摘 要：一種具有抗血栓活性的漢麻仁多肽序列的篩選方法，屬于功能食品領(lǐng)域。所述方法為：以漢麻仁蛋白為原料，凝血酶抑制率為指標，篩選最優(yōu)酶及酶解最佳工藝條件，得到凝血酶抑制活性最高的酶解液；將酶解液逐級分離純化，得到凝血酶抑制活性最高的分子量段進行多肽序列鑒定；獲得的序列通過與凝血酶進行柔性配體對接，計算得到多肽序列與凝血酶底物結(jié)合結(jié)合分子對接打分、多肽序列鑒定打分、豐度及氨基酸數(shù)量進行篩選，選擇幾個多肽序列進行凝血酶抑制率的試驗驗證，驗證后凝血酶抑制活性最高的多肽序列進行生物固相合成，進行斑馬魚體內(nèi)的抗血栓活性。本發(fā)明中體內(nèi)驗證采用的是斑馬魚試驗，周期更短、觀察更直觀、用樣量更少、可行性更高。
權(quán)利要求書
1.一種具有抗血栓活性的漢麻仁多肽序列的篩選方法，其特征在于：所述方法為：
步驟一：酶解：以漢麻仁蛋白為原料，以凝血酶抑制率為指標，篩選最優(yōu)酶、優(yōu)化酶解最佳工藝條件，得到凝血酶抑制活性最高的酶解液；
步驟二：鑒定酶解肽序列：將步驟一中的酶解液逐級分離純化，得到凝血酶抑制活性最高的分子量段進行多肽序列鑒定；
步驟三：分子對接：獲得的序列通過與凝血酶進行柔性配體對接，進行計算，得到多肽序列與凝血酶底物結(jié)合打分；
步驟四：選定幾種進行體外驗證：結(jié)合分子對接打分、多肽序列鑒定打分、豐度及氨基酸數(shù)量進行篩選，選擇8個多肽序列進行了生物合成，采用凝血酶抑制率的試驗進行驗證，
檢測這8個序列是否具有凝血酶抑制活性，若有，則進行步驟五，若沒有，則結(jié)合打分高的重新選擇多肽序列進行生物合成；
步驟五：體內(nèi)驗證：選擇驗證后凝血酶抑制活性最高的多肽序列進行生物固相合成，進行斑馬魚體內(nèi)抗血栓試驗，驗證其在體內(nèi)是否具有抗血栓活性，若有，則成功篩選得到具有抗血栓活性的漢麻仁多肽序列，若沒有，則返回步驟四，結(jié)合打分高的重新選擇多肽序列進行生物合成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有抗血栓活性的漢麻仁多肽序列的篩選方法，其特征在于：所述方法為：
步驟一：以漢麻仁蛋白為原料，以優(yōu)化的酶解工藝進行生物轉(zhuǎn)化獲得混合漢麻仁抗血栓肽；
步驟二：通過動態(tài)錯流濃縮膜過濾技術(shù)純化得到了分子量在3000Da以下的漢麻仁抗血栓肽，并進行肽段鑒定，獲得了1749個多肽序列；
步驟三：采用分子對接生物信息學手段預測篩選出了具有高抗血栓活性的漢麻肽序列103個；
步驟四：結(jié)合分子對接打分、多肽序列鑒定打分、豐度及氨基酸數(shù)量進行篩選，從103個漢麻肽序列中優(yōu)選了8個進行生物合成，并通過體外凝血酶抑制活性從這8個中篩選出最優(yōu)的；(篩選標準：根據(jù)①分子對接結(jié)合能打分情況(絕對值高于100)；②液質(zhì)連用多肽序列鑒定打分情況(高于100)；③液質(zhì)連用多肽序列鑒定的豐度(大于1*107))；
步驟五：體內(nèi)驗證：選擇驗證后凝血酶抑制活性最高的多肽序列進行生物固相合成，進行斑馬魚體內(nèi)抗血栓試驗，驗證其在體內(nèi)的抗血栓活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有抗血栓活性的漢麻仁多肽序列的篩選方法，其特征在于：步驟一中，酶解工藝條件為溫度37?50℃，料液比1：16?40，酶添加量1％?7％，pH7.0?8.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有抗血栓活性的漢麻仁多肽序列的篩選方法，其特征在于：步驟一中，酶解工藝條件為溫度40℃，料液比1:25，酶添加量5.68％，pH8.0。
