天然的CBD是左旋結(jié)構(gòu)，而化學合成的CBD則通常是左旋和右旋結(jié)構(gòu)兩種異構(gòu)體的1∶1混合物，由于二者的性質(zhì)非常接近，分離十分困難。化學合成步驟繁瑣，不能有效生產(chǎn)特定結(jié)構(gòu)的生物活性化合物，且成本較高^[12]，所以從天然植物中提取仍是獲得大麻二酚的最經(jīng)濟來源。

目前，從火麻中提取大麻二酚主要還是以浸提和熱回流為主^[13]，對于CBD的檢測方 法仍存在耗時長，效率低等問題；而且提取效率低，穩(wěn)定性差，含量低等難題也亟待攻克。本文選用超聲輔助提取方法的重復性較好，此方法較索氏提取的方法更加簡單，便于操作。隨著火麻種植合法化規(guī)模的不斷擴大，對CBD的研究也不斷深入，人們對CBD有效性和安全性的理解大大增加，CBD也將會更好地造福人類。

圖1四氫大麻酚和大麻二酚分子結(jié)構(gòu)圖

本文以火麻葉為研究對象，建立了簡單、快速、準確的HPLC檢測方法，此方法大麻二酚出峰時間快，效果好，流動相配比簡單；利用超聲輔助提取方法獲得天然大麻二酚，探討不同因素對提取含量的影響，運用響應面法優(yōu)化超聲輔助提取CBD的條件，從而提高了大麻二酚的得率，具有很高的應用價值。并研究了大慶火麻各部位中CBD的含量，為火麻提取CBD和大麻的綜合利用提供理論依據(jù)，促進火麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1材料和方法

1.1材料

實驗用火麻干燥葉子，2020年10月，采自東北林業(yè)大學種植基地，經(jīng)植物分類學鄭寶江副教授鑒定為火麻。該火麻THC含量<0.3%，符合國家使用規(guī)定。將采集的火麻葉在60℃下烘干、粉碎，過40目篩后存放于東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室。

1.2方法

1.2.1HPLC檢測方法建立

1.2.1.1標準溶液母液的配制

精密稱取的CBD標品8.0μg，甲醇為溶劑，配制成標準溶液母液濃度80μg/mL。

1.2.1.2高效液相色譜條件

色譜柱：AgilentHC-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；檢測波長：220nm；流速：1.0mL/min；柱溫：28℃;流動相：甲醇-水（90∶10）；進樣量：10μL；洗脫方式：等度洗脫。

1.2.1.3標準曲線的繪制

取母液配制成濃度為0.8、1.6、4.0、8.0、40.0μg/mL的標準品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，按“1.3.1.2”條件，進行HPLC檢測，以峰面積Y為縱坐標，CBD濃度C為橫坐標繪制標準曲線，呈線性關系。標準曲線的回歸方程為Y=51.969C+19.396，相關系數(shù)R2=0.9996，R2接近于1，表明該標準曲線在CBD濃度在10~80μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關系良好。

1.2.2方法學考察

1.2.2.1精密度試驗

分別精密吸取上述標準溶液母液0.2、0.5、1.0mL，依次用甲醇定容成10mL，配制成濃度分別為1.6、4.0和8.0μg/mL三個濃度的大麻二酚標準溶液，分別重復測定其峰面積值5次，記錄大麻二酚的峰面積。

1.2.2.2穩(wěn)定性試驗

按照上述“1.3.2.1”中方法制備溶液，分別在0、2、4、8、10、12、24h，進樣10μL測定，記錄大麻二酚的峰面積，計算得到大麻二酚峰面積的RSD。

1.2.2.3重復試驗

取10份火麻葉各1.0g，按照兩種不同的提取條件，分別平行操作制備5組樣品，第一組在超聲提取功率320W，提取溫度30℃,料液比1∶15（g/mL）的條件下提取25min得到第一份提取液；第二組在超聲提取功率320W，提取溫度30℃,料液比1∶20的條件下提取30min得到第二份提取液。分別進樣10μL，依次測定峰面積值。

1.2.2.4加樣回收率試驗

精確量取6份已知濃度（7.086μg/mL）的大麻二酚提取液10mL分成3組，分別加入濃度為4.0μg/mL的標準品溶液1.0、2.0和3.0mL，測定其峰面積值，分別計算出加樣回收率。

