摘  要：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了亞麻籽油神經(jīng)酰胺，其由亞麻籽油脂肪酸與鞘氨醇類化合物反應(yīng)得到，所述鞘氨醇類化合物選自鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氫鞘氨醇，本方案還公開了亞麻籽油神經(jīng)酰胺的合成方法與用途。亞麻籽油神經(jīng)酰胺在皮膚天然屏障的修復(fù)、組織愈合、抗衰老等方面表現(xiàn)出優(yōu)異性能，在化妝品、保健品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

 

技術(shù)要點(diǎn)

1.亞麻籽油神經(jīng)酰胺，其由亞麻籽油脂肪酸與鞘氨醇類化合物反應(yīng)得到，所述鞘氨醇類化合物選自鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氫鞘氨醇。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻籽油神經(jīng)酰胺，其特征在于，所述亞麻籽油脂肪酸由亞麻籽油水解得到。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的亞麻籽油神經(jīng)酰胺，其特征在于，所述亞麻籽油脂肪酸含有40～70wt％亞麻酸、10～25wt％亞油酸、10～25wt％油酸、1～8wt％棕櫚酸、1～8wt％硬脂酸。

4.亞麻籽油神經(jīng)酰胺，其組成包括：亞麻酸神經(jīng)酰胺，亞油酸神經(jīng)酰胺，油酸神經(jīng)酰胺，棕櫚酸神經(jīng)酰胺，硬脂酸神經(jīng)酰胺。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的亞麻籽油神經(jīng)酰胺，其組成包括：40～70wt％亞麻酸神經(jīng)酰胺，10～25wt％亞油酸神經(jīng)酰胺，10～25wt％油酸神經(jīng)酰胺，1～8wt％棕櫚酸神經(jīng)酰胺，1~8wt％硬脂酸神經(jīng)酰胺。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的亞麻籽油神經(jīng)酰胺，其組成還包括：0～1wt％花生酸神經(jīng)酰胺。

7.權(quán)利要求1～6任意一項(xiàng)所述的亞麻籽油神經(jīng)酰胺的合成方法，包括以下步驟：

在縮合劑、有機(jī)堿條件下，亞麻籽油脂肪酸與鞘氨醇類化合物反應(yīng)，所述縮合劑為EDCI，所述有機(jī)堿為Et3N；

所述亞麻籽油脂肪酸、鞘氨醇類化合物、EDCI、Et3N的摩爾比為1：(1～1.5)：(1～2)：(1~2)，所述反應(yīng)的溶劑為二氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙腈中的至少一種。

8.權(quán)利要求1～6任意一項(xiàng)所述的亞麻籽油神經(jīng)酰胺在化妝品、藥品、膳食品或保健品中的用途。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述亞麻籽油神經(jīng)酰胺具有皮膚屏障修復(fù)、組織愈合、抗衰老、抗光老化、抗氧化、促進(jìn)膠原合成、維持彈性蛋白活力、美白功效中的至少一種。

10.一種組合物，包括權(quán)利要求1～6任意一項(xiàng)所述的亞麻籽油神經(jīng)酰胺，所述組合物具有皮膚屏障修復(fù)、組織愈合、抗衰老、抗光老化、抗氧化、促進(jìn)膠原合成、維持彈性蛋白活力、美白功效中的至少一種。

 

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及亞麻籽油神經(jīng)酰胺及其合成方法與用途。

 

背景技術(shù)

神經(jīng)酰胺(Ceramide，又稱分子釘)天然存在于皮膚中，是皮膚屏障(角質(zhì)層)非常重要的組成部分，含量高達(dá)40～50wt％，神經(jīng)酰胺是一類由鞘氨醇類長(zhǎng)鏈堿基與脂肪酸組成的神經(jīng)鞘氨脂質(zhì)，其中的鞘氨醇部分、脂肪酸部分的碳鏈長(zhǎng)度、不飽和度和羥基數(shù)目都是可以變化的，神經(jīng)酰胺代表了一類化合物。神經(jīng)酰胺在調(diào)控皮膚屏障功能，恢復(fù)皮膚水分以及增強(qiáng)皮膚角質(zhì)細(xì)胞之間的粘著力等方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。