5.一種權(quán)利要求1～4任一項篩選得到的漢麻仁多肽序列在制備抗血栓藥物中的應用。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于功能食品領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗血栓活性的漢麻仁多肽序列的篩選方法。
背景技術(shù)
大麻血栓的形成在各種心血管疾病的發(fā)病機理中起關(guān)鍵作用，血栓類疾病嚴重威脅著人類的健康[1]。據(jù)統(tǒng)計，血栓導致的死亡已達全球總死亡人數(shù)的51％，遠高于腫瘤及其他疾病的死亡率，是目前國家重點監(jiān)控防治的一類疾病。
特別是在新冠病毒出現(xiàn)以來，起初被認為主要引起肺炎和急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)等呼吸道相關(guān)臨床特征的COVID?19[2]，被越來越多的研究發(fā)現(xiàn)與靜脈、動脈和微血管血栓形成的血栓前狀態(tài)密切相關(guān)。尸檢研究表明，靜脈血栓栓塞可能是導致COVID?19重癥患者死亡的主要原因[3]。因此，血栓的預防和治療已成為當今學界一大熱點問題。由于目前臨床上傳統(tǒng)的抗血小板藥物和抗凝藥物仍存在出血事件、藥效不夠、選擇性差等弊端，因而高效且副作用小的抗血栓藥物及其預防和治療作用機制成為學者們研究的重點。目前常采用合成方法或從生物中提取兩種手段獲得抗血栓肽，合成方法得到的抗血栓肽成本高，不利于臨床應用，生物提取的抗血栓肽源多為毒蛇、蜈蚣、水蛭等有安全性問題的生物，獲得的抗血栓肽易攜帶本身具有的副作用。而在大健康、治未病時代來臨之際，采用食源性原料獲取抗血栓活性肽，無毒害作用，安全性高，在人的腸胃內(nèi)很快被消化吸收，進而在人體的抗血栓系統(tǒng)中發(fā)揮作用。
漢麻又稱火麻，作為高生態(tài)性且具有特殊作用的經(jīng)濟作物，于2002年被列入藥食同源目錄，成為藥食兩用的功能性食品原料。我國對漢麻仁的研究較早，李時珍在《本草綱目》中對漢麻仁的醫(yī)用價值有記載，稱其能“補中益氣，久服肥健不老”，“去風痹皮頑，令人心歡，利大腸、風熱結(jié)燥”，“破積血，復血脈，去乳婦產(chǎn)后余疾，取汁煮粥食，止呃逆”等。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，漢麻仁有較好的降血壓、利尿、鎮(zhèn)痛、抗炎、預防血栓形成的作用，長期食用，對慢性神經(jīng)炎、癱瘓、便秘、高血壓、高血脂、潰瘍以及婦科疾病具有很好的輔助療效[4]。叢濤[5]等研究了漢麻仁對生長期大鼠營養(yǎng)生理功能的影響，發(fā)現(xiàn)服用漢麻蛋白質(zhì)的大鼠血清總蛋白顯著降低，但血清白蛋白占比最高，達78.2％，血清白蛋白具有抑制血小板聚集、抗凝血以及提高免疫力的生理功能。通過本課題組多年對漢麻仁蛋白提取物的細胞學及小鼠試驗研究中也發(fā)現(xiàn)漢麻仁含有抗肝癌、抗炎、抗菌以及促重金屬代謝的多種肽[6,7]。傳統(tǒng)的食源性生物活性肽的主要篩選鑒定方法為：選定目標蛋白、蛋白水解、分離或純化水解產(chǎn)物或者單個肽段、活性測定及驗證肽的活性。在此過程中，蛋白分離純化將會耗費大量的樣品和純化時間，且結(jié)果不能得到保障；每次純化的數(shù)量有限，分離之后收集的樣品經(jīng)各種濃縮干燥等過程，會造成大量的損失。同時傳統(tǒng)的食藥體內(nèi)試驗常采用小鼠、大鼠、豚鼠等作為模型生物。雖然穩(wěn)定性好，但是試驗周期長、活性物質(zhì)消耗量大，試驗成本非常高。
[1] 馬廣大.心血管疾病急診患者的臨床特點分析及臨床治療對策[J].世界最新醫(yī)學信息文摘,2019,19(56):46?47.