1.2.3樣品制備

取火麻干燥葉子粉末1.0g，按照料液比加入不同量的提取溶劑，設置不同的超聲條件提取。將提取液冷卻至室溫后進行過濾，將過濾后的提取液進行真空旋蒸回收旋蒸提取溶劑，再用甲醇溶劑定容至1.0mL，12000r/min離心20min，吸取上清液，過0.45μm微孔濾膜，所得濾液按上述液相條件進行大麻二酚HPLC含量測定。

1.2.4單因素試驗

準確稱取火麻葉1.0g，采取控制單一變量法，設置梯度提取時間為10、15、20、25和30min；提取溫度為50、60、70、80和90℃;料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25（g/mL）；提取功率280、300、320、340和360W。以提取時間25min，提取溫度80℃,料液比為1:20g/mL，提取功率320W為基本條件，CBD含量作為指標，研究單因素條件對CBD提取的影響。

1.2.5響應面優(yōu)化試驗

在上述實驗的基礎上，為進一步研究因素之間的相互作用，選取提取功率（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、和提取料液比（D）作為實驗因素，以火麻葉中CBD的含量作為響應值（Y）。根據(jù)Box-BenhnkenDesign實驗設計，生成4因素3水平的響應面實驗設計，共有29組實驗。實驗因素與水平見表1。

表1實驗因素與水平

1.2.6數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復3次。使用MicrosoftExcel軟件整理數(shù)據(jù)整理，利用SPSS18.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用One-wayANOVA方法進行方差分析，用MicrosoftExcel及Origin2021繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1大麻二酚HPLC檢測方法

2.1.1大麻二酚色譜圖

按1.3.1中方法，將CBD標準品和樣品進行HPLC檢測，得到色譜圖見圖2。如圖，大麻二酚出峰時間較快，7~8min時間內(nèi)出峰，簡單高效，分離效果優(yōu)，目標峰兩邊沒有其他峰干擾，而且峰型較好，可以方便快捷地檢測火麻中大麻二酚含量。

圖2大麻二酚標準品（a）和樣品（b）色譜圖

2.1.2方法學考察

2.1.2.1精密度考察

計算得到大麻二酚峰面積的RSD分別為1.31%、1.02%和0.47%，表明該方法精密度良好。

2.1.2.2穩(wěn)定性考察

計算得到大麻二酚峰面積的RSD分別為1.64%、0.62%和0.52%，表明標準品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.2.3重復性考察

計算得到其RSD分別為2.47%和3.58%（n=5），表明該方法的重復性較好。

2.1.2.4加樣回收實驗

分別計算出加樣回收率，其平均值為97.49%，RSD為0.45%，表明方法準確度可靠。

2.2單因素實驗

2.2.1提取時間

提取時間直接影響到植物中有效成分的提取效率，提取時間過短，植物中的有效成分不能提取完全且造成原料浪費；提取時間過長，會導致提取物有效成分發(fā)生降解或結(jié)構(gòu)上的破壞，還會造成時間和能量的浪費。如圖3所示，本研究通過對火麻葉中大麻二酚含量隨提取時間變化研究，結(jié)果表明：提取時間從15~25min，隨著提取時間的延長，大麻二酚的提取含量快速升高；當提取25min以后，隨提取時間的增加，大麻二酚的含量雖有稍量增加，但增加的量很少，經(jīng)方差分析，差異不顯著（P>0.05）。隨超聲時間的延長，對細胞壁的破壞就越大，大麻二酚的溶出就越多，一定時間后，溶液體系會達到平衡。超聲時間越長，超聲的熱效應開始發(fā)揮作用，但這種熱效應有限。因此，選擇25min作為最佳超聲提取時間。

圖3不同時間下大麻二酚的含量

2.2.2提取溫度

如圖4所示，隨著提取溫度的升高大麻二酚的含量先上升后下降；當溫度為80℃時，大麻二酚含量達到最大值，并且與其它溫度下的大麻二酚的含量呈現(xiàn)顯著性差異（r<0.05）。這是由于酚類物質(zhì)具有熱敏感性，溫度升高能夠提升酚類物質(zhì)的溶解性和擴散速度，但也會導致酚類物質(zhì)加速分解與氧化，80℃可能是大麻二酚上述關系的一個平衡溫度，提取溫度在80℃之前，前者占主導作用，而超過80℃,后者占優(yōu)勢。故選擇80℃作為最佳單因素提取溫度。

