摘  要: 為探明噴施赤霉素影響漢麻生長發(fā)育的分子機理，本研究對赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)進行代謝組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)分析。代謝組分析結(jié)果表明，共鑒定到509個顯著差異表達代謝物，其中顯著上調(diào)及下調(diào)差異代謝物分別為230、279個，并對其進行化合物分類、相關(guān)性、VIP分析及KEGG代謝通路富集分析，獲得9條顯著富集通路。通過蛋白質(zhì)組分析得到757個顯著差異蛋白，其中顯著上調(diào)蛋白615個，顯著下調(diào)蛋白142個，并對GO功能及KEGG代謝通路等進行分析，獲得12條顯著富集通路。組學(xué)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，顯著性差異蛋白與差異代謝物主要集中在苯丙烷生物合成和各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑，通過噴施赤霉素調(diào)節(jié)漢麻抗逆性并調(diào)控漢麻木質(zhì)素過程，該研究為赤霉素調(diào)控漢麻生長發(fā)育的分子機理提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞:漢麻;赤霉素;蛋白質(zhì)組;代謝組;差異代謝通路

 

漢麻(Cannabis sativa L.)又稱“工業(yè)大麻”，為大麻科(Cannabaceae)大麻屬(Cannabis)的一年生草本植物。根據(jù)漢麻不同的應(yīng)用方向可分為纖用型、籽用型、籽纖兼用型及花葉用型(Gabarin et al.,2023)。漢麻是一種具有可持續(xù)性和高產(chǎn)能的工業(yè)用途作物(蘇芳芳等,2022)，其種植方法簡單、環(huán)境適應(yīng)性強、生長迅速等特性以及低碳環(huán)保等優(yōu)點，使其成為全球公認(rèn)的關(guān)鍵特種經(jīng)濟作物之一(Adesina et al.,2020)。

赤霉素(gibberellic acid，GA)參與種子休眠萌發(fā)、調(diào)控莖葉果實生長等生理過程(Rizza and Jones,2019)，利用赤霉素處理漢麻種子，能夠提高漢麻種子在干旱條件下的萌發(fā)率(Du et al.,2022)，適宜的赤霉素處理對作物生長發(fā)育及纖維產(chǎn)量起到促進作用。針對漢麻種植企業(yè)尋求高纖維漢麻品種需求，常規(guī)育種手段培育高纖維漢麻品種受制因素較多，難度較大，結(jié)合化學(xué)調(diào)控方法及分子育種手段擴大漢麻的經(jīng)濟效益也是一種科學(xué)有效的方法。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，赤霉素的生物合成調(diào)控在眾多模式作物上被逐步揭示(Tang et al.,2021)，其信號傳遞途徑的分子機制(Jing et al.,2024)及通路研究也取得進展(Bao et al.,2020)，應(yīng)對漢麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢，開展赤霉素調(diào)控漢麻生長發(fā)育的分子機制研究尤為重要。

多組學(xué)技術(shù)分析在植物中已被廣泛應(yīng)用，涉及多個層面。Deng等(2022)應(yīng)用代謝組與蛋白質(zhì)組分析白茶加工過程中類黃酮苷的變化機制，為白茶味道形成提供新的表征。也有學(xué)者通過代謝組與蛋白質(zhì)組分析不同浸泡溫度下大豆種子的分子變化(Min et al.,2020)。在生長激素調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育方向，綜合蛋白質(zhì)組和代謝組揭示了生長素(IAA)在煙草打頂后腋芽發(fā)育中的核心作用，揭示了IAA在調(diào)節(jié)腋芽生長中的關(guān)鍵作用(Zou et al.,2024)。在逆境脅迫育種工作中，也可以運用多組學(xué)聯(lián)合分析篩選及驗證關(guān)鍵基因(李潔和姚曉華,2019)。Jie等(2023)通過轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)苧麻的木質(zhì)素合成受外源赤霉素調(diào)控。本研究以噴施赤霉素為處理組，噴施水溶液為對照組，通過對代謝組、蛋白質(zhì)組進行分析，明確赤霉素處理漢麻后其差異代謝物、差異蛋白及相關(guān)代謝通路的變化，并通過組學(xué)聯(lián)合分析獲得響應(yīng)赤霉素處理的共有差異代謝通路，并分析其代謝物及基因，明確赤霉素處理后相關(guān)重要的代謝途徑，為解析赤霉素對漢麻生長發(fā)育的調(diào)控機制提供參考。