由于神經(jīng)酰胺的重要性，許多化妝品和制藥公司正在研究、開發(fā)相應(yīng)的產(chǎn)品。天然植物來源的神經(jīng)酰胺因其更加可持續(xù)和更加環(huán)保的原料來源，以及與皮膚神經(jīng)酰胺成分相近的特性，能形成有效的皮膚屏障防止水分流失，并對(duì)抗外部損壞，將可能成為下一代環(huán)境友好、安全可靠的神經(jīng)酰胺產(chǎn)品。

亞麻籽油又稱胡麻油，是從胡科植物脂麻種子榨取的脂肪油。亞麻籽油含有50wt％以上的亞麻酸，是植物油中亞麻酸含量最高的。此外，還含有亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸等。亞麻籽油呈橙黃色，澄清透明，芳香濃郁，具有亞麻籽油特有的氣味和滋味，無其他異味，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，被國(guó)內(nèi)外的營(yíng)養(yǎng)專家譽(yù)為“陸地上的魚油”。臨床數(shù)據(jù)顯示，亞麻籽油能夠降低白三烯的生成、抑制過敏反應(yīng)中間體血小板凝集活化因子、增強(qiáng)谷胱甘肽過氧化物酶與SOD活性、修復(fù)和增強(qiáng)皮膚細(xì)胞天然屏障功能，從而達(dá)到保濕、抗敏、抗炎、抗氧化與抗衰老的功效。在傳統(tǒng)醫(yī)療、保健領(lǐng)域中，亞麻籽油還可以起到降血脂、抗血小板聚集、預(yù)防血栓形成等作用。

因此，考慮到亞麻籽油本身的優(yōu)良特性，以及其富含的不飽和脂肪酸，制備亞麻籽油神經(jīng)酰胺將在化妝品、保健、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

 

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用植物來源的亞麻籽油脂肪酸合成得到的神經(jīng)酰胺。本發(fā)明的另一目的是提供亞麻籽油神經(jīng)酰胺的合成方法，其利用天然植物來源且易得的亞麻籽油油脂或者亞麻籽油脂肪酸作為原料。

本發(fā)明的另一目的是提供亞麻籽油神經(jīng)酰胺的用途。

為達(dá)到上述目的之一，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，亞麻籽油神經(jīng)酰胺，其由亞麻籽油脂肪酸與鞘氨醇類化合物反應(yīng)得到，所述鞘氨醇類化合物選自鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氫鞘氨醇。

反應(yīng)即可以是化學(xué)合成反應(yīng)(如下文詳述)，也可采用微生物發(fā)酵法，即應(yīng)用雪氏畢赤酵母或釀酒酵母，在一定環(huán)境下發(fā)酵得到鞘氨醇類化合物，然后加入脂肪酸，最終得到神經(jīng)酰胺；或者以亞麻籽油為原料，選用合適的菌株，進(jìn)行發(fā)酵得到亞麻籽油神經(jīng)酰胺。

鞘氨醇指2-氨基-4-十八烯-1,3-二醇，植物鞘氨醇指2-氨基-十八烷-1，3，4-三醇，二氫鞘氨醇指2-氨基-十八烷-1，3-二醇。

進(jìn)一步地，所述亞麻籽油脂肪酸由亞麻籽油油脂水解得到。

進(jìn)一步地，所述亞麻籽油脂肪酸含有40～70wt％亞麻酸。

進(jìn)一步地，所述亞麻籽油脂肪酸含有10～25wt％亞油酸。

進(jìn)一步地，所述亞麻籽油脂肪酸含有10～25wt％油酸。

進(jìn)一步地，所述亞麻籽油脂肪酸含有1～8wt％棕櫚酸。

進(jìn)一步地，所述亞麻籽油脂肪酸含有1～8wt％硬脂酸。

此外，亞麻籽油脂肪酸還含有0～1wt％花生酸。

亞麻籽油脂肪酸的組成為：40～70wt％亞麻酸、10～25wt％亞油酸、10～25wt％油酸、1～8wt％棕櫚酸、1～8wt％硬脂酸、0～1wt％花生酸。

亞麻籽油脂肪酸的主要成分為亞麻酸，其他的脂肪酸包括亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸，是必要組分，受植物品種、土壤、氣候、產(chǎn)地、采摘季節(jié)、提取過程的影響，各組分的含量會(huì)有所不同，而花生酸不一定含有，是可選組分或者非必要組分。

