摘要：本研究以羅布紅麻種子和愈傷組織為外植體，采用不同濃度的秋水仙素進(jìn)行誘變處理，通過出芽率、誘導(dǎo)率等指標(biāo)測(cè)定，以及形態(tài)觀察、DNA含量檢測(cè)、根尖染色體計(jì)數(shù)、熒光FISH分析等，開展誘變植株倍性鑒定。結(jié)果表明，以濃度為0.1%的秋水仙素溶液浸泡羅布紅麻種子24h，可獲得較高的羅布紅麻種子出芽率和植株形態(tài)變異率，種子出芽率達(dá)70.10%以上，植株形態(tài)變異率為14.21%，可以作為羅布紅麻種子多倍體誘導(dǎo)的最佳方式。本研究創(chuàng)制了羅布紅麻新種質(zhì)和育種材料，為羅布紅麻遺傳改良研究提供理論依據(jù)。
關(guān)鍵詞：羅布紅麻;秋水仙素誘導(dǎo);核型鑒定;熒光原位雜交;種質(zhì)創(chuàng)制
羅布麻是夾竹桃科羅布麻屬(Apocynum)的一類多年生宿根草本植物，具有分蘗能力強(qiáng)，適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)(Li et al., 2023a)。中國(guó)分布的羅布麻主要有羅布紅麻(Apocynum venetum L.)及羅布白麻(Apocynum hendersonii Hook.f.)2種，其中羅布紅麻分布在長(zhǎng)江、淮河、秦嶺和昆侖山以北的廣大地區(qū)，是防風(fēng)固沙、減少水土流失和鹽堿地改良的理想植物之一(姜黎等,2018; Li et al., 2023b)。除此以外，羅布紅麻全身均可以入藥，具有降血壓、降血脂、鎮(zhèn)靜、安神等功效(許澤恭等,2021;Liu et al., 2022)；其韌皮纖維也具強(qiáng)力大，柔軟挺括滑爽、耐濕抗菌防腐、散熱快和透氣性好等特點(diǎn)，極具生態(tài)和經(jīng)濟(jì)雙重效益(Huang et al., 2023)。中國(guó)的羅布麻仍主要處于野生狀態(tài)。每年冬季，地上部分自然死亡，次年開春新生枝條從根蘗部位發(fā)生，盡管通過適度的刈割、平茬等能夠刺激新生枝條的萌蘗和生長(zhǎng)。但目前大部分野生資源處于株叢衰老、密度下降、低矮、稀疏的退化狀態(tài)，單位面積產(chǎn)量很低，嚴(yán)重制約了羅布麻資源效益的發(fā)揮和當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展(Jiang et al., 2021)。此外，羅布紅麻屬高度自花授粉植物，天然雜交率在0.5%以下(Gao et al., 2019)，優(yōu)勢(shì)雜交種創(chuàng)制與應(yīng)用中存在的技術(shù)瓶頸，長(zhǎng)期連續(xù)自花傳粉容易導(dǎo)致品種衰退，嚴(yán)重制約了羅布紅麻育種創(chuàng)新。因此，開展羅布麻資源綜合評(píng)價(jià)與精準(zhǔn)鑒定，通過引種馴化、遺傳多樣性保護(hù)以及新種質(zhì)創(chuàng)制等技術(shù)措施，篩選出耐旱、耐鹽堿、耐寒、耐高溫、抗風(fēng)沙能力強(qiáng)的生態(tài)修復(fù)型，以及株型緊湊、分枝少、光合效率高、耐鹽堿性強(qiáng)、產(chǎn)量高、多抗的功能保健型或纖維型羅布麻新品種(系)，對(duì)促進(jìn)羅布麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展，變資源優(yōu)勢(shì)為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，帶動(dòng)區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義?；瘜W(xué)誘導(dǎo)法是多倍體育種工作中最常見的方法，具有適用范圍廣、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠和誘導(dǎo)率高的特點(diǎn)(武振華等,2005)，用秋水仙素處理植物分裂旺盛的幼嫩部位可以使染色體數(shù)目加倍，從而獲得多倍體。