 

1 結(jié)果與分析

1.1 赤霉素處理下漢麻葉片的代謝組分析

通過對赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)漢麻葉片樣品進行代謝組測試，共獲得陽離子代謝物1138個，陰離子代謝物839個。根據(jù)VIP>1，Pvalue＜0.05條件篩選差異代謝物，赤霉素處理組(CL)和未處理組(CK)中篩選獲得顯著性差異代謝物509個，其中上調(diào)顯著性差異代謝物230個，下調(diào)顯著性差異代謝物279個(圖1)，下調(diào)代謝物顯著差異性較大。使用HMDB數(shù)據(jù)庫的化合物分類功能，對赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)的差異代謝物進行化合物分類，兩組間的差異代謝物主要為脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子(156個)、有機氧化合物(83個)、有機雜環(huán)化合物(66個)、有機酸及其衍生物(62個)等，脂質(zhì)分子及有機氧代謝物對漢麻噴施赤霉素響應(yīng)較大(圖2)。

  

圖1 赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)差異火山圖

注:橫坐標(biāo)為表達量倍數(shù)變化值,縱坐標(biāo)為差異變化顯著性,縱軸越上,顯著性越大;圖中點的大小及顏色代表VIP值及差異代謝物的變化形式

  

圖2 赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)差異代謝物分類

對差異代謝物豐度前30的代謝物進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示不同代謝物之間正(負(fù))相關(guān)系數(shù)的絕對值在0.1922~1，相關(guān)性幅度較大，并根據(jù)P value評價代謝物間相關(guān)性的顯著程度，且部分代謝物間相關(guān)差異較為顯著(圖3)。根據(jù)OPLS-DA分析得到的VIP值，選取VIP值排名前30的差異代謝物進行代謝物的表達量及VIP值分析，不同處理組間代謝物表達量較為一致，赤霉素處理組(CL)17個差異代謝物的表達量高于未處理組(CK)，13個差異代謝物的表達量低于未處理組(CK)(圖4a)，上調(diào)代謝物PC(2:0/TXB2)、Cyclohexyladenosine、Harderoporphyrin處理后組間差異較大，下調(diào)代謝物4-Hydroxy-2,6,6-trimethyl-3-oxo-1,4-cyclohexadiene-1-carboxaldehyde、Gibberellic acid、N-Linoleoyl Isoleucine處理后組間差異較大(圖4b)。

  

圖3 赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)代謝物相關(guān)性熱圖

注:圖中所示標(biāo)注均為代謝物名稱及代謝物聚類信息圖,紅色代表正相關(guān),藍色代表負(fù)相關(guān),絕對值越趨近于1,代表其相關(guān)性越高,*代表P<0.05，**代表P＜0.01,***代表p＜0.001

  

圖4 赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)代謝物的表達譜與VIP值

注:a圖為代謝物表達量聚類圖，b圖為VIP值條形圖,值的大小代表組間差異程度,P value越小,顏色越深,差異越顯著,*代表P<0.05，**代表P＜0.01,***代表p＜0.001

對顯著性差異代謝物進行KEGG通路注釋和富集分析，赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)漢麻的差異代謝物分布到53條代謝通路中。根據(jù)結(jié)果可知，在P＜0.05的條件下，發(fā)現(xiàn)9條顯著的富集通路，分別為花生四烯酸代謝、a-亞麻酸代謝、各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、苯丙烷生物合成、抗壞血酸和醛酸代謝、核苷酸代謝、單萜生物合成、嘧啶代謝、谷胱甘肽代謝。并且其中一些代謝物能夠同時影響多個代謝途徑(圖5)。在P＜0.01的條件下，發(fā)現(xiàn)4條具有極顯著性富集的通路，有花生四烯酸代謝、a-亞麻酸代謝、各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、苯丙烷生物合成，分別富集到9、5、8、5個差異代謝物(表1)。

  

圖5 赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)差異代謝物的KEGG富集分析

注:橫縱坐標(biāo)分別為富集因子和KEGG通路;氣泡的大小及顏色代表代謝物數(shù)量及顯著性

表1 KEGG通路富集詳情表

  