[2] Ahmed S ,Zimba O ,Gasparyan A Y .Thrombosis in Coronavirus disease 2019(COVID?19)through the prism of Virchow 's triad[J] .Clin Rheumatol ,2020 ,39(9):2529?2543.
[3] Zhou P ,Yang X L ,Wang X G ,et al .A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin[J] .Nature ,2020 ,579(7798):270?273.
[4] 宋淑敏,劉宇峰,董艷等.漢麻籽的營養(yǎng)價值及開發(fā)利用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2016,(9):54?55.
[5] 叢濤,江雪媛,趙霖等.火麻仁蛋白質(zhì)粉對生長期大鼠營養(yǎng)生理功能的影響研究[J].中國食品學報,2011,11(02):60?69.
[6] 魏連會,董艷,石杰等.漢麻籽粕酶解物中抗肝癌Hep3B細胞活性肽的分離與鑒定[J].中國糧油學報,2022,37(03):74?78.
[7] 魏連會,宋淑敏,董艷等.漢麻籽多肽的氨基酸營養(yǎng)組成與體外結(jié)合膽酸鹽能力的研究[J].中國糧油學報,2020,35(01):62?66.
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗血栓活性的漢麻仁多肽序列的篩選方法，同時為篩選的漢麻仁蛋白提供一種新的應用方式，提供一種血栓類疾病預防和治療的一種安全的途徑。
本發(fā)明以漢麻仁蛋白為原料，以優(yōu)化的酶解工藝進行生物轉(zhuǎn)化獲得混合漢麻仁抗血栓肽；通過動態(tài)錯流濃縮膜過濾技術(shù)純化得到了分子量在3000Da以下的漢麻仁抗血栓肽，并進行肽段鑒定，獲得了1749個多肽序列；采用分子對接等生物信息學手段預測篩選出了具有高抗血栓活性的漢麻肽(結(jié)合能打分絕對值>100分)序列103個，優(yōu)選了8個進行生物合成，并驗證其體外凝血酶抑制活性；選擇凝血酶抑制活性最好的一個多肽序列(DERQREIEQERR)進行了斑馬魚血栓模型試驗，驗證了其體內(nèi)抗血栓活性。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
一種具有抗血栓活性的漢麻仁多肽序列的篩選方法，所述方法為：
步驟一：酶解：以漢麻仁蛋白為原料，以凝血酶抑制率為指標，篩選最優(yōu)酶、優(yōu)化酶解最佳工藝條件，得到凝血酶抑制活性最高的酶解液；
步驟二：鑒定酶解肽序列：將步驟一中的酶解液逐級分離純化，得到凝血酶抑制活性最高的分子量段進行多肽序列鑒定；
步驟三：分子對接：獲得的序列通過與凝血酶進行柔性配體對接，進行計算，得到多肽序列與凝血酶底物結(jié)合打分；
步驟四：選定幾種進行體外驗證：結(jié)合分子對接打分、多肽序列鑒定打分、豐度及氨基酸數(shù)量進行篩選，選擇8個多肽序列進行了生物合成，采用凝血酶抑制率的試驗進行驗證，檢測這8個序列是否具有凝血酶抑制活性，若有，則進行步驟五，若沒有，則結(jié)合打分高的重新選擇多肽序列進行生物合成；
步驟五：體內(nèi)驗證：選擇驗證后凝血酶抑制活性最高的多肽序列進行生物固相合成，進行斑馬魚體內(nèi)抗血栓試驗，驗證其在體內(nèi)是否具有抗血栓活性，若有，則成功篩選得到具有抗血栓活性的漢麻仁多肽序列，若沒有，則返回步驟四，結(jié)合打分高的重新選擇多肽序列進行生物合成。
進一步地，所述方法為：
步驟一：以漢麻仁蛋白為原料，以優(yōu)化的酶解工藝進行生物轉(zhuǎn)化獲得混合漢麻仁抗血栓肽；
步驟二：通過動態(tài)錯流濃縮膜過濾技術(shù)純化得到了分子量在3000Da以下的漢麻仁抗血栓肽，并進行肽段鑒定，獲得了1749個多肽序列；