亞麻籽油神經(jīng)酰胺，其組成包括：亞麻酸神經(jīng)酰胺，亞油酸神經(jīng)酰胺，油酸神經(jīng)酰胺，棕櫚酸神經(jīng)酰胺，硬脂酸神經(jīng)酰胺；因?yàn)橹舅岫紩?huì)參與相同的反應(yīng)，反應(yīng)后神經(jīng)酰胺的質(zhì)量占比變化不大，所以與亞麻籽油脂肪酸的組成類似，亞麻籽油神經(jīng)酰胺的組成為：40~70wt％亞麻酸神經(jīng)酰胺，10～25wt％亞油酸神經(jīng)酰胺，10～25wt％油酸神經(jīng)酰胺，1~8wt％棕櫚酸神經(jīng)酰胺，1～8wt％硬脂酸神經(jīng)酰胺。各組分的含量因亞麻籽油脂肪酸或油脂中各脂肪酸的含量不同而存在差異。此外，亞麻籽油神經(jīng)酰胺還包括花生酸與鞘氨醇類化合物反應(yīng)得到的神經(jīng)酰胺，即還包括0～1wt％花生酸神經(jīng)酰胺。

亞麻籽油神經(jīng)酰胺，其組成包括：亞麻酸神經(jīng)酰胺，亞油酸神經(jīng)酰胺，油酸神經(jīng)酰胺；亞麻酸神經(jīng)酰胺占比40～70wt％，亞油酸神經(jīng)酰胺占比10～25wt％，油酸神經(jīng)酰胺占比10～25wt％。

進(jìn)一步地，亞麻籽油神經(jīng)酰胺包括棕櫚酸神經(jīng)酰胺，棕櫚酸神經(jīng)酰胺占比1~8wt％。

進(jìn)一步地，亞麻籽油神經(jīng)酰胺包括硬脂酸神經(jīng)酰胺，硬脂酸神經(jīng)酰胺占比1~8wt％。

進(jìn)一步地，亞麻籽油神經(jīng)酰胺包括不超過1wt％的花生酸神經(jīng)酰胺，尤其是0.1~1wt％花生酸神經(jīng)酰胺。

亞麻酸神經(jīng)酰胺是亞麻酸與鞘氨醇類化合物縮合反應(yīng)得到，包括亞麻酸植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺、亞麻酸鞘氨醇神經(jīng)酰胺、亞麻酸二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺；亞油酸神經(jīng)酰胺是亞油酸與鞘氨醇類化合物縮合反應(yīng)得到，包括亞油酸植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺、亞油酸鞘氨醇神經(jīng)酰胺、亞油酸二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺；油酸神經(jīng)酰胺是油酸與鞘氨醇類化合物縮合反應(yīng)得到，包括油酸植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺、油酸鞘氨醇神經(jīng)酰胺、油酸二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺；棕櫚酸神經(jīng)酰胺是棕櫚酸與鞘氨醇類化合物縮合反應(yīng)得到，包括棕櫚酸植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺、棕櫚酸鞘氨醇神經(jīng)酰胺、棕櫚酸二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺；硬脂酸神經(jīng)酰胺是硬脂酸與鞘氨醇類化合物縮合反應(yīng)得到，包括硬脂酸植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺、硬脂酸鞘氨醇神經(jīng)酰胺、硬脂酸二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺；花生酸神經(jīng)酰胺等以此類推。

本發(fā)明的第二方面，亞麻籽油神經(jīng)酰胺的合成方法，包括以下步驟：

在縮合劑、有機(jī)堿條件下，亞麻籽油脂肪酸與鞘氨醇類化合物反應(yīng)，所述縮合劑為EDCI，所述有機(jī)堿為Et3N。

進(jìn)一步地，所述亞麻籽油脂肪酸、鞘氨醇類化合物、EDCI、Et3N的摩爾比為1：(1~1.5)：(1～2)：(1～2)，所述反應(yīng)的溶劑為二氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙腈中的至少一種。

在市場(chǎng)上購(gòu)買的亞麻籽油一般是油脂形態(tài)，需要水解成亞麻籽油脂肪酸，因此還包括以下步驟：

亞麻籽油油脂通過皂化反應(yīng)水解得到亞麻籽油脂肪酸。

進(jìn)一步地，所述皂化反應(yīng)是亞麻籽油油脂在氫氧化鉀溶液中水解。

進(jìn)一步地，所述亞麻籽油油脂與氫氧化鉀的質(zhì)量比為1：(1～2)。

本發(fā)明的第三方面，亞麻籽油神經(jīng)酰胺在化妝品、藥品、膳食品或保健品中的用途。

進(jìn)一步地，所述亞麻籽油神經(jīng)酰胺具有皮膚屏障修復(fù)、組織愈合、抗衰老、抗光老化、抗氧化、促進(jìn)膠原合成、維持彈性蛋白活力、美白功效中的至少一種。