1.2 赤霉素處理下漢麻葉片的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

對進行蛋白質(zhì)組學(xué)測序的樣品進行SDS-PAGE電泳分析及BCA定量結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)電泳條帶清晰豐富，均一性良好(圖6)，BCA定量結(jié)果顯示蛋白總量大于50µg，滿足4D Labelfree蛋白組學(xué)測序要求(表2)。

  

圖6 赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)的SDS-PAGE電泳

注:Marker包含10種彩色預(yù)染的已知分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白,分子量范圍為10kD~180kD

表2 赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)樣品的蛋白質(zhì)量

  

對赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)漢麻樣品進行相關(guān)性熱圖分析及PCA分析，同組處理間樣品相關(guān)性結(jié)果良好，相關(guān)系數(shù)在0.98以上(圖7a)。蛋白定量PCA分析結(jié)果表明，赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)樣本分離顯著，說明經(jīng)過赤霉素噴施后處理效果較好(圖7b)。

  

圖7 樣本的相關(guān)性圖(a)及PCA得分圖(b)

利用4D-Label Free技術(shù)對CL和CK樣品進行蛋白定量分析，通過UniProt數(shù)據(jù)庫搜索鑒定共鑒定到肽段數(shù)量為565290個，鑒定到的蛋白數(shù)量為62001個，鑒定到的蛋白group數(shù)量為9261個。以P value＜0.05為參考，不同處理組間蛋白表達上調(diào)2倍以上(FC>2)為上調(diào)蛋白，蛋白表達下調(diào)0.5倍以上為下調(diào)蛋白(FC＜0.5)，共共篩選到757個差異蛋白，其中上調(diào)和下調(diào)蛋白個數(shù)分別為615和142個(圖8)。對兩組中的差異表達蛋白進行GO功能聚類分析，其中涉及生物過程的GO富集條目主要位于代謝過程、細(xì)胞過程，涉及細(xì)胞組分的GO富集條目主要位于細(xì)胞解剖實體、含蛋白質(zhì)復(fù)合物，涉及分子功能的GO富集條目主要位于結(jié)合、催化活性結(jié)合(圖9)。對兩處理組所鑒定到的差異表達蛋白進行亞細(xì)胞定位預(yù)測，其主要定位于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體(圖10)。

  

圖8 赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)的差異蛋白圖

  

圖9 赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)的差異蛋白GO注釋分析

  

圖10 赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)的差異蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測

為了進一步了解漢麻噴施赤霉素的差異蛋白在代謝途徑中的變化，將篩選出的差異蛋白映射到KEGG代謝通路上，進行通路注釋和富集分類分析，總計富集到96個代謝通路。根據(jù)KEGG富集分析，在P＜0.05的條件下，富集到12個顯著性差異的KEGG途徑，分別為光合作用、氰氨基酸代謝、類黃酮生物合成、苯丙烷生物合成、各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、核糖體、芪類化合物、二芳基庚烷類化合物和姜酚生物合成、托品烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成、植物晝夜節(jié)律、膦酸鹽和次膦酸鹽代謝、苯丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝通路(圖11)。在P＜0.01的條件下，發(fā)現(xiàn)7條具有極顯著性富集的通路，有光合作用、氰氨基酸代謝、類黃酮生物合成、苯丙烷生物合成、各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、核糖體、芪類化合物、二芳基庚烷類化合物和姜酚生物合成代謝通路，分別富集到26、19、16、26、13、39、7個差異蛋白(表3)，其中光合作用代謝途徑差異蛋白表達量24個上調(diào)，2個下調(diào)，其余代謝途徑差異蛋白均顯著上調(diào)。

 

圖11 赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)差異蛋白的KEGG富集分析

注:橫縱坐標(biāo)分別為富集因子和KEGG通路,氣泡的大小及顏色代表代謝物數(shù)量及顯著性

表3 KEGG通路富集詳情表

  

  

  

 

1.3 赤霉素處理下漢麻葉片的代謝組與蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析

對赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)的代謝組及蛋白質(zhì)組分析的KEGG通路可視化分析，蛋白質(zhì)組有96條KEGG代謝通路，代謝組有117條KEGG代謝通路，共有KEGG代謝通路44條(圖12)。