多倍體植株由于染色體數(shù)目的增加，其遺傳多樣性顯著提高，植株具有抗逆性增強(qiáng)、內(nèi)含物質(zhì)增加、果實(shí)增大、無子果實(shí)、觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值增加等價(jià)值(Corneillie et al., 2019; Madani et al.,2021)。本研究以羅布紅麻種子和愈傷組織為材料，采用不同濃度的秋水仙素進(jìn)行誘變處理，研究了誘變時(shí)間、秋水仙素處理濃度等因素對(duì)誘變率的影響，通過形態(tài)觀察、DNA含量檢測(cè)、根尖染色體計(jì)數(shù)及染色體熒光FISH分析等鑒定得到四倍體植株，為羅布紅麻創(chuàng)制新種質(zhì)提供依據(jù)，并為羅布紅麻遺傳育種新途徑開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
1. 結(jié)果與分析
1.1. 以種子為外植體的羅布紅麻多倍體誘導(dǎo)
同一誘導(dǎo)時(shí)間下，羅布紅麻種子出芽率隨著秋水仙素濃度增加而顯著降低，形態(tài)變異率隨著秋水仙素濃度增加而顯著增加，這表明高濃度的秋水仙素溶液具有抑制羅布紅麻種子萌發(fā)而促進(jìn)形態(tài)變異的作用，其中，當(dāng)濃度增加至0.20%以上時(shí)，羅布紅麻的出芽率較低，約為50%，且下降幅度最大，約為20%。同一秋水仙素濃度下，羅布紅麻種子出芽率均隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而降低，形態(tài)變異率隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，這表明增加誘導(dǎo)時(shí)間具有抑制種子萌發(fā)而而促進(jìn)形態(tài)變異的作用，其中，當(dāng)秋水仙素濃度增加至0.10%時(shí)，羅布紅麻植株的形態(tài)變異率出現(xiàn)顯著增加，增長(zhǎng)幅度為10%，誘導(dǎo)時(shí)間為24h時(shí)的形態(tài)變異率為14.21%；未用秋水仙素處理的羅布紅麻對(duì)照組具有最高的出芽率，約94.87%，形態(tài)變異率最低，為0%。
表1秋水仙素浸泡法對(duì)羅布麻種子的影響
注: 數(shù)值為3次重復(fù)的平均值
1.2. 以愈傷組織為外植體的羅布紅麻多倍體誘導(dǎo)
隨著秋水仙素濃度升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)，植株存活率明顯降低，培養(yǎng)20d后出現(xiàn)不定芽的變褐和死亡。未用秋水仙素處理的對(duì)照組不同誘導(dǎo)時(shí)間均未出現(xiàn)變異植株。當(dāng)秋水仙素濃度為0.001%、處理時(shí)間8h時(shí)未誘導(dǎo)出多倍體，而其他處理組均可誘導(dǎo)出多倍體，形態(tài)變異率為1.24%～37.11%。其中0.08%秋水仙素處理24h時(shí)的形態(tài)變化率最高，為37.11%，但存活率最低，為10.21%。
表2秋水仙素混培法對(duì)羅布紅麻愈傷組織形成的影響
注: 數(shù)值為3次重復(fù)的平均值
2. 羅布紅麻多倍體的鑒定
2.1. 植株葉片形態(tài)學(xué)鑒定
羅布紅麻對(duì)照株與誘變株的形態(tài)特征結(jié)果顯示(圖1)，羅布紅麻誘變植株葉片的長(zhǎng)度和寬度均高于二倍體對(duì)照植株，葉形指數(shù)則相反(表3)。對(duì)二者植株的整體形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)誘變株與二倍體植株相比，它的莖稈粗壯，葉片較厚，顏色較深，生長(zhǎng)較緩慢。
圖1羅布紅麻二倍體對(duì)照株和誘變株葉片
注: A: 二倍體羅布紅麻對(duì)照植株的老葉(上)和新葉(下); B: 羅布紅麻誘變植株的老葉(上)和新葉(下)
表3羅布紅麻二倍體對(duì)照株和誘變株葉片外形指數(shù)