步驟三：采用分子對接生物信息學手段預測篩選出了具有高抗血栓活性的漢麻肽序列103個；
步驟四：結(jié)合分子對接打分、多肽序列鑒定打分、豐度及氨基酸數(shù)量進行篩選，從103個漢麻肽序列中優(yōu)選了8個進行生物合成，并通過體外凝血酶抑制活性從這8個中篩選出最優(yōu)的；(篩選標準：根據(jù)①分子對接結(jié)合能打分情況(絕對值高于100)；②液質(zhì)連用多肽序列鑒定打分情況(高于100)；③液質(zhì)連用多肽序列鑒定的豐度(大于1*107))；
步驟五：體內(nèi)驗證：選擇驗證后凝血酶抑制活性最高的多肽序列進行生物固相合成，進行斑馬魚體內(nèi)抗血栓試驗，驗證其在體內(nèi)的抗血栓活性。
進一步地，步驟一中，酶解工藝條件為溫度37?50℃，料液比1：16?40，酶添加量1％?7％，pH7.0?8.5。
進一步地，步驟一中，酶解工藝條件為溫度40℃，料液比1:25，酶添加量5.68％，pH8.0。
一種上述篩選方法得到的漢麻仁多肽序列在制備抗血栓藥物中的應用。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為：本發(fā)明采用藥食同源的漢麻仁獲取抗血栓活性肽，無毒害作用，安全性高，在人的腸胃內(nèi)很快被消化吸收，進而在人體的抗血栓系統(tǒng)中發(fā)揮作用。本發(fā)明中體內(nèi)驗證采用的是斑馬魚試驗，它為抗血栓活性食藥的研究提供了周期更短、觀察更直觀、用樣量更少、可行性更高的體內(nèi)研究評價手段。
圖1為不同酶解液凝血酶抑制率(P<0.05)對比圖；
圖1
圖2為不同pH對漢麻仁抗血栓肽凝血酶抑制活性的影響圖；
圖2
圖3為不同料液比對漢麻仁抗血栓肽凝血酶抑制活性的影響圖；
圖3
圖4為不同加酶量對漢麻仁抗血栓肽凝血酶抑制活性的影響圖；
圖4
圖5為不同酶解溫度對漢麻仁抗血栓肽凝血酶抑制活性的影響圖；
圖5
圖6為LC?MSMS檢測結(jié)果圖；
圖6
圖7為2BVR的分子對接袋示意圖；
圖7
圖8為漢麻仁多肽DERQREIEQERR與凝血酶復合物結(jié)構(gòu)圖；
圖8
圖9為斑馬魚心臟紅細胞染色強度示例圖；
圖9
圖10為斑馬魚心臟紅細胞染色強度正常對照組示例圖；
圖10
圖11為斑馬魚心臟紅細胞染色強度模型對照組示例圖；
圖11
圖12為斑馬魚心臟紅細胞染色強度阿司匹林50μg/mL示例圖；
圖12
圖13為斑馬魚心臟紅細胞染色強度漢麻仁抗血栓肽31.2μg/mL示例圖；
圖13
圖14為斑馬魚心臟紅細胞染色強度漢麻仁抗血栓肽62.5μg/mL示例圖；
圖14
圖15為斑馬魚心臟紅細胞染色強度漢麻仁抗血栓肽125μg/mL示例圖；
圖15
圖16為漢麻仁抗血栓肽處理后斑馬魚心臟紅細胞染色強度圖；
圖16
圖17為漢麻仁抗血栓肽處理后斑馬魚血流速度圖；
圖17
圖18為斑馬魚節(jié)間血管直徑分析區(qū)域示例圖；
圖18
圖19為斑馬魚節(jié)間血管直徑分析區(qū)域正常對照組示例圖；
圖19
圖20為斑馬魚節(jié)間血管直徑分析區(qū)域模型對照組示例圖；
圖20
圖21為斑馬魚節(jié)間血管直徑分析區(qū)域阿司匹林50.0μg/mL示例圖；
圖21
圖22為斑馬魚節(jié)間血管直徑分析區(qū)域漢麻仁抗血栓肽31.2μg/mL示例圖；
圖22
圖23為斑馬魚節(jié)間血管直徑分析區(qū)域阿司匹林62.5μg/mL示例圖；
圖23
圖24為斑馬魚節(jié)間血管直徑分析區(qū)域漢麻仁抗血栓肽125μg/mL示例圖；
圖24
圖25為漢麻仁抗血栓肽處理后斑馬魚節(jié)間血管直徑圖；
圖25
圖26為vegfr1基因相對表達量圖；
圖26
圖27為caspase?3基因相對表達量圖。
圖27
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍中。
