摘 要：目的TCP基因家族在植物葉片發(fā)育、側(cè)枝形成、花器官形成、植物激素合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。對(duì)工業(yè)大麻Cannabis sativa TCP基因進(jìn)行全基因組鑒定及表達(dá)分析為工業(yè)大麻TCP基因家族的功能分析提供科學(xué)參考。方法 基于已發(fā)布的工業(yè)大麻基因組，利用生物信息學(xué)方法對(duì)工業(yè)大麻TCP基因家族成員進(jìn)行鑒定并對(duì)其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、以及表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果 共鑒定出17個(gè)工業(yè)大麻TCP基因（Cs TCP1～Cs TCP17）分為2類(lèi)3個(gè)亞科（PCF、CIN和CYC/TB1），編碼的氨基酸長(zhǎng)度在163～585 aa，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為18 310～64 070，蛋白等電點(diǎn)介于4.99～9.36，亞細(xì)胞定位大部分為細(xì)胞核。共線(xiàn)性進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，工業(yè)大麻與擬南芥、番茄、水稻分別存在9、20和6對(duì)同源基因。順式元件預(yù)測(cè)結(jié)果表示光響應(yīng)元件和脫落酸元件在TCP基因啟動(dòng)子區(qū)域分布廣泛?；虮磉_(dá)分析結(jié)果表明，工業(yè)大麻TCP基因的表達(dá)存在組織特異性，大部分在葉和花中高表達(dá)。結(jié)論 為深入研究工業(yè)大麻TCP基因家族的功能奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)一步闡明了TCP基因可能參與工業(yè)大麻生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，并對(duì)工業(yè)大麻的藥用資源發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：生物信息學(xué)；工業(yè)大麻；TCP基因家族；鑒定；功能分析
大麻Cannabis sativa L.是二倍體（2n=20）一年生草本植物隸屬于大麻科大麻屬，分布于世界各地[1,2]。大麻在歷史上被廣泛應(yīng)用于藥用、食品和纖維等領(lǐng)域，具有悠久的歷史。根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)，大麻果實(shí)被稱(chēng)為“火麻仁”，最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，它被認(rèn)為有潤(rùn)腸通便和滋養(yǎng)作用，并對(duì)消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的藥理作用[3]。因此，它可以用于治療腸燥便秘、風(fēng)濕性疼痛等疾病。此外，大麻還富含90多種不飽和脂肪酸，具備藥食兩用的功能[4,5]。大麻的根部常被用于治療炎癥和疼痛[6]。而雌性大麻花序表面的分泌型腺毛則富含大麻素[7]，這些物質(zhì)具有藥用或娛樂(lè)特性。值得一提的是，大麻還富含植物纖維，其莖材可用于纖維生產(chǎn)，是制造高品質(zhì)紡織品和造紙的優(yōu)質(zhì)原料[8]。在數(shù)千年的人工馴化和野生栽培過(guò)程中，種植者培育出多個(gè)品種的大麻，主要用于藥物和纖維制品[9]?？偟膩?lái)說(shuō)，大麻在不同部位的應(yīng)用廣泛且多樣化，為人類(lèi)提供了重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。
TCP轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的蛋白家族，最早于20世紀(jì)90年代末被描述[10,11]。TCP是最早發(fā)現(xiàn)的3個(gè)物種中的基因名稱(chēng)的首字母縮寫(xiě)：來(lái)自玉米Zea mays的TB1（大芻草BRANCHED 1)[12]，來(lái)自金魚(yú)草（金魚(yú)草）的環(huán)形棘皮綱（CYC)[13]，以及來(lái)自水稻Oryza sativa L.的Proliferating cell factor1和2(PCF1和2)[11]。TCP基因在植物界中高度保守，含有一個(gè)保守的非典型堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（b HLH）保守結(jié)構(gòu)域，由58～62個(gè)氨基酸殘基組成，參與DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用和蛋白質(zhì)的核定位[11]。根據(jù)TCP結(jié)構(gòu)域的序列相似度不同，可以將其分為2類(lèi)：I類(lèi)（也稱(chēng)為PCF類(lèi)[14]或TCP-P類(lèi)[15]）和II類(lèi)（也稱(chēng)為TCP-C類(lèi)）。