圖4不同提取溫度下大麻二酚的含量

2.2.3料液比

為提高提取率和節(jié)省提取溶劑，研究了料液比對大麻二酚提取含量的影響，結(jié)果如圖5所示，大麻二酚的提取含量隨料液比的增加而增大。當料液比在1:20(g/mL)以后時，大麻二酚的提取量雖有少量增加，但方差分析顯示差異不顯著（P>0.05）?？紤]到溶劑損耗、濃縮時間等后續(xù)工藝成本等問題，確定料液比為1:20（g/mL）為最佳提取料液比。

圖5不同料液比下大麻二酚的含量

2.2.4提取功率

結(jié)果如圖6所示，隨著提取功率的增大，提取得到的大麻二酚的含量也增大，當功率為320W時，大麻二酚的含量最大。此后，隨著提取功率的增加，大麻二酚的含量降低?？赡苁堑统暪β十a(chǎn)生的空化效應不足以破壞大麻葉的植物細胞的細胞壁，隨著提取功率的增大，大麻葉細胞的細胞壁被破壞得也越大。但功率過大可能會導致大麻二酚的降解，導致含量降低。因此選擇320W作為最佳超聲功率。

圖6不同提取功率下大麻二酚含量

2.3響應面優(yōu)化試驗結(jié)果分析

2.3.1模型建立

火麻葉中大麻二酚的提取時間、提取溫度、料液比和提取功率4個主要影響因素進行優(yōu)化，以大麻二酚含量為指標，結(jié)果見表2所示。

表2響應面實驗結(jié)果

利用Design-expertV11軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行分析，以火麻葉子中大麻二酚含量（Y）為響應值，對表2中的數(shù)據(jù)進行多項回歸擬合，得到以響應值為目標函數(shù)的二次多元回歸方程：Y=72.35+2.15A+4.94B+5.62C+7.39D-9.41AB-0.86AC-7.16AD+4.57BC-0.58BD+3.11CD-3.96A2-28.49B2-14.83C2-12.73D2

表3回歸方程的方差分析

回歸模型各項的方差分析見表3。可知，模型F=10.84，P?0.0001，建立的模型顯著性良好；失擬項F=5.78，P=0.0527>0.05，失擬項不顯著，表明所選用的二次多項模型的擬合程度良好。模型R2=0.9155，表明該回歸方程有較好的相關性，R2Adj=0.8310，表明該回歸模型可以解釋83.10%實驗數(shù)據(jù)的變異性。模型實際值與預測值擬合較好，表明該回歸方程對試驗的擬合性較好，可用于預測和分析火麻中CBD的含量。該實驗的CV值是0.13%，較低，表明它具有很好的可靠性和較高可信度，使用此模型進行分析響應值的變化，能較好地反映真實的試驗值。

2.3.2各因素與交互因素作用分析

各因素的F值可以反映出對響應指標的顯著程度，F值越大，P值越小，意味著對響應指標的影響越大，系數(shù)更顯著。從表3的方差分析結(jié)果可以看出，幾個因素對火麻葉中的大麻二酚提取含量的影響程度順序：料液比（D）>提取時間（C）>提取溫度（B）>提取功率（A）；以提取功率與提取溫度AB的交互作用對響應值影響顯著（P<0.05），其它幾組交互作用對結(jié)果影響不顯著（P>0.05）。

根據(jù)上述回歸方程，利用響應面法獲得了提取因素與CBD含量之間關系的三維曲面圖。從圖7中可以看出提取功率、提取溫度、提取時間和料液比及其相互作用對CBD提取含量的影響。等高線輪廓的形態(tài)也可以反映出各因素之間交互作用對響應值影響的強弱情況，等高線的形狀為橢圓表示這2個因素之間的交互作用對響應值影響強烈，圓形則代表各因素之間的交互作用不顯著。如圖7所示，在交互作用對CBD提取含量的影響中，BD對CBD含量影響最小，AC與其相似，其次是CD和BC，提取功率×提取溫度AB、AD對CBD的提取含量影響較大，這也與表3中回歸方程的方差分析所得到的結(jié)果是一致的。二項式B2、C2和D2的P值均<0.01，說明它們對火麻葉中CBD的提取的含量有著顯著的影響。A2的P值>0.05，表明影響不顯著。