對蛋白組和代謝組共有的KEGG代謝通路進行分析，分析其在各通路富集的顯著性水平，根據(jù)各差異蛋白及代謝物KEGG通路顯著性富集結(jié)果，其中差異代謝物和差異蛋白的苯丙烷生物合成和各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路在P＜0.05水平下均顯著富集，木質(zhì)素合成相關(guān)蛋白表達發(fā)生改變，其代謝通路推測與赤霉素調(diào)控漢麻木質(zhì)素合成有重要關(guān)系(圖13)。

  

圖12 蛋白質(zhì)組與代謝組KEGG代謝通路韋恩圖

  

圖13差異蛋白/代謝物KEGG富集柱狀圖

注:橫軸為顯著性,值越大,通路富集越顯著,縱軸為通路名稱

為確定差異蛋白與差異代謝物的相關(guān)性，對二者基于皮爾森相關(guān)系數(shù)進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)小于0時，為負(fù)相關(guān)；大于0時，為正相關(guān)。

苯丙烷生物合成途徑富集到26個差異蛋白，共編碼8種酶，分別為caffeoyl-CoA O-methyltransferase(EC:2.1.1.104)、cinnamyl-alcohol dehydrogenase(EC:1.1.1.195)、phenylalanine ammonia-lyase(EC:4.3.1.24)、peroxidase(EC:1.11.1.7)、caffeic acid3-O-methyltransferase(EC:2.1.1.68)、4-coumarate-CoAligase(EC:6.2.1.12)、cinnamyl-alcohol dehydrogenase(EC:1.1.1.195)、shikimate O-hydroxycinnamoyltransferase(EC:2.3.1.133)、coniferyl-aldehydede hydrogenase(EC:1.2.1.68)，差異蛋白表達量相對未處理組均上調(diào)。該途徑共檢測到6個差異代謝物，代謝物均在赤霉素處理下表達量降低(圖14a)，差異蛋白與差異代謝物間的相關(guān)性均為負(fù)相關(guān)，且大部分均達到了顯著差異水平(圖14b)。

各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑富集到13個差異蛋白，共編碼2種酶，為beta-glucosidase(EC:3.2.1.21)、3''-deamino-3''-oxonicotianaminereductase(EC:1.1.1.285)，相對未處理組差異蛋白表達量均上調(diào)。該途徑共檢測到8個差異代謝物，在赤霉素處理下，Cannabigerolate、4-Hydroxycinnamoylagmatine、Epoxybergamottin三個代謝物的表達量上升(圖15a)且與差異蛋白呈正相關(guān)，其余5個代謝物表達量降低并與差異蛋白呈負(fù)相關(guān)，且大部分均達到了顯著差異水平(圖15b)。分析結(jié)果說明赤霉素處理后苯丙烷生物合成、各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成代謝途徑的相關(guān)代謝物及蛋白均受到調(diào)控，可能為漢麻響應(yīng)赤霉素調(diào)控的關(guān)鍵代謝物及蛋白。

  

圖14 苯丙烷生物合成途徑差異代謝物的含量熱圖(a)以及差異代謝物和差異蛋白之間的相關(guān)性熱圖(b)

注:*代表P<0.05，**代表P＜0.01,***代表p＜0.001

  

圖15 各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑差異代謝物的含量熱圖(a)以及差異代謝物和差異蛋白之間的相關(guān)性熱圖(b)

注:*代表P<0.05，**代表P＜0.01,***代表p＜0.001

 

2 討論

植物生長調(diào)節(jié)劑在農(nóng)業(yè)生長中發(fā)揮著重要的功效，赤霉素促進種子萌發(fā)、打破休眠，刺激植物細(xì)胞生長、提高作物株高，改善果實品質(zhì)，提高作物抗逆性等。針對不同作物，噴施適宜濃度的赤霉素增加經(jīng)濟作物產(chǎn)量，提高經(jīng)濟效益。赤霉素對株高具有促進作用，適宜赤霉素濃度噴施蘆葦導(dǎo)致其株高增高，植株生物量增加，噴施后還增加蘆葦?shù)睦w維素含量，降低木質(zhì)素含量，提高纖維利用率，提高經(jīng)濟效益(鄒小智等,2024)。噴施外源赤霉素有效緩解鹽堿脅迫下園林小菊的生長狀態(tài)，提高株高及葉片大小，增強園林小菊抗氧化及光合能力，提高產(chǎn)量(虎淘淘等,2024)。對生長期煙草噴施赤霉素溶液，處理后促進煙苗生長及加強病蟲害抵御能力、提高煙葉產(chǎn)量及質(zhì)量，較未處理組增產(chǎn)增收(張曉英等,2018)。赤霉素在分子層面調(diào)控水稻株高通常與赤霉素合成代謝相關(guān)基因、赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與傳遞、其他激素協(xié)同調(diào)控相關(guān)(范兆宇和張蕾,2024)。