一種組合物，包括亞麻籽油神經(jīng)酰胺，所述組合物具有皮膚屏障修復(fù)、組織愈合、抗衰老、抗光老化、抗氧化、促進(jìn)膠原合成、維持彈性蛋白活力、美白功效中的至少一種。

該組合物含有可接受的輔料，包括增溶劑、防腐劑、抗氧劑、pH調(diào)節(jié)劑、促滲劑、脂質(zhì)體、保濕劑、增稠劑、螯合劑、膚感調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、乳化劑、香精及色素中的一種或多種；該組合物為霜?jiǎng)?、乳劑、溶液劑、膜劑、氣霧或噴霧形式。

本發(fā)明具有以下有益效果：

亞麻籽油脂肪酸屬于天然形成的脂肪酸，最主要的成分是飽和脂肪酸——亞麻酸，此外還含有亞油酸、油酸、硬脂酸、棕櫚酸等，其與天然存在于皮膚中的鞘氨醇類化合物，經(jīng)溫和反應(yīng)制備得到亞麻籽油神經(jīng)酰胺，在皮膚天然屏障的修復(fù)、抗氧化、抗衰老等方面表現(xiàn)出優(yōu)異性能，在化妝品、保健品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

1、與單一的神經(jīng)酰胺相比效果更好。不同的神經(jīng)酰胺，因其結(jié)構(gòu)的差異，功效也會(huì)存在差異，單一結(jié)構(gòu)的神經(jīng)酰胺一般難以具備全面的效果。本方案基于仿生的思路，利用天然來源的亞麻籽油油脂或脂肪酸作為原料，合成復(fù)合的神經(jīng)酰胺，以彌補(bǔ)不同神經(jīng)酰胺功效的差異，亞麻籽油中的微量脂肪酸可以形成微量神經(jīng)酰胺，起到功效補(bǔ)充的作用。

2、與復(fù)配的神經(jīng)酰胺相比效果更好。除了脂肪酸(或油脂)，亞麻籽油還含有其它活性成分，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有滋潤(rùn)皮膚、增強(qiáng)細(xì)胞活力等效果，用亞麻籽油合成的神經(jīng)酰胺，與亞麻籽油中含有的其它活性成分具有協(xié)同增效的作用，相比按照類似比例復(fù)配的神經(jīng)酰胺，具有更好的效果。

3、成本更低。本發(fā)明的方法快速得到多種神經(jīng)酰胺復(fù)配的組合物，植物源的亞麻籽油油脂或其脂肪酸來源廣泛、易于商業(yè)化獲取、成本較低，更加環(huán)保經(jīng)濟(jì)，有別于將不同的單一神經(jīng)酰胺混合復(fù)配的思路，單一成分的脂肪酸不僅原料價(jià)格高(尤其是亞麻酸的價(jià)格特別昂貴)，而且需要分別生產(chǎn)不同的神經(jīng)酰胺，然后再進(jìn)行復(fù)配，增加了制備成本。該方法合成的亞麻籽油神經(jīng)酰胺中富含亞麻酸神經(jīng)酰胺，相比從價(jià)格昂貴的亞麻酸原料制備而得的產(chǎn)品，具有明顯的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

4、合成方法簡(jiǎn)單。本發(fā)明的方法可以采用化學(xué)合成，實(shí)現(xiàn)一步制備多種神經(jīng)酰胺，也可以使用微生物發(fā)酵法。

 

附圖說明

圖1為實(shí)施例4細(xì)胞遷移能力測(cè)試結(jié)果；

  

圖1

圖2、3為實(shí)施例5彈性蛋白酶抑制率柱形圖；

  

圖2

  

圖3

圖4、5為實(shí)施例6抗光老化測(cè)試MMP1表達(dá)量柱形圖；

   

圖4

 

  

圖5

圖6、7為實(shí)施例7抗氧化性測(cè)試DPPH自由基清除率柱形圖；

  

圖6

 

  

圖7

圖8為實(shí)施例8美白活性測(cè)試黑色素含量柱形圖。

  

