuNPs的透射電鏡圖，表明合成的AuNPs為均勻分散的球形顆粒，無明顯的聚集現(xiàn)象，顆粒粒徑為18?20nm；如圖4所示，為AuNPs的紫外可見吸收光譜圖，其表面等離子共振吸收峰為521nm。
(2)AuNPs標記的檢測探針：
取抗ADB?BUTINACA的單克隆抗體1mg加入1mL磷酸緩沖鹽溶液配成濃度為1mg/mL 的抗ADB?BUTINACA的單克隆抗體溶液，備用。
制備AuNPs標記的識別ADB?BUTINACA的檢測探針(即膠體金標記檢測探針)：取50μ g/mL步驟(1)制備的AuNPs溶液1mL，用0.1M的碳酸鉀調(diào)節(jié)pH至8，加入10μL含有10μg抗ADBBUTINACA的單克隆抗體的磷酸緩沖鹽溶液共孵育1h，然后在室溫下旋轉(zhuǎn)混勻1h，再加入100μL，10％的牛血清白蛋白溶液封閉未反應的位點，離心13000rpm，10min，將所得到的1mg沉淀物重新分散于含10％蔗糖和1％血清白蛋白的1mL磷酸緩沖鹽溶液，得到AuNPs標記的檢測探針，濃度為1mg/mL，于4℃保存?zhèn)溆谩?/font>
(3)免疫層析試紙條的制備：
LFIA試紙條包括樣品墊、硝酸纖維素膜、吸收墊三個部分。將吸水紙剪裁為寬20mm 吸收墊，吸收墊不需進一步處理，將聚酯膜剪裁為寬20mm，并經(jīng)含3％蔗糖、0.05％曲拉通100、0.05mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.0)、磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4)浸泡2h，然后于37℃下烘干1h，即為樣品墊；如圖1所示，將硝酸纖維素膜2黏貼到聚氯乙烯平板6背襯底板中間位置，聚氯乙烯平板6背襯底板的兩端一端設置有樣品墊1，另一端設置有吸收墊 5，樣品墊1和吸收墊5各自的一端黏貼在聚氯乙烯平板6背襯底板上，另一端黏貼在硝酸纖維素膜上，分別與硝酸纖維素膜2重疊2mm，硝酸纖維素膜2的表面還設置一條檢測線3以及一條質(zhì)控線4，其中檢測線3靠近樣品墊1設置，質(zhì)控線4靠近吸收墊5設置。將吲唑酰胺類合成大麻素ADB?BUTINACA包被抗原配置成0.8mg/mL噴涂液，以1μL/cm的包被量噴涂到硝酸纖維素膜上形成檢測線3，將二抗配成濃度為1.0mg/mL的噴涂液，以1μL/cm的包被量噴涂到硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線4，與檢測線3的距離為4mm，與硝酸纖維素膜2末端的距離為6mm。
(4)免疫層析試紙條的檢測方法：取60μL待測樣品(ADB?BUTINACA，濃度為0～ 1000ng/mL)，加入步驟(2)制得的檢測探針12μL，混勻，靜置10min，再將混合溶液滴加到步驟(3)制備的試紙條的樣品墊上，樣品液在毛細管力的作用下往硝酸纖維素膜遷移，未與目標物結合的檢測探針與檢測線上的包被抗原進行特異性抗原抗體識別，將膠體金聚集于檢測線，多余探針聚集于質(zhì)控線；10min后，用Color Picker軟件測定比色試紙檢測線(T線)的 RGB值，與標準曲線對比，進行待測樣品中目標物濃度的定量分析。如圖6所示，為基于膠體金的比色免疫層析試紙條檢測吲唑酰胺類合成大麻素ADB?BUTINACA的顯色結果，對于濃度大于等于20ng/mL的樣品，檢測后試紙條檢測線顯色與陰性有明顯差異，檢測限為20ng/mL；對于濃度小于20ng/mL的樣品，檢測后試紙條檢測線顯色與陰性無明顯差異。如圖8所示，為基于膠體金的比色免疫層析試紙條檢測吲唑酰胺類合成大麻素ADB?BUTINACA的標準曲線圖，表明該檢測平臺檢測ADB?BUTINACA具有良好的線性，線性范圍為1?1000ng/mL，R2＝0.9932。
實施例2
(1)熒光微球標記的檢測探針：
取抗ADB?BUTINACA的單克隆抗體(同實施例1)1mg加入1mL磷酸緩沖鹽溶液配成濃度為1mg/mL的抗ADB?BUTINACA的單克隆抗體溶液，備用。
制備熒光微球標記的識別ADB?BUTINACA的檢測探針：