對(duì)羅布紅麻對(duì)照株和誘變株葉片的正面、背面及氣孔的掃描電鏡觀察(圖2)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照株相比，誘變株葉片的表皮細(xì)胞較大。經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)處理后的多倍體植株的氣孔大小及氣孔密度均會(huì)發(fā)生變化，羅布麻的氣孔主要分布在葉片背面，氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞凹入葉片表面，且觀察發(fā)現(xiàn)誘變株的保衛(wèi)細(xì)胞的寬度和長(zhǎng)度均大于對(duì)照株。
圖2羅布紅麻對(duì)照株與誘變株葉片及氣孔的掃描電鏡圖
注: A: 對(duì)照株葉片正面; B: 誘變株葉片正面; C: 對(duì)照株葉片背面; D: 誘變株葉片背面
2.2. 體細(xì)胞DNA含量分析
通過流式細(xì)胞儀觀察植株在FL2-H熒光通道的熒光強(qiáng)度(DNA G0/G1峰)，誘變株與對(duì)照株(二倍體)的DNA含量存在明顯差異(圖3)。對(duì)照株的DNA G0/G1峰位于4313.66通道，而誘變株的DNA G0/G1峰位于7201.72通道，這說明羅布紅麻植株經(jīng)過秋水仙素誘導(dǎo)處理后，其DNA相對(duì)含量約為普通二倍體植株的2倍，即該誘變株為四倍體。
圖3羅布紅麻細(xì)胞核DNA相對(duì)含量
注: A: 二倍體; B: 四倍體
2.3. 根尖染色體計(jì)數(shù)
通過壓片法對(duì)羅布紅麻二倍體和經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定后的誘變株的幼嫩根尖進(jìn)行染色體數(shù)目觀察(圖4)，羅布紅麻二倍體植株的染色體數(shù)目為2n=2x=22，經(jīng)形態(tài)鑒定和流式細(xì)胞儀篩選出的羅布紅麻四倍體植株的染色體數(shù)目為2n=4x=44。
圖4羅布紅麻染色體計(jì)數(shù)法鑒定(光學(xué)顯微鏡100)
注: A: 2n=2x=22; B: 2n=4x=44
2.4. 染色體核型分析與熒光FISH鑒定
染色體核型分析是確定染色體數(shù)目的重要手段之一。根尖染色體核型鑒定結(jié)果表明，二倍體羅布紅麻植株的細(xì)胞染色體為2n=2x=22。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定過的誘變株的細(xì)胞染色體數(shù)為2n=4x=44，是二倍體植株染色體數(shù)目的2倍，證實(shí)該誘變株為四倍體(圖5)。對(duì)羅布紅麻二倍體與四倍體分別利用18SrDNA和5SrDNA重讀序列探針進(jìn)行熒光原位雜交，結(jié)果顯示，在二倍體的22條染色體中，有1對(duì)5SrDNA信號(hào)；在四倍體的44條染色體中，有2對(duì)較明顯的18SrDNA信號(hào)。
圖5羅布紅麻染色體核型熒光分析
注: A: 二倍體; B: 多倍體; DAPI染色為藍(lán)色; 18SrDNA, 5SrDNA熒光原位雜交信號(hào)分別為綠色和紅色
3. 討論
羅布麻具有很高的藥用價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值及生態(tài)價(jià)值，近年來，羅布麻資源面積逐漸萎縮，單位面積產(chǎn)量低，并且我國(guó)羅布麻的種類單一，嚴(yán)重制約了羅布麻資源的開發(fā)和利用。多倍體育種能夠通過染色體加倍從而提高植物的產(chǎn)量及抗病性等，是新種質(zhì)創(chuàng)制的有效方法。在本研究中，首先通過以不同的外植體為材料，設(shè)置了秋水仙素誘導(dǎo)濃度梯度及誘導(dǎo)時(shí)間，篩選出羅布紅麻種子誘導(dǎo)多倍體的最適條件是以0.1%的秋水仙素浸泡種子24h，這能保證在具有較高的發(fā)芽率的同時(shí)具有較高的形態(tài)變異率。目前沒有對(duì)羅布紅麻多倍體誘導(dǎo)條件的研究報(bào)道，在其他植物的研究中發(fā)現(xiàn)不同植物種子誘導(dǎo)多倍體的秋水仙素處理的最適條件不同。李娟娟等(2022)用秋水仙素對(duì)黃連木(Pistacia chinensis)萌動(dòng)種子進(jìn)行浸泡時(shí)發(fā)現(xiàn)最佳誘導(dǎo)組合是0.2%的秋水仙素溶液浸泡36h和0.3%的秋水仙素溶液浸泡12h，其誘導(dǎo)率可達(dá)到38.10%。