圖8

 

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

EDCI指1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺，Et3N指三乙胺。硅膠柱層析使用青島海洋硅膠(粒徑0.040-0.063mm)。薄層色譜分析(TLC)使用60F254硅膠板，TLC顯色采用UV光(254nm)或碘。

實(shí)施例1

亞麻籽油脂肪酸和植物鞘氨醇合成神經(jīng)酰胺

第一步：將40g亞麻籽油油脂溶于50mL四氫呋喃，冰浴下冷卻，滴加100mL氫氧化鉀(25wt％)溶液，滴加完畢后升至室溫反應(yīng)，至TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢。

后處理：加入稀鹽酸(3N)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值到3，加入150mL乙酸乙酯萃取水相，加入100mL飽和食鹽水洗一次，有機(jī)相加入無水Na2SO4干燥，過濾并真空濃縮，得到32g亞麻籽油脂肪酸。

第二步：將亞麻籽油脂肪酸(50mmol，以主成分脂肪酸計(jì))、EDCI(60mmol)、Et3N(60mmol)加入250mL圓底燒瓶中，再加入100mL二氯甲烷，隨后在室溫條件下攪拌1小時(shí)，隨后將植物鞘氨醇(60mmol)加入到反應(yīng)體系中，在室溫條件下攪拌，至TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢。

后處理：加入水淬滅反應(yīng)，分離有機(jī)層，干燥，過濾并真空濃縮后經(jīng)溶劑洗滌得到亞麻籽油神經(jīng)酰胺，產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析，HPLC色譜條件：使用島津高效液相色譜儀(LC-2030C3DPlus)，用InnovalODS-24.6*250mm，5μm色譜柱，柱溫：30℃,進(jìn)樣體積：10μL，流速：1.0mL/min，蒸發(fā)溫度：40℃,載氣流速：2.5L/min，流動(dòng)相：100％甲醇。

各成分HPLC的保留時(shí)間為：亞麻酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺8.3min，亞油酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺9.6min，棕櫚酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺10.8min，油酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺11.4min，硬脂酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺14.1min，花生酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺16.5min。

所得產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分析，亞麻酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺、亞油酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺、油酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺、棕櫚酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺、硬脂酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺、花生酸-植物鞘氨醇神經(jīng)酰胺的含量依次為63％、13％、12％、5％、4％、1％，其余為其他成分，含量較少。

實(shí)施例2

亞麻籽油脂肪酸和鞘氨醇合成神經(jīng)酰胺

第一步：將40g亞麻籽油油脂溶于50mL四氫呋喃，冰浴下冷卻，滴加100mL氫氧化鉀(25wt％)溶液，滴加完畢后升至室溫反應(yīng)，至TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢。

后處理：加入稀鹽酸(3N)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值到3，加入150mL乙酸乙酯萃取水相，加入100mL飽和食鹽水洗一次，有機(jī)相加入無水Na2SO4干燥，過濾并真空濃縮，得到32g亞麻籽油脂肪酸。

第二步：將亞麻籽油脂肪酸(50mmol，以主成分脂肪酸計(jì))、EDCI(65mmol)、Et3N(65mmol)加入250mL圓底燒瓶中，再加入100mL二氯甲烷，隨后在室溫條件下攪拌1小時(shí)，隨后將鞘氨醇(55mmol)加入到反應(yīng)體系中，在室溫條件下攪拌，至TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢。

后處理：加入水淬滅反應(yīng)，分離有機(jī)層，干燥，過濾并真空濃縮后經(jīng)溶劑洗滌得到亞麻籽油神經(jīng)酰胺，產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析，HPLC色譜條件：使用島津高效液相色譜儀(LC-2030C3DPlus)，用InnovalODS-24.6*250mm，5μm色譜柱，柱溫：30℃,進(jìn)樣體積：10μL，流速：1.0mL/min，蒸發(fā)溫度：40℃,載氣流速：2.5L/min，流動(dòng)相：100％甲醇。

各成分HPLC的保留時(shí)間為：亞麻酸-鞘氨醇神經(jīng)酰胺7.9min，亞油酸-鞘氨醇神經(jīng)酰胺8.7min，油酸-鞘氨醇神經(jīng)酰胺10.1min，棕櫚酸-鞘氨醇神經(jīng)酰胺10.4min，硬脂酸-鞘氨醇神經(jīng)酰胺的保留時(shí)間13.5min。