S1、制備熒光微球：取1mL苯乙烯單體(上海麥克林生化科技股份有限公司，貨號：S817904，CAS號：100?42?5)，11mL 3％過硫酸鉀水溶液，16mL無水乙醇在1200rpm攪拌下混合均勻，并加入1mL稀土配合物(上海麥克林生化科技股份有限公司，貨號：E808866，CAS號：1308?96?9)。在N2保護下，加熱到75℃，反應8h，即得熒光微球顆粒。
S2、將S1制備的熒光微球配置為濃度為10mg/mL溶液，(取100μL熒光微球用磷酸鹽緩沖液稀釋得10mg/mL)，如圖3所示，為熒光微球的透射電鏡圖，表明熒光微球為均勻分散的球形顆粒，無明顯的聚集現(xiàn)象，顆粒粒徑為200?210nm。如圖5所示，為熒光微球的熒光光譜圖，在365nm的激發(fā)下，于615nm處有明顯的發(fā)射峰，并且在紫外手電照射下呈現(xiàn)出明顯紅色熒光。取10mg/mL的熒光微球溶液40μL，加入960μL含1?(3?二甲基氨基丙基)?3?乙基碳二亞胺/N?羥基琥珀酰亞胺(濃度為10mg/mL)的磷酸鹽緩沖液，避光反應2h，再滴加40μL含有 20μg抗ADB?BUTINACA的單克隆抗體的磷酸緩沖鹽溶液共孵育，在室溫下將混合溶液避光攪拌4h，再加入100μL，10％的牛血清白蛋白溶液封閉未反應的位點，離心13000rpm，10min，即得熒光微球標記的檢測探針，濃度為1mg/mL。將所得到的1mg沉淀物用含10％蔗糖和1％血清白蛋白的1mL磷酸緩沖鹽溶液中，4℃保存?zhèn)溆?，即得熒光微球標記的檢測探針，濃度為1mg/mL。
(2)免疫層析試紙條的制備：
LFIA試紙條包括樣品墊、硝酸纖維素膜、吸收墊三個部分。將吸水紙剪裁為寬22mm 吸收墊，吸收墊不需進一步處理，將聚酯膜剪裁為寬25mm樣品墊，并經(jīng)4％蔗糖、0.08％曲拉通?100、0.08mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.0)、磷酸緩沖鹽溶液浸泡2.5h，然后于37℃下烘干2h，即為樣品墊；如圖1所示，將硝酸纖維素膜2黏貼到聚氯乙烯平板6背襯底板中間位置，聚氯乙烯平板6背襯底板的兩端一端設置有樣品墊1，另一端設置有吸收墊5，樣品墊1和吸收墊5各自的一端黏貼在聚氯乙烯平板6背襯底板上，另一端黏貼在硝酸纖維素膜上，分別與硝酸纖維素膜2重疊2mm，硝酸纖維素膜2的表面還設置一條檢測線3以及一條質(zhì)控線4，其中檢測線3靠近樣品墊1設置，質(zhì)控線4靠近吸收墊5設置。待檢測物吲唑酰胺類合成大麻素ADB?BUTINACA包被抗原配置成1.0mg/mL噴涂液，以1μL/cm的包被量噴涂到硝酸纖維素膜上形成檢測線，將二抗配成濃度為1.0mg/mL的噴涂液，以1μL/cm的包被量噴涂到硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線。
(3)免疫層析試紙條的檢測方法：取70μL待測樣品(ADB?BUTINACA，0?500ng/mL)，加入步驟(1)制得的檢測探針12μL，混勻，靜置10min，再將混合溶液滴加到試紙條的樣品墊上，樣品液在毛細管力的作用下往硝酸纖維素膜遷移，一段時間后，在紫外手電照射下，用智能手機對檢測結果圖拍照，經(jīng)ImageJ軟件分析檢測線的灰度值，與標準曲線對比，進行待測樣品中目標物濃度的定量分析。如圖7所示，為基于熒光微球的熒光免疫層析試紙條檢測吲唑酰胺類合成大麻素ADB?BUTINACA的顯色結果，對于濃度大于等于5ng/mL的樣品，檢測后試紙條檢測線熒光與陰性有明顯差異，檢測限為5ng/mL；對于濃度小于5ng/mL的樣品，檢測后試紙條檢測線熒光與陰性無明顯差異。相較于膠體金的比色信號，靈敏度提高了4倍。如圖9所示，為基于熒光微球的熒光免疫層析試紙條檢測吲唑酰胺類合成大麻素ADBBUTINACA的標準曲線圖，表明該檢測平臺檢測ADB?BUTINACA具有良好的線性，線性范圍為0.5?20ng/mL，R2＝0.9721。
實施例3