程志號(hào)等(2020)發(fā)現(xiàn)混培法下0.005%的秋水仙素培養(yǎng)5d是火龍果(Hylocereus undulatus britt)多倍體誘導(dǎo)的最佳條件。在本研究中發(fā)現(xiàn)，秋水仙素對(duì)種子等的毒性會(huì)隨著處理時(shí)間和濃度的升高而增強(qiáng)，這與魏卓等(2020)的研究結(jié)果類似，推測(cè)秋水仙素的處理濃度和時(shí)間可能與種子的類型有關(guān)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度對(duì)羅布紅麻種子出芽率及形態(tài)變異率的影響較大，同一濃度下處理時(shí)間對(duì)出芽率和形態(tài)變異率影響較小。0.1%和0.2%的秋水仙素濃度處理下，羅布紅麻種子的出芽率降幅最大，但在同一秋水仙素濃度下，其發(fā)芽率、形態(tài)變異率最大僅相差10.1%和6.41%。綜上所述，誘導(dǎo)羅布紅麻多倍體最主要的是選擇合適的秋水仙素處理濃度。多倍體鑒定一般通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)及流式細(xì)胞儀等進(jìn)行鑒定。本研究首先通過形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)對(duì)羅布紅麻誘變植株進(jìn)行鑒定，篩選出莖桿粗、葉片大而厚，葉色深的誘變株，通過掃描電鏡觀察到誘變株與對(duì)照株相比，其氣孔密度變小、保衛(wèi)細(xì)胞變大，這與前人的研究相似(張虹等,2017;張廣楠等,2021)。由于根尖的染色體之間相互重疊等導(dǎo)致難以數(shù)清染色體條數(shù)。形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定快捷簡(jiǎn)便，但準(zhǔn)確性不高，需要再進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。流式細(xì)胞儀、染色體核型分析可以準(zhǔn)確直觀地確定出染色體的條數(shù)，鑒定出植株的倍性。經(jīng)鑒定，羅布紅麻正常的二倍體植株染色體條數(shù)為22條，經(jīng)過鑒定確定經(jīng)過誘變的四倍體植株的染色體數(shù)為44條。與染色體核型分析相比，流式細(xì)胞儀方便快捷，通過植株G0/G1峰的細(xì)胞核DNA含量迅速準(zhǔn)確地判斷出同一物種的不同倍性，因此被普遍用于植株倍性鑒定。本研究最終成功誘導(dǎo)鑒定出的四倍體羅布紅麻植株在形態(tài)上與二倍體植株差異顯著，四倍體植株的莖更粗壯、葉片更厚更大、葉色更深，同時(shí)其葉片的細(xì)胞和氣孔更大。在進(jìn)行羅布紅麻多倍體鑒定時(shí)，形態(tài)學(xué)鑒定可以作為篩選鑒定多倍體的有效方法之一，可以顯著減少工作量。由于形態(tài)學(xué)鑒定的準(zhǔn)確率較低，因此仍需通過流式細(xì)胞儀和染色體核型分析等手段進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。本研究成功誘導(dǎo)出羅布紅麻四倍體，為羅布麻的新種質(zhì)的研究提供了參考。
4. 材料與方法
4.1. 試驗(yàn)材料
本研究所用的羅布紅麻種子來自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所國(guó)家種質(zhì)資源譜，愈傷組織是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所的二倍體羅布紅麻的葉片脫分化得到的。
4.2. 多倍體誘導(dǎo)處理
4.2.1. 浸泡法
將二倍體羅布紅麻種子浸泡于0(對(duì)照)、0.01%、0.03%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%的秋水仙素?zé)o菌溶液中，在搖床(80～100r/min)上分別培養(yǎng)8h、16h、24h，共21個(gè)處理組合，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。處理結(jié)束后，用無菌水沖洗3～4次，每次5min，用無菌濾紙吸干表面水分后播于穴盤。