所得產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分析，亞麻酸-鞘氨醇神經(jīng)酰胺、亞油酸-鞘氨醇神經(jīng)酰胺、油酸-鞘氨醇神經(jīng)酰胺、棕櫚酸-鞘氨醇神經(jīng)酰胺、硬脂酸-鞘氨醇神經(jīng)酰胺的含量依次為44％、21％、24％、3％、3％，其余為其他成分，含量較少。

實(shí)施例3

亞麻籽油脂肪酸和二氫鞘氨醇合成神經(jīng)酰胺

第一步：將40g亞麻籽油油脂溶于50mL四氫呋喃，冰浴下冷卻，滴加100mL氫氧化鉀(25wt％)溶液，滴加完畢后升至室溫反應(yīng)，至TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢。

后處理：加入稀鹽酸(3N)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值到3，加入150mL乙酸乙酯萃取水相，加入100mL飽和食鹽水洗一次，有機(jī)相加入無水Na2SO4干燥，過濾并真空濃縮，得到32g亞麻籽油脂肪酸。

第二步：將亞麻籽油脂肪酸(50mmol，以主成分脂肪酸計(jì))、EDCI(80mmol)、Et3N(80mmol)加入250mL圓底燒瓶中，再加入100mL二氯甲烷，隨后在室溫條件下攪拌1小時(shí)，隨后將二氫鞘氨醇(60mmol)加入到反應(yīng)體系中，在室溫條件下攪拌，至TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢。

后處理：加入水淬滅反應(yīng)，分離有機(jī)層，干燥，過濾并真空濃縮后經(jīng)溶劑洗滌得到亞麻籽油神經(jīng)酰胺，產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析，HPLC色譜條件：使用島津高效液相色譜儀(LC-2030C3DPlus)，用InnovalODS-24.6*250mm，5μm色譜柱，柱溫：30℃,進(jìn)樣體積：10μL，流速：1.0mL/min，蒸發(fā)溫度：40℃,載氣流速：2.5L/min，流動(dòng)相：100％甲醇。

各成分HPLC的保留時(shí)間為：亞麻酸-二氫鞘氨醇神經(jīng)酰8.3min，亞油酸-二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺9.5min，棕櫚酸-二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺10.7min，油酸-二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺11.1min，硬脂酸-二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺13.6min。

所得產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分析，亞麻酸-二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺、亞油酸-二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺、油酸-二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺、棕櫚酸-二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺、硬脂酸-二氫鞘氨醇神經(jīng)酰胺的含量依次為55％、15％、11％、8％、7％，其余為其他成分，含量較少。

實(shí)施例4

細(xì)胞遷移評(píng)估皮膚屏障修復(fù)作用[0078]原理：當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到融合成單層狀態(tài)時(shí)，在融合的單層細(xì)胞上劃痕工具制造一個(gè)空白區(qū)域，空白區(qū)域的細(xì)胞被機(jī)械力去除掉了，通過一段時(shí)間的培養(yǎng)，觀察細(xì)胞向無細(xì)胞區(qū)域遷移的情況，通過測(cè)量細(xì)胞的遷移距離反映細(xì)胞的遷移能力。

操作步驟：

1、培養(yǎng)板劃線。首先使用Marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃?rùn)M線，大約每隔0.5～1cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線，劃線時(shí)注意線不要太粗。

2、鋪細(xì)胞。在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞(不同的細(xì)胞數(shù)量有所不同，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)快慢調(diào)整)，接種原則為過夜后融合率達(dá)到100％。

3、細(xì)胞劃線。第二天用槍頭，垂直于細(xì)胞平面，沿著第一天劃在平板背面的線在細(xì)胞層上進(jìn)行劃痕(不同孔之間最好使用同一只槍頭)。

4、洗細(xì)胞。劃痕完成后，使用無菌PBS洗細(xì)胞3次，洗去不貼壁的細(xì)胞，即劃線時(shí)劃線的細(xì)胞，劃線后留下的間隙清晰可見，然后更換新鮮無血清培養(yǎng)基。

5、細(xì)胞培養(yǎng)、觀察。樣品(實(shí)施例1產(chǎn)物、神經(jīng)酰胺3B)用培養(yǎng)基稀釋后(實(shí)施例1產(chǎn)物濃度為100mg/L，神經(jīng)酰胺3B濃度為100mg/L)加入細(xì)胞培養(yǎng)皿，將細(xì)胞放入37℃、5wt%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在24h后取出細(xì)胞，顯微鏡觀察并測(cè)量劃痕的寬度，并拍照，用ImageJ軟件計(jì)算愈合率。