與II類(lèi)蛋白質(zhì)相比，I類(lèi)蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)域中有4個(gè)氨基酸的缺失，而II類(lèi)也可以根據(jù)TCP結(jié)構(gòu)域內(nèi)的差異進(jìn)一步細(xì)分為2個(gè)分支[11]:CIN和CYC/TB1。有研究表明，I類(lèi)TCP基因主要參與促進(jìn)細(xì)胞增殖和植物生長(zhǎng)，如水稻中的PCF1/PCF2和擬南芥中的TCP20[16,17]，而CYC/TB1進(jìn)化枝（或ECE進(jìn)化枝）包括主要參與腋生分生組織發(fā)育（產(chǎn)生花和側(cè)枝）的基因，如斑葉草中的Cp CYC1/2[18]可以和玉米中的BAD1[19]可以調(diào)控葉夾角。
TCP基因家族作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物分支生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，已在擬南芥[20]、煙草[21]等模式植物以及杜仲[22]、薏苡[23]、人參[24]和藜麥[25]等藥用植物中被鑒定。以生產(chǎn)火麻仁為目標(biāo)的大麻品種需要更多分枝及花序形成，以達(dá)到高產(chǎn)需求。TCP是植物分枝發(fā)育和花發(fā)育重要調(diào)控因子，因此，研究大麻TCP具有重要意義。然而關(guān)于大麻TCP基因家族的鑒定及分析尚未報(bào)道，本研究在大麻基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)大麻TCP基因家族進(jìn)行鑒定和分析，為后續(xù)研究大麻TCP基因功能提供科學(xué)基礎(chǔ)及參考依據(jù)，為工業(yè)大麻分子育種提供理論支持。
1 材料
本研究使用的雌性大麻CBDRx的全基因組和注釋文件（GCA＿900626175.1）以及水稻、金魚(yú)草、玉米TCP基因序列信息，參考序列來(lái)源于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站，擬南芥基因組數(shù)據(jù)來(lái)源于TAIR在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.arabidopsis.org）。番茄和水稻基因組數(shù)據(jù)分別來(lái)源于https://solgenomics.net/和http://rapdb.dna.affrc.go.jp/download/irgsp1.html。工業(yè)大麻C.sativa L.的葉、花、莖和種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由本課題組測(cè)序獲得。
2 方法
2.1 工業(yè)大麻Cs TCP基因家族成員及理化性質(zhì)鑒定
采用2種方法在工業(yè)大麻中鑒定TCP基因家族成員，首先，利用TBtools進(jìn)行工業(yè)大麻和擬南芥的雙向blast去預(yù)測(cè)大麻中的TCP成員，然后使用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam-legacy.xfamorg/family/browse）中的TCP結(jié)構(gòu)域（PF03634）進(jìn)一步篩選TCP家族成員，最后去除2種方法中的重復(fù)轉(zhuǎn)錄本后獲取Cs TCP蛋白序列。采用Ex PASy在線(xiàn)網(wǎng)站（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)Cs TCP蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。在Wo LF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp）網(wǎng)站對(duì)Cs TCP蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。
2.2 工業(yè)大麻Cs TCP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析
利用MEGA 6.0軟件中的MUSCLE對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。以工業(yè)大麻和擬南芥TCP家族成員為研究對(duì)象，采用1000個(gè)bootstrap的鄰接法（neighbor-joining,NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)樹(shù)。并利用i TOL在線(xiàn)工具進(jìn)一步對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行美化。
2.3 工業(yè)大麻Cs TCP基因保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析