在本研究中，在漢麻快速生長時期對植株進行赤霉素噴施，對赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)收集葉片樣品，進行漢麻的代謝組和蛋白組研究。

赤霉素處理后的代謝組分析顯示花生四烯酸代謝與a-亞麻酸代謝途徑代謝物表達量均得到改變，并均屬于脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子，證明赤霉素處理后與脂肪代謝相關(guān)。在高山被孢霉菌中，通過植物激素誘導(dǎo)后，可以改善其花生四烯酸的生物合成，提高脂肪酸和脂質(zhì)的生物合成(Zhang et al.,2019)。a-亞麻酸作為茉莉酸類物質(zhì)合成的起點，影響茉莉酸合成基因合成，在植物抗逆性調(diào)控方向發(fā)揮作用。

蛋白質(zhì)組分析中，檢測到顯著上調(diào)差異蛋白占總數(shù)量的80%，說明赤霉素處理后漢麻蛋白表達有顯著的差異，KEGG富集通路與代謝組富集通路差異較大。光合作用為作物生長發(fā)育重要的影響因素，有學(xué)者揭示光與赤霉素協(xié)同調(diào)控植物發(fā)育的新機制(Li et al.,2016)，在本研究中光合作用通路蛋白含量變化較大，26個差異蛋白表達量僅有2個下調(diào)，其余均為上調(diào)蛋白，下調(diào)蛋白參與編碼了光系統(tǒng)Ⅰ中PsaH、PsaK基因，上調(diào)蛋白參與編碼光系統(tǒng)Ⅰ中PsaA、PsaB及光系統(tǒng)Ⅱ中PsbA、PsbB、PsbC、PsbD、PsbS基因，證明在噴施赤霉素后，光合系統(tǒng)的相關(guān)基因可能對漢麻的生長發(fā)育起到一定調(diào)控作用。植物類黃酮生物合成途徑差異蛋白表達量在赤霉素處理后均上調(diào)，分別參與編碼花青素還原酶(ANR)、香豆素合成酶(CHS)、類黃酮醇合成酶(FLS)等，赤霉素處理后有可能誘導(dǎo)這些變化基因的表達，也有學(xué)者通過鑒別銀杏類黃酮生物合成代謝途徑的基因家族，發(fā)現(xiàn)該途徑的基因家族的相關(guān)基因受激素、脅迫等方面誘導(dǎo)(Liu et al.,2022)。對兩組學(xué)KEGG富集通路比較分析，赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)中顯著性差異蛋白與差異代謝物主要集中在苯丙烷生物合成和各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成等途徑，可能為赤霉素對漢麻木質(zhì)素合成調(diào)控的關(guān)鍵代謝途徑。在苧麻上已證明外源赤霉素調(diào)控苧麻的木質(zhì)素合成(Jie et al.,2023)，外源赤霉素還在玉米上調(diào)控玉米的木質(zhì)素合成，從而介導(dǎo)玉米葉片的節(jié)律生長(Yao et al.,2024)。

苯丙烷生物合成代謝途徑是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，在適應(yīng)環(huán)境變化及抵御外界脅迫中有重要作用，木質(zhì)素途徑和類黃酮途徑為該代謝途徑中最重要的兩個分支途徑(Dong and Lin,2021)。在赤霉素處理后，通過蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)漢麻苯丙烷生物合成代謝途徑上游底物酶被依次催活，代謝組發(fā)現(xiàn)相關(guān)植物木質(zhì)素組成相關(guān)代謝物發(fā)生變化，促進漢麻木質(zhì)素途徑，參與漢麻細(xì)胞木質(zhì)化，提高抗逆性。