結(jié)果如圖1所示，相比溶劑對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的劃痕寬度更窄，說明亞麻籽油神經(jīng)酰胺具有更好的組織愈合能力。溶劑對(duì)照組在24h后的愈合率為35.17％，亞麻籽油神經(jīng)酰胺在24h后的愈合率為94.57％，神經(jīng)酰胺3B在24h后的愈合率為59.32％。本發(fā)明的化合物明顯提升了細(xì)胞愈合速率，具備良好的皮膚組織修復(fù)活性，而且效果比神經(jīng)酰胺3B更好。

實(shí)施例5

彈性蛋白酶抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)試抗衰老作用

彈性蛋白酶抑制方法：取2mg/mL彈性蛋白酶溶液2mL，加入不同濃度樣品(實(shí)施例1產(chǎn)物)，充分渦旋混勻，在37℃、400r/min搖床振蕩20min，立即加入pH6.0的0.5mol/L磷酸鹽緩沖液5mL，渦旋混勻，取適量混勻液至2mL離心管內(nèi)，在9391×g下離心10min，精密吸取上清液200μL至96孔板內(nèi)，在波長(zhǎng)495nm處酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，同時(shí)進(jìn)行400～800nm光譜掃描。

以底物加酶溶液為空白對(duì)照組，底物加酶和樣品溶液為酶抑制組，底物加樣品不加酶溶液作扣背景用。每組均設(shè)3復(fù)孔。抑制率(％)＝[1–(An–An′)/(A0–A0′)]×100％，式中，A0為加酶不加樣品的吸光度，A0′為僅加底物不加樣品和酶的吸光度，An為僅加樣品溶液的吸光度，An′為加樣品不加酶的吸光度。若An′>An，則表現(xiàn)為促進(jìn)作用，促進(jìn)率(％)=[1–(An′–An)/(A0–A0′)]×100％。

結(jié)果如圖2所示，亞麻籽油神經(jīng)酰胺在不同濃度下對(duì)彈性蛋白酶均具有較好的抑制效果，具體而言，在0.25g/L的濃度時(shí)對(duì)彈性蛋白酶的抑制率為17.47％，在0.5g/L的濃度時(shí)對(duì)彈性蛋白酶的抑制率為25.00％，在1.0g/L的濃度時(shí)對(duì)彈性蛋白酶的抑制率為33.60％，在2.0g/L的濃度時(shí)對(duì)彈性蛋白酶的抑制率為41.67％。

按照相同的方法測(cè)試神經(jīng)酰胺2對(duì)彈性蛋白酶的抑制活性，結(jié)果如圖3所示，在濃度為0.25、0.5、1.0、2.0g/L時(shí)的彈性蛋白酶抑制率分別為10.12％、18.06％、28.84％和19.78％，其抑制效果不如相同濃度的亞麻籽油神經(jīng)酰胺。

實(shí)施例6

抗光老化測(cè)試

MMP1又稱間質(zhì)性膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶，屬基質(zhì)金屬蛋白酶家族，其主要作用底物為纖維性膠原，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維和明膠及改變細(xì)胞的微環(huán)境。MMP1在彈性蛋白中起著重要作用，抑制MMP1可提高成纖維細(xì)胞膠原蛋白和彈性蛋白合成，MMP活性降低可增加膠原合成速度。

將HaCaT細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度種于96孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。24h后棄去上清液，加入含不同濃度的樣品(實(shí)施例1產(chǎn)物)的培養(yǎng)基100μL，模型組不加入樣品，陰性對(duì)照組為不含樣品的DMEM培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％CO2、37℃環(huán)境中孵育2h后，輻射UVA或UVB紫外線。紫外線輻射光源與細(xì)胞之間的距離為15cm，UVA強(qiáng)度為200mJ/cm2，輻射時(shí)間為2h，UVB強(qiáng)度為50mJ/cm2，輻射時(shí)間為1h。結(jié)束輻射后，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育12h。使用MMP-1ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-1基因表達(dá)。抑制率＝1-(實(shí)驗(yàn)組MMP1表達(dá)量/模型組MMP1表達(dá)量)×100％。