通過(guò)MEME數(shù)據(jù)庫(kù)（https://meme-suite.org/meme/）對(duì)Cs TCP的蛋白保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用CDD在線(xiàn)網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）對(duì)Cs TCP的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用TBtools軟件將蛋白保守基序、保守結(jié)構(gòu)域和其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)整合及可視化作圖。
2.4 工業(yè)大麻Cs TCP基因順式作用元件預(yù)測(cè)
通過(guò)TBtools使用基因組序列和結(jié)構(gòu)注釋文件分別提取17個(gè)Cs TCP基因上游各2000 bp序列作為啟動(dòng)子區(qū)域。然后對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件的預(yù)測(cè)通過(guò)Plant Care(https://www.plantcare.co.uk/）進(jìn)行，將預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行可視化作圖。
2.5 工業(yè)大麻Cs TCP基因染色體及共線(xiàn)性分析
使用TBtools軟件分析工業(yè)大麻的基因組注釋文件，提取每個(gè)TCP基因的在染色體上的位置信息并進(jìn)行可視化繪制。從NCBI網(wǎng)站下載擬南芥、工業(yè)大麻的全基因組數(shù)據(jù)，從https://solgenomics.net/和http://rapdb.dna.affrc.go.jp/download/irgsp1.html網(wǎng)站分別下載水稻和番茄的全基因組數(shù)據(jù)，使用TBtools軟件對(duì)其共線(xiàn)性關(guān)系進(jìn)行可視化處理。
2.6 工業(yè)大麻Cs TCP基因差異表達(dá)分析
使用Dinamed kush CBD autoflowering(Diku）的花、葉、苞片、莖、種子和根的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)計(jì)算Cs TCP基因的表達(dá)量（FPKM），并運(yùn)用TBtools軟件繪制熱圖，進(jìn)行基因聚類(lèi)和差異表達(dá)模式分析。根據(jù)RNAseq數(shù)據(jù)，選取Cs TCP1、Cs TCP9、Cs TCP16、Cs TCP17進(jìn)行Real-time PCR驗(yàn)證分析。使用Quick RNA isolation Kit(0416-50，華越洋有限公司）試劑盒對(duì)工業(yè)大麻的根、莖、葉、花、苞片、種子進(jìn)行RNA提取，然后用Hi Script II Q RT Super Mix for q PCR(R223-01,Vazyme）試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到對(duì)應(yīng)組織的c DNA。利用NCBI設(shè)計(jì)引物（表1），用Ace Q q PCR SYBR Green Master Mix(Q111-02,Vazyme）試劑盒進(jìn)行Real-time PCR分析，反應(yīng)程序?yàn)?/font>95℃預(yù)變性3min,95℃變性10s,60℃退火15s,72℃延伸15s，循環(huán)40次。
3 結(jié)果與分析
3.1 Cs TCP基因家族成員鑒定
通過(guò)與擬南芥TCP基因家族雙向比對(duì)以及Pfma網(wǎng)站結(jié)構(gòu)域篩選，去除重復(fù)及冗余后共鑒定到17個(gè)大麻Cs TCP基因，按照染色體位置將其命名為Cs TCP1～Cs TCP17。利用Ex PASy在線(xiàn)網(wǎng)站對(duì)鑒定到的Cs TCP蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析（表2）。研究發(fā)現(xiàn)，所有的Cs TCP蛋白質(zhì)氨基酸大小范圍為163～585，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為18310～64070，此外這些Cs TCP蛋白的等電點(diǎn)介于4.99～9.36。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，全部的Cs TCP基因家族成員大部分在細(xì)胞核中，與其他物種中TCP基因家族成員理化性質(zhì)相近（表2）。
表1 q RT-PCR引物
表2 Cs TCP基因家族成員基本信息
3.2 Cs TCP基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析及分類(lèi)