各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑在植物中尤為重要，β-葡萄糖苷酶為該代謝途徑中重要的酶，其在植物細(xì)胞壁的木質(zhì)化，植物激素激活等方面發(fā)揮著重要作用(Xu et al.,2024)，噴施赤霉素處理后，漢麻植株中編碼β-葡萄糖苷酶的蛋白表達提高，響應(yīng)赤霉素誘導(dǎo)，但具體關(guān)鍵基因還需進一步探究。

本研究通過組學(xué)分析得到了赤霉素處理后的差異蛋白質(zhì)及差異代謝物，并通過組學(xué)聯(lián)合分析獲得共有代謝通路，獲得響應(yīng)赤霉素處理的漢麻差異表達蛋白及差異代謝物，但差異數(shù)量較多，還需進一步篩選驗證，下一步通過過表達技術(shù)驗證關(guān)鍵基因，該研究在組學(xué)層面為赤霉素調(diào)控漢麻生長發(fā)育的分子機制提供了理論參考及數(shù)據(jù)支撐，為赤霉素應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

 

3 材料與方法

3.1 試驗材料與處理

采取盆栽方式在黑龍江省科學(xué)院大慶分院戶外棚室內(nèi)進行試驗，供試材料品種為‘火麻一號’，適宜東北地區(qū)播種，纖用型漢麻品種，由黑龍江省科學(xué)院大慶分院選育并提供種質(zhì)資源。挑選整齊飽滿的漢麻種子至于裝有混合基質(zhì)(草炭:蛭石:珍珠巖=3:1:1)的塑料育苗盒(7cm×7cm×7cm)中，置于透明育苗盒中培養(yǎng)，常規(guī)栽培管理。出苗后選取長勢一致的健壯植株，移入室外盆栽中進行培養(yǎng)。

盆栽中漢麻生長至快速生長期進行赤霉素噴施，均勻噴施于漢麻葉片，噴施漢麻植株的赤霉素采自上海麥克林生化科技有限公司，赤霉素噴施濃度設(shè)置為50mg/L，噴施赤霉素為處理組(CL)，噴施水溶液為對照組(CK)，噴施溶液100mL直至葉片完全濕潤，每組各15個盆栽，每盆8株長勢一致的漢麻植株，各3次生物學(xué)重復(fù)，正常田間栽培管理措施。待噴施赤霉素7d后，選取葉片部位，取材后用無菌水將葉片表面的灰塵及泥土沖洗干凈，用吸水紙吸干表面液體，收集后立即儲存于離心管中，置于液氮中速凍，并存于-80℃超低溫冰箱中，整齊樣品進行組學(xué)分析。

3.2 代謝物提取與分析

3.2.1 樣品的制備

代謝物提取所需提取液為含0.02mg/mL內(nèi)標(biāo)的80%甲醇水溶液，內(nèi)標(biāo)采用L-2-氯苯丙氨酸。取冷凍干燥樣品60mg與500μL提取液混合后在冷凍條件下研磨充分(6min,-10℃,50Hz)，研磨結(jié)束后對混合液進行超聲提取，提取時間為30min，頻率為40kHz，溫度為5℃。提取后在冷凍條件下靜置30min，隨后4℃條件下13000g轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液上級分析。質(zhì)控樣本(quality control, QC)通過選取赤霉素處理組(CL)與未處理組(CK)樣本混合物，在分析進程中，質(zhì)控樣本與分析樣品以10:1進行插入分析，通過質(zhì)控樣本檢驗分析過程的準(zhǔn)確性。

3.2.2 樣品的色譜質(zhì)譜分析

分析所用儀器為超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜儀。色譜柱采用直徑1.8µm,100mm×2.1mm規(guī)格的HSST3色譜柱。流動相A為5%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)，流動相B為乙腈和異丙醇水溶液(含0.1%甲酸)。液相流速及柱溫條件為0.4mL/min,40℃。

采用正負(fù)離子掃描獲取質(zhì)譜信號，以70~1050m/z范圍進行質(zhì)譜掃描，噴霧電壓分別設(shè)置為正負(fù)3500V，鞘氣、輔助氣流速分別為50psi、13psi，輔助氣加熱溫度、離子傳輸溫度分別為425℃、325℃，循環(huán)碰撞能為20-40-60V。一級、二級質(zhì)譜分辨率為60000、7500，DDA模式采集數(shù)據(jù)，質(zhì)譜儀示值誤差、重復(fù)性和穩(wěn)定性選擇四種國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(大豆苷元或槲皮素,利血平和人參皂苷Rb1或人參皂苷Rg1,氯霉素)進行校準(zhǔn)。