圖7各因素交互作用的響應面圖

2.3.3最佳工藝驗證

利用Design-expertV11軟件對實驗條件進行優(yōu)化，通過數(shù)據(jù)分析得到超聲提取火麻葉中大麻二酚的最優(yōu)的提取條件為：提取功率307.72W，提取溫度81.54℃，提取時間26.33min，料液比1∶22.03（g/mL），在此條件下，大麻二酚的提取量為74.63±0.72mg/g?？紤]到實驗操作的實際性，將提取條件校正為：提取功率320W，溫度81℃,時間26min，料液比1∶22（g/mL）。平行實驗三次，得到大麻二酚含量的平均值為79.53±0.26mg/g（CV為2.58%），結(jié)果與理論值方差分析，差異不顯著（P<0.05），表明回歸方程可以較好地預測實驗結(jié)果以及模型的可靠性。

2.4火麻不同部位大麻二酚含量檢測

利用所獲得的最優(yōu)提取條件，對來自黑龍江大慶火麻栽培品種的根、莖、嫩葉（植株最頂端往下2~4片葉片）、老葉（植株中部以下葉片）、種子等不同部位中的大麻二酚含量進行檢測，結(jié)果如表4所示，幼嫩葉片中的大麻二酚含量最高為87.32±0.24mg/g，其余部位大麻二酚含量以老葉，種子，莖和根依次降低。

表4不同部位大麻二酚含量（x±s,n=3）

3討論與結(jié)論

本研究以火麻葉為實驗材料，采用AgilentHC-C18柱，建立了一種簡單、快速從火麻 葉中大麻二酚的HPLC檢測方法，該方法靈敏度高、簡便易行，結(jié)果準確可靠。與Chen等^[14]建立的液相方法大麻二酚在9min后出峰相比，此液相方法的出峰時間更快在7~8min，分離效果優(yōu)、峰型理想；與Xie等^[15]建立液相方法的加樣回收率為91.2%~97.6%（RSD為 3%）相比，本研究建立的液相方法平均加樣回收率為97.49%（RSD為0.45%），此方法穩(wěn)定性好、重復性更好，可以高效地檢測火麻中大麻二酚含量，適用于大麻二酚的定量分析，同時也為評價火麻的質(zhì)量提供了可靠保證。

在單因素的基礎上，基于Box-BehnkenDesign響應面法得到了從火麻葉中超聲輔助提取大麻二酚的最佳工藝條件：以甲醇為提取溶劑，料液比為1∶22（g/mL），提取功率為320W，提取溫度為81℃,提取時間為26min，在此條件下，大麻二酚含量為79.53±0.26mg/g。與Yan等^[16]的研究相比，對于超聲提取的條件，包括提取功率、提取料液比和提取 溫度進行進一步的具體研究，對超聲輔助提取火麻中的大麻二酚條件進行明確和補充。與Hao等^[17]研究用熱回流技術提取大麻二酚的提取3次2h/次相比較，在提取得到相同量的 大麻二酚條件下，本研究中的方法，所需的時間更短，對溶劑的耗費量也更少；與Gao等^[18]的研究相比，提取的時間更短，在最佳工藝的條件下，大麻二酚的提取量也更多。本試 驗所得最佳提取工藝條件在一定程度上縮短提取時間，避免長時間提取對活性成分的影響，提高了大麻二酚的提取量和提取效率。

采用本研究所建立的高效液相方法測定了黑龍江大慶火麻栽培品種各部位的大麻二酚含量為嫩葉中最高，其次依次為整株葉片、老葉、種子和莖，根中的大麻二酚含量最低。研究結(jié)果可為火麻中大麻二酚提取和火麻高附加值產(chǎn)品進一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)。

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文章摘自：張一寧,于志琪,屈施旭,劉同歌,張玉紅.火麻葉中大麻二酚提取工藝的響應面法優(yōu)化及不同部位含量分布[J/OL]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā). https://link.cnki.net/urlid/51.1335.q.20240118.1723.002