為了研究Cs TCP與其他植物物種TCP之間的進(jìn)化關(guān)系，基于Cs TCP基因家族成員的多樣性，將工業(yè)大麻、擬南芥、水稻、玉米、金魚(yú)草的TCP基因共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以擬南芥TCP基因家族的分類(lèi)方法為參考將Cs TCP分為3個(gè)亞家族（圖1）。大麻中3個(gè)亞家族的分布情況為PCF亞家族有8個(gè)成員，其中Cs TCP8和Cs TCP7聚在一個(gè)分支，Cs TCP12、Cs TCP2、Cs TCP17和Cs TCP5聚在一個(gè)分支，Cs TCP1和Cs TCP6聚為一支。CIN亞家族有6個(gè)成員，其中Cs TCP10、Cs TCP14、Cs TCP9和Cs TCP11在一個(gè)分支上，Cs TCP4和Cs TCP16在同一分支。CYC亞家族有3個(gè)成員，Cs TCP3、Cs TCP13和Cs TCP15與擬南芥、水稻和金魚(yú)草的CYC亞家族的成員聚為一支。
圖1 Cs TCP基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析
紅色字體代表Cs TCP基因，AT-擬南芥Os-水稻Am-金魚(yú)草Zm-玉米
3.3 Cs TCP基因的染色體定位及共線(xiàn)性分析
根據(jù)工業(yè)大麻基因組數(shù)據(jù)對(duì)Cs TCP基因家族成員進(jìn)行染色體定位分析（圖2），發(fā)現(xiàn)17個(gè)Cs TCP基因不均勻的分布在9條染色體上，而NC＿044370.1染色體上沒(méi)有Cs TCP基因，其余染色體上都有不同數(shù)量的Cs TCP基因。NC＿044379.1染色體上分布的Cs TCP基因最多為6個(gè)，其次為NC＿044372.1染色體，有3個(gè)Cs TCP基因分布在該染色體上，有2個(gè)Cs TCP基因分布在NC＿044378.1染色體，其余染色體上均含有1個(gè)Cs TCP基因。
為了更深入的探究Cs TCP基因的結(jié)構(gòu)和功能之間的相關(guān)性，以及闡明不同物種之間的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)工業(yè)大麻、擬南芥、水稻、番茄進(jìn)行共線(xiàn)性分析（圖3），彩色線(xiàn)代表其他物種中基因與Cs TCP基因具有共線(xiàn)性，其中擬南芥有9個(gè)、番茄有20個(gè)、水稻有6個(gè)與大麻TCP存在共線(xiàn)性基因?qū)?。其中?/font>4個(gè)Cs TCP基因（Cs TCP1、Cs TCP10、Cs TCP11、Cs TCP17）在這4個(gè)物種中共同發(fā)生了基因組共線(xiàn)性。此外，Cs TCP基因組內(nèi)部發(fā)生了2次共線(xiàn)性事件，其中有一對(duì)Cs TCP11/Cs TCP13發(fā)生在相鄰的染色體上，另外一對(duì)為Cs TCP5/Cs TCP17（圖2）。以上結(jié)果表明TCP基因家族在不同物種中的具有一定進(jìn)化保守性。
圖2 Cs TCP基因染色體分布情況
黑色字體為染色體名稱(chēng)及Cs TCP名稱(chēng)，藍(lán)色的線(xiàn)代表Cs TCP種內(nèi)共線(xiàn)性基因
圖3 Cs TCP共線(xiàn)性分析
3.4 Cs TCP基因家族保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析
基因保守結(jié)構(gòu)域通常與特定功能相關(guān)，例如轉(zhuǎn)錄激活/抑制、核定位和蛋白質(zhì)相互作用。因此，利用MEME網(wǎng)站鑒定了Cs TCP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，并選擇了10個(gè)保守基序進(jìn)行進(jìn)一步分析（圖4）。結(jié)果表明Motif1和Motif 6 2個(gè)保守基序在所有的Cs TCP均分布，但是沒(méi)有Cs TCP包含所有的10個(gè)保守基序，表明這2個(gè)基序在Cs TCP蛋白序列中分布最廣、保守程度最高（圖4-A）。所有的Cs TCP蛋白均包含TCP保守結(jié)構(gòu)域（圖4-B）。另外，在所有的Cs TCP中均存在不同程度的保守基序變異現(xiàn)象，但每個(gè)Cs TCP含有3～10個(gè)保守基序。
為了進(jìn)一步解析Cs TCP基因的結(jié)構(gòu)多樣性，對(duì)Cs TCP中的內(nèi)含子、外顯子進(jìn)行了研究（圖4-C），結(jié)果顯示Cs TCP中的內(nèi)含子數(shù)量為0～2不等，其中Cs TCP1、Cs TCP2、Cs TCP12、Cs TCP8、Cs TCP13、Cs TCP10和Cs TCP9沒(méi)有內(nèi)含子，其余均含有內(nèi)含子。這些Cs TCP中都至少有2個(gè)外顯子，Cs TCP11有5個(gè)外顯子。Cs TCP基因的內(nèi)含子和外顯子分布結(jié)構(gòu)緊密相連，高度保守，為基因家族復(fù)制研究奠定了基礎(chǔ)。
3.5 Cs TCP基因順式作用元件預(yù)測(cè)