結(jié)果如圖4、5所示，對(duì)于UVA，陰性對(duì)照組的MMP1表達(dá)量設(shè)為1，模型組的表達(dá)量為1.90，亞麻籽油神經(jīng)酰胺在125、250、400mg/L的濃度時(shí)，相對(duì)模型組MMP1表達(dá)的抑制率為39％、47％、64％；對(duì)于UVB，陰性對(duì)照組的MMP1表達(dá)量設(shè)為1，模型組的表達(dá)量為2.33，亞麻籽油神經(jīng)酰胺在125、250、400mg/L的濃度時(shí)，相對(duì)模型組MMP1表達(dá)的抑制率為38％、48％、67％。

UVA紫外線輻射后，角質(zhì)形成細(xì)胞促進(jìn)成纖維細(xì)胞MMP1表達(dá)升高，從而引起皮膚細(xì)胞外基質(zhì)和皮膚膠原降解，導(dǎo)致皮膚光老化。上述結(jié)果表明，亞麻籽油神經(jīng)酰胺可以抑制紫外線輻射導(dǎo)致的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMP1，對(duì)防止皮膚光老化有一定作用。

實(shí)施例7

DPPH自由基清除檢測(cè)抗氧化性能

DPPH是1,1-二苯-2-三硝苯肼，可以用于抗氧化實(shí)驗(yàn)。將對(duì)應(yīng)濃度(50、100、200、400、800mg/L)樣品(實(shí)施例1產(chǎn)物)分別與0.1mol/LDPPH、無水乙醇溶液按1：1的體積比例混合均勻，DPPH與無水乙醇1：1等體積混合，室溫避光反應(yīng)30min，于517nm處測(cè)吸光值。樣品與DPPH反應(yīng)液的吸光度記作A1，樣品與無水乙醇反應(yīng)液的吸光度記作A2，DPPH與無水乙醇反應(yīng)液的吸光度記作A3，樣品的DPPH清除率＝[1-(A1-A2)/A3]×100％。

結(jié)果如圖6所示，在濃度為50、100、200、400、800mg/L時(shí)的DPPH自由基清除率分別為9.43％、23.91％、35.10％、41.93％、50.27％，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化效果。按照相同的方法測(cè)試神經(jīng)酰胺3B(即油酸神經(jīng)酰胺)的抗氧化效果，結(jié)果如圖7所示，在濃度為50、100、200、400、800mg/L時(shí)的DPPH自由基清除率為7.76％、12.82％、24.10％、29.60％、33.16％。亞麻籽油神經(jīng)酰胺對(duì)DPPH的清除率高于神經(jīng)酰胺3B，具有更好的抗氧化效果。

實(shí)施例8

美白活性測(cè)試

取指數(shù)生長(zhǎng)期B16細(xì)胞，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25％胰蛋白酶-EDTA消化并吹打均勻，將細(xì)胞按3×105個(gè)/孔的密度接種于12孔板。于37℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)過夜。棄去上清液，加入含不同質(zhì)量濃度樣品(實(shí)施例1產(chǎn)物)的培養(yǎng)液，以不加樣品的RPMI-1640培養(yǎng)基孵育為空白組，加DMEM培養(yǎng)基孵育為造模組，每組3個(gè)復(fù)孔，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％CO2、37℃環(huán)境中孵育24h。將孔板中培養(yǎng)基棄去，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗一到兩次后，加入1mL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％DMSO的NaOH溶液(1mol/L)裂解細(xì)胞，置于80℃或100℃下恒溫2h至細(xì)胞完全溶解。置于酶標(biāo)儀中，于405nm下測(cè)吸光值。計(jì)算黑色素抑制率＝1-(各孔OD值/模型組OD值)×100％。

結(jié)果如圖8所示，空白對(duì)照組的黑色素含量設(shè)為1，造模組的黑色素表達(dá)為1.51，在濃度為10、20、40、80、100mg/L時(shí)，亞麻籽油神經(jīng)酰胺的黑色素抑制率分別為9.46％、16.06％、24.42％、27.79％、35.01％，表現(xiàn)出很好的美白效果。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何屬于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。

 

摘自國(guó)家發(fā)明專利，亞麻籽油神經(jīng)酰胺及其合成方法與用途，發(fā)明人：楊超文，葉柳；申請(qǐng)?zhí)枺?/font>202310051500.7申請(qǐng)日：2023.02.02