3.2.3 代謝物定量分析

儀器分析結(jié)束后，利用Progenesis QI軟件對原始數(shù)據(jù)進行分析，以獲得數(shù)據(jù)矩陣，該矩陣包含保留時間、質(zhì)荷比及峰強度，利用代謝公共數(shù)據(jù)庫(HMDB)、METLIN數(shù)據(jù)庫及美吉生物公司自建數(shù)據(jù)庫進行匹配MS和MSMS質(zhì)譜信息，代謝物信息上傳美吉云平臺進行分析(Ren et al.,2022)。兩處理間的代謝物顯著差異評判基于OPLS-DA模型，顯著差異代謝物評判標(biāo)準(zhǔn)為變量權(quán)重值(VIP)>1及P＜0.05。差異代謝物的代謝通路通過KEGG數(shù)據(jù)庫進行注釋，獲得差異代謝通路，并通過R語言及美吉云平臺進行篩選分析等。

3.3 蛋白提取及分析

3.3.1 蛋白提取

在樣品中加入蛋白提取液進行蛋白提取，處理組與對照組各3次重復(fù)，蛋白含量通過BCA法確定，并通過SDS-PAGE進行電泳檢測分析，檢測6個樣品的蛋白濃度是否滿足蛋白組學(xué)分析(梁文軒等,2023)。

3.3.2 蛋白酶解及肽段脫鹽定量

將提取后的蛋白樣品通過TEAB法(三乙基碳酸氫銨緩沖液)進行充分溶解，在37℃條件下加入Trypsin酶解過夜，酶解后對肽段進行復(fù)溶、脫鹽及定量。

3.3.3 樣品的色譜質(zhì)譜分析

液相分析所用儀器為EASY-nLC 1200系統(tǒng)，色譜柱采用75µm×25cm規(guī)格的C18色譜柱。流動相A為含0.1%甲酸的2%乙腈溶液，流動相B為含0.1%甲酸的80%乙腈溶液，酶解后的肽以300nL/min的流速進行分離。液相色譜分離后的樣品用儀器為timsTOF Pro2質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析，電噴霧電壓設(shè)置為1.5kV。質(zhì)譜結(jié)束后將原始數(shù)據(jù)通過MaxQuant version 2.0.3.1軟件進行搜庫分析，將FDR≤0.01(錯誤發(fā)現(xiàn)率)為肽段鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

3.3.4 生物信息學(xué)分析

通過美吉云平臺對原始數(shù)據(jù)進行分析，通過R語言確定顯著性P值和差異倍數(shù)(fold change,FC)，差異倍數(shù)(fold change>2或＜0.5)且P＜0.05，分別定義為差異顯著上調(diào)蛋白及差異顯著下調(diào)蛋白。差異蛋白的GO注釋通過GO數(shù)據(jù)庫進行分析。通過KEGG數(shù)據(jù)庫進行差異蛋白的代謝通路注釋，獲得差異代謝通路，并通過R語言及美吉云平臺進行篩選分析等。

3.4 組學(xué)聯(lián)合分析

代謝組與蛋白組的關(guān)聯(lián)分析是通過基于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司自建應(yīng)用程序進行的，將相同分組的差異蛋白及差異代謝物基于R語言整合到KEGG代謝通路上，獲得共同參與通路數(shù)及進行可視化分析。

 

作者貢獻

高宇、邊境、李學(xué)海是本研究的實驗設(shè)計者和實驗研究的執(zhí)行人；李學(xué)海、邊境、曹焜參與數(shù)據(jù)整理及論文初稿的寫作；李學(xué)海、邊境、高宇、王曉楠參與部分實驗；高宇是項目的負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)統(tǒng)計、論文寫作與修改。全體作者都同意最終的文本。

 

致謝

本研究由黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務(wù)費項目(CZKYF2023-1-B018)資助。

 

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文章摘自:李學(xué)海，邊境，曹焜，王曉楠，張曉艷，高宇．赤霉素處理下漢麻的代謝組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J/OL]．分子植物育種.https://link.cnki.net/urlid/46.1068.S.20250331.1526.004。