轉(zhuǎn)錄因子在控制植物如何響應(yīng)生物和非生物脅迫方面很重要，其啟動(dòng)子序列中的各種順式調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)基因表達(dá)。為了探索17個(gè)Cs TCP基因在大麻中的潛在功能，預(yù)測(cè)了其啟動(dòng)子中的順式調(diào)節(jié)元件（起始密碼子前2000 bp）（圖5）。所有Cs TCP總共包括419個(gè)順式元件。它們參與了14個(gè)非生物脅迫，包括光響應(yīng)性、水楊酸響應(yīng)性、防御和脅迫響應(yīng)性和低溫響應(yīng)性等。每個(gè)啟動(dòng)子中都有大量的光響應(yīng)性元素占所有順式元件的53%，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他元素，其次是脫落酸響應(yīng)元件，占所有順式元件的10.7%，在所有順式元件中晝夜節(jié)律調(diào)控元件占比最少，僅為0.5%（圖6）。此外，17個(gè)Cs TCP中有9個(gè)對(duì)Me JA有反應(yīng)，有14個(gè)參與脫落酸反應(yīng)。此外，由于參與光響應(yīng)性，脫落酸響應(yīng)性，Me JA響應(yīng)性和厭氧誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的TCP基因構(gòu)成了這些基因的很大一部分，推測(cè)這些基因可能在響應(yīng)這些脅迫方面發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果可以作為未來(lái)預(yù)測(cè)基因功能的理論基礎(chǔ)。
圖4 Cs TCP家族功能結(jié)構(gòu)域
A-保守基序B-保守結(jié)構(gòu)域C-基因結(jié)構(gòu)
3.6 Cs TCP基因表達(dá)模式分析
為了探究Cs TCP基因在工業(yè)大麻不同組織的表達(dá)模式，對(duì)工業(yè)大麻品種的根、莖、葉、花、苞片、種子的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明Cs TCP基因在6個(gè)組織中表達(dá)模式不同，通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因在花、葉、苞片中高表達(dá)，小部分在根、莖、種子中高表達(dá)（圖7）。Cs TCP17、Cs TCP8、Cs TCP11在6個(gè)組織中均有較好的表達(dá)，Cs TCP1在種子中幾乎不表達(dá)，在其余5個(gè)組織中均高表達(dá)，在所有Cs TCP基因中花和葉中Cs TCP1表達(dá)量最高。此外Cs TCP9、Cs TCP13、Cs TCP3、Cs TCP15在6個(gè)組織中的表達(dá)均偏低，而這幾個(gè)基因均屬于CYC/TB1和CIN亞家族。篩選在組織間有顯著差異且表達(dá)量較高的Cs TCP1、Cs TCP9、Cs TCP16、Cs TCP17 4個(gè)基因進(jìn)行q RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示（圖8），結(jié)果顯示4個(gè)基因不同組織間的表達(dá)趨勢(shì)和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。
圖5 Cs TCP順式作用元件分析
圖6 Cs TCP順式作用元件數(shù)量分析
4 討論
TCP基因是植物中一類(lèi)獨(dú)特的小分子轉(zhuǎn)錄因子，在激素反應(yīng)、次生代謝產(chǎn)物積累和生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中起著重要的作用。TCP蛋白參與調(diào)控植物生命周期中的許多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，如萌發(fā)、葉片發(fā)育、開(kāi)花、花器官發(fā)育、枝條生長(zhǎng)、花粉發(fā)育等，通過(guò)其他因子的互作和不同激素途徑的調(diào)節(jié)發(fā)揮作用[26,27,28,29]。然而工業(yè)大麻中TCP基因的機(jī)制尚未得到研究。
圖7 Cs TCP基因表達(dá)模式分析
圖8 Cs TCP Real-time PCR檢測(cè)
在過(guò)去的幾十年中，TCP轉(zhuǎn)錄因子的特性和表達(dá)研究取得了很大的進(jìn)展，提高了人們對(duì)TCP基因家族的認(rèn)識(shí)。TCP基因家族成員已在多個(gè)物種中被鑒定，目前被鑒定到最多的TCP基因的是煙草，多達(dá)63個(gè)[21]，在其他植物中TCP基因的數(shù)量在24～58個(gè)（擬南芥24個(gè)[30]、小麥58個(gè)[24]、水稻27個(gè)[31]）。本研究在工業(yè)大麻基因組中共鑒定到在工業(yè)大麻基因組中共鑒定出17個(gè)TCP轉(zhuǎn)錄因子，基因數(shù)量和擬南芥相當(dāng)，但明顯少于煙草和玉米的TCP基因。在不同植物基因組中TCP的數(shù)量差異可能與物種是否存在古老的全基因組復(fù)制或者近期的串聯(lián)重復(fù)復(fù)制有關(guān)。此外，我們還研究了基因家族的物理化學(xué)特征；結(jié)果表明，17個(gè)Cs TCP在分子量、等電點(diǎn)和氨基酸數(shù)量方面表現(xiàn)出較大的差異，這表明工業(yè)大麻在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了變化。