將實施例1制備的比色免疫層析試紙條(CM?LFIA)、實施例2制備的熒光免疫層析試紙條(TRF?LFIA)在檢測平臺進行檢測對比，如表1所示，采用實施例1或?qū)嵤├?/font>2中步驟 (3)試紙條檢測方法檢測，檢測人工尿液中的吲唑酰胺類合成大麻素ADB?BUTINACA含量的結果，回收率分別為92.26?109.6％、93.6?109.1％，相對標準偏差分別為3.01?6.3％、2.01?3.15％，表明比色、熒光兩種方法用于檢測人工尿液中的吲唑酰胺類合成大麻素ADB?BUTINACA的準確性高，檢測結果可靠。
基于膠體金的比色信號免疫層析試紙條用于合成大麻素的現(xiàn)場檢測，能裸眼讀出比色檢測信號，實現(xiàn)對目標物的快速定性；而基于熒光微球的熒光信號免疫層析試紙能進一步提高膠體金檢測的靈敏度，實現(xiàn)對目標物的準確定量，兩種試紙極大地滿足了合成大麻素的不同檢測需求。兩者結合使用，既能滿足一線民警對毒品快篩的定性檢測需求，同時也能實現(xiàn)毒品的現(xiàn)場半定量檢測，為犯罪人員的定罪提供一定參考。
表1 兩種層析試紙檢測人工尿液中的目標物含量的結果表
實施例4
為獲得最佳的檢測性能，系統(tǒng)地優(yōu)化了幾個對免疫層析試紙條至關重要的參數(shù)，按照實施例1和2的方法，僅改變需要優(yōu)化的參數(shù)，其他條件保持不變，優(yōu)化參數(shù)有：1.改變T 線上ADB?BSA的噴涂濃度，以探究T線上抗原濃度的影響；2.改變檢測探針的加入體積，以探究不同量的探針對檢測結果的影響；3.改變待測樣本的加入量，以探究樣本溶液體積對層析試紙條的影響。通過以上參數(shù)的優(yōu)化，最后得出最佳檢測條件。分別以ADB?BUTINACA標準溶液的濃度為50ng/mL或100ng/mL作為TRF?LFIA和CM?LFIA的陽性組，以PBS作為陰性對照，以陽性組(T)與陰性組(T0)的T線信號差值作為判斷標準，對兩種試紙的檢測參數(shù)進行優(yōu)化。
首先，對T線上包被抗原的噴涂濃度進行優(yōu)化，若噴涂濃度過小，無法捕獲到納米探針，從而無條帶顯色；若濃度過大，靈敏度會降低。改變TRF?LFIA的T線抗原濃度分別為 0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL，改變CM?LFIA的T線抗原濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.0mg/mL。結果如圖10A、D所示，TRF?LFIA在T線上抗原濃度為1.0mg/mL時T0?T最大，CM?LFIA在T線為 0.8mg/mL時T?T0最大。因此分別選擇1.0mg/mL、0.8mg/mL作為TRF?LFIA、CM?LFIA最佳的T線包被抗原濃度。其次，分別將6、8、10、12和14μL的Eu?CM?Ab(熒光微球標記的檢測探針)/ AuNPs?Ab(AuNPs標記的檢測探針)與待測樣本共孵育。隨著Eu?CM?Ab用量增加，T0?T值在14 μL時達到最大，但與12μL差異并不明顯，考慮到成本原因，選擇體積為12μL的探針進行后續(xù)實驗(圖10B)；隨著Au NPs?Ab用量增加，T?T0同樣在12μL時達到最大(圖10E)；最后，優(yōu)化待測樣本的加入量對檢測結果的影響，TRF?LFIA在加入的樣本體積為70μL時T0?T最大(圖 10C)，CM?LFIA在加入的樣本體積為60μL時T?T0最大(圖10F)。因此，分別選擇70μL、60μL作為TRF?LFIA、CM?LFIA的樣本體積。表1總結了TRF?LFIA、CM?LFIA的三個最佳檢測參數(shù)的檢測結果，T線(檢測線)上包被抗原的噴涂濃度分別為1.0mg/mL和0.8mg/mL、Eu?CM?Ab/ AuNPs?Ab探針的體積均為12μL以及樣本的體積分別為70μL和60μL。如圖10所示，TRF?LFIA 中(A)T線ADB?BSA噴涂濃度、(B)探針加入體積、(C)樣本加入體積的優(yōu)化；CM?LFIA中(D)T線ADB?BSA噴涂濃度、(E)探針加入體積、(F)樣本加入體積的優(yōu)化。
文章摘自國家發(fā)明專利，一種合成大麻素的檢測系統(tǒng)及其應用，發(fā)明人：鞠艷敏，戴建君，曾思琪，狄斌，李偉，申請?zhí)?/font>：202411149453.0，申請日：2024.08.21