4.2.2. 混培法
將秋水仙素加入到分化培養(yǎng)基(MS+0.5mg/LTDZ+0.03mg/L2,4-D+0.01mg/LIAA)中，配制成質(zhì)量濃度為0.001%、0.005%、0.020%、0.040%、0.080%的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，無菌水為對(duì)照，將愈傷組織接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，設(shè)置8h、16h、24h3個(gè)處理時(shí)間，處理結(jié)束后轉(zhuǎn)入未加秋水仙素的普通分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基(MS+0.01mg/LNAA)中進(jìn)行生根培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)其出芽率和形態(tài)變異率。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
4.3. 多倍體鑒定方法
4.3.1. 形態(tài)學(xué)鑒定
根據(jù)誘變苗與二倍體羅布紅麻的葉片形態(tài)特征，初步篩選出形態(tài)變異株。通過掃描電鏡觀察羅布紅麻對(duì)照株和誘變株葉片表皮及氣孔形態(tài)。
4.3.2. 流式細(xì)胞儀
取待測(cè)幼嫩羅布麻植株葉片50～100mg，置于預(yù)冷的平面玻璃板上，加入預(yù)冷的MgSO4解離液0.5～1mL，用刀片迅速切碎，于冰上放置5～10min，用300目的無菌細(xì)胞篩網(wǎng)過濾至預(yù)冷的EP管中，41000r/min離心8min，棄去部分上清后使剩余液體約為500μL，加入20μL的RNA酶混勻，冰上放置5min，避光加入50～100μL碘化丙錠(PI)染液冰上染色30min，用300目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾到上樣管中，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣品收集20000個(gè)細(xì)胞核。
4.3.3. 根尖染色體計(jì)數(shù)
以幼嫩的根尖為材料制片，取10個(gè)嫩白色根尖(3～4mm)于3mL飽和對(duì)氯二苯中10～20處理2h，轉(zhuǎn)入0.075mol/L的氯化鉀溶液，室溫處理30min，換入2.5%混合酶液(5%果膠酶+5%纖維素酶)室溫酶解1h，期間輕搖2次。酶解完成后，用蒸餾水浸洗2次后迅速加入新鮮配置的甲醇-冰醋酸(3:1)固定液，固定30min以上。取2～3條根尖放于提前冰凍好的載玻片上，切去根尖上端1mm，制成烤片，在卡寶品紅中染色5h以上，在Olympus顯微鏡下觀察并拍照統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。
4.3.4. 染色體核型分析與熒光FISH鑒定
分別取發(fā)芽后的羅布紅麻普通二倍體植株和誘導(dǎo)多倍體植株活躍的分生組織(幼嫩根尖)，用N2O處理誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂，獲得大量處于中期的細(xì)胞，進(jìn)行染色體標(biāo)本制作，通過高分辨率的顯微鏡和成像設(shè)備，觀察到清晰而直觀的染色體形態(tài)和數(shù)目。利用重復(fù)序列探針，通過熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，利用熒光顯微鏡觀察，進(jìn)行染色體組核型的精準(zhǔn)鑒定。
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文章摘自：王悅，黃曉鈺，陳平，陳繼康，陳坤梅，陳佳，高鋼，朱愛國(guó)．羅布紅麻多倍體誘導(dǎo)條件優(yōu)化及生物學(xué)特征變化分析[J/OL]．分子植物育種.