先前的研究已經(jīng)證明了內(nèi)含子在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面的重要性，因此研究Cs TCP基因的結(jié)構(gòu)可以揭示其功能。結(jié)果表明，所有CSTCP中的內(nèi)含子范圍為0～2，幾種Cs TCP具有1或2個(gè)內(nèi)含子，如Cs TCP6、Cs TCP7和Cs TCP3（圖4-C），表明這些特殊的內(nèi)含子可能與特定的基因功能有關(guān)。TCP結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)氨基酸組成，并且在許多植物中高度保守[11,16,21]，來(lái)自工業(yè)大麻的TCP包含相同的保守結(jié)構(gòu)域（圖4-B）。
植物中已知的TCP主要參與葉和花的形態(tài)以及莖分支的相關(guān)調(diào)控，例如有研究表明，擬南芥中的部分TCP基因表達(dá)下調(diào)之后，與野生型相比葉片形狀發(fā)生了較大的變化[32]，在玉米中也已經(jīng)證明TCP相關(guān)基因BAD1可以調(diào)控葉的夾角[19]，這說(shuō)明TCP蛋白在葉發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了極其重要的作用。TCP也與花瓣的發(fā)育相關(guān)，例如在擬南芥中發(fā)現(xiàn)tcp5突變體花瓣較野生型更寬，而將TCP5沉默之后的花瓣比野生型窄[33]。有研究也表明，在斑葉草中CYC類(lèi)基因具有不對(duì)稱(chēng)性的自調(diào)控和相互調(diào)控功能，在花對(duì)稱(chēng)性、花朝向和蜜導(dǎo)模式關(guān)聯(lián)的進(jìn)化中扮演了重要的角色[18]。在工業(yè)大麻基因組中共鑒定出的17個(gè)TCP轉(zhuǎn)錄因子，可分為2類(lèi)3個(gè)亞科（PCF、CIN和CYC/TB1）。其中Cs TCP3、Cs TCP13、Cs TCP15、Cs TCP16、Cs TCP4、Cs TCP11、Cs TCP9、Cs TCP14和Cs TCP10屬于CIN和CYC/TB1亞科，而轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示Cs TCP4、Cs TCP11和Cs TCP10在花中均有較高的表達(dá)，根據(jù)上述已知TCP功能研究證明CIN和CYC/TB1亞科的TCP基因通常參與調(diào)控花的形態(tài)，故推測(cè)Cs TCP4、Cs TCP11和Cs TCP10在工業(yè)大麻中可能也有調(diào)控花發(fā)育的功能，可能對(duì)火麻仁生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。在側(cè)枝發(fā)育過(guò)程中，TCP基因主要起到抑制側(cè)枝形成的作用。一個(gè)典型例子是在玉米中最早發(fā)現(xiàn)的TB1基因。這個(gè)基因通過(guò)抑制植物的側(cè)枝生長(zhǎng)來(lái)發(fā)揮功能，在玉米中過(guò)度表達(dá)TB1會(huì)顯著減少分支數(shù)量[12]。類(lèi)似于TB1在水稻中的同源基因Os TB1，過(guò)表達(dá)該基因也會(huì)導(dǎo)致水稻的分蘗數(shù)下降[34]。此外，在擬南芥中與TB1有功能相似的同源基因TCP18和TCP12，過(guò)表達(dá)它們可以使擬南芥的分枝數(shù)顯著增多[35,36]。此外，TB1基因還被報(bào)道在番茄[37]、豌豆[38]和馬鈴薯[39]中具有抑制分枝的能力，這表明TCP轉(zhuǎn)錄因子對(duì)組織生長(zhǎng)的抑制活性在植物演化過(guò)程中是高度保守的。將玉米、擬南芥的TB1基因和大麻的TCP構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)大麻中的Cs TCP3、Cs TCP13和Cs TCP15與上述的TB1基因聚集在一起。這提示在大麻中，Cs TCP3、Cs TCP13和Cs TCP15可能具有類(lèi)似于TB1的抑制分枝的功能，其中轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)Cs TCP3在莖中具有較高表達(dá)量，在研究工業(yè)大麻側(cè)枝發(fā)育時(shí)可優(yōu)先將其作為候選基因進(jìn)行分析。這一發(fā)現(xiàn)可能對(duì)以大麻莖材為原料的纖維類(lèi)品種選育具有指導(dǎo)意義，但需要更多地后續(xù)研究來(lái)確定其功能。由于工業(yè)大麻作為經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值都很高的植物，在近年來(lái)得到了廣泛關(guān)注和研究。隨著技術(shù)的進(jìn)步，我們可以期待未來(lái)對(duì)工業(yè)大麻中TCP基因的機(jī)制進(jìn)行更詳盡的探索，以揭示其在工業(yè)大麻生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)控中的作用機(jī)制。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
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