實施例1：
一種具有抗血栓活性的漢麻仁多肽序列的制備和發(fā)現(xiàn)過程：
1.多酶種篩選試驗：
材料與試劑：漢麻蛋白粉：本實驗室CO2超臨界萃取除油粉碎后獲得，蛋白質(zhì)含量69％；胰蛋白酶(豬源、EC3.4、酶活力1:250)、胃蛋白酶(豬源、EC3.4、酶活力1:3000)、中性蛋白酶(EC3.4、酶活力50U/mg)、凝血酶(EC3.4、酶活力2000U/mg)、纖維蛋白原(牛血漿)：上海麥克林生化科技有限公司；木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、氨肽酶、堿性蛋白酶：無錫雪酶酶制劑科技有限公司；鹽酸，氫氧化鈉，三羧甲基氨基甲烷(Tris)均為分析純。
方法：稱取7份漢麻仁蛋白粉，每份5g，分別加入7種蛋白酶0.25g、水80mL，pH調(diào)至最適，溫度最適，酶解5h后90℃滅酶10分鐘，5000rpm離心15min，取上清液用于凝血酶抑制率的檢測。使用酶標儀比色法測定凝血酶抑制率。以Tris?HCl緩沖液(0.05mol/L，pH＝7.4)配置纖維蛋白原溶液(1.5mg/mL)和凝血酶溶液(10U/mL)。酶標板上加入140μL纖維蛋白原溶液和40μL樣品溶液，混勻后于405nm波長處讀數(shù)(ASB)，加入20μL凝血酶溶液后于37℃恒溫反應20min后讀數(shù)(AS)?？瞻撞捎?0μLTris?HCl緩沖液，其他操作同樣品管，測得吸光值讀數(shù)(ACB)和(AC)。凝血酶抑制計算公式如下：
凝血酶抑制率（%）=
結(jié)果：由圖1可見，試驗中選擇的七種酶在理論最優(yōu)酶解條件下對漢麻仁進行水解后，各酶解液均對凝血酶具有一定的抑制作用，其中胰蛋白酶酶解液對凝血酶的抑制作用顯著高于其他水解酶，達到73.65％，因此選擇胰蛋白酶作為最優(yōu)酶，進行下一步工藝優(yōu)化試驗。
2.漢麻仁抗血栓混合肽制備工藝優(yōu)化試驗：
材料與試劑：漢麻蛋白粉：本實驗室CO2超臨界萃取除油粉碎后獲得，蛋白質(zhì)含量69％；胰蛋白酶(豬源、EC3.4、酶活力1:250)：上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸，氫氧化鈉，三羧甲基氨基甲烷(Tris)均為分析純。
方法：單因素試驗：采用胰蛋白酶對漢麻仁蛋白進行水解。固定漢麻仁蛋白添加量為1.5g，酶解時間為5小時，以凝血酶抑制率為相應指標，分別探討料液比、溫度、酶添加量(以蛋白濃度為底物)和pH對漢麻仁抗血栓肽制備的影響，從而確定響應面試驗中各因素的水平。如表1。
表1 單因素試驗
|
A 溫度(℃) |
B 料液比 |
C 酶添加量(％) |
D pH |
|
37 |
1:16 |
1 |
7.0 |
|
41 |
1:23 |
3 |
7.5 |
|
45 |
1:30 |
5 |
8.0 |
|
50 |
1:40 |
7 |
8.5 |
響應面優(yōu)化設計：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取溫度、料液比、酶添加量和pH試驗影響因素，分別以A、B、C、D代表，以凝血酶抑制率為響應值，設計四因素三水平(表2)的響應面分析法。利用Design Expert.V8.0.6軟件進行響應面優(yōu)化。
表2 響應面因素水平表
|
試驗因素 |
試驗水平 |
||
|
-1 |
0 |
1 |
|
|
A 溫度(℃) |
37 |
41 |
45 |
|
B 料液比 |
1:16 |
1:23 |
1:30 |
|
C 酶添加量(％) |
3 |
5 |
7 |
|
D pH |
7.5 |
8.0 |
8.5 |
結(jié)果：單因素試驗結(jié)果：圖2～5可見，隨著pH的升高，漢麻仁抗血栓肽的凝血酶抑制活性逐漸升高，pH8.0時達到67.86％，但是當pH為8.5時凝血酶活性又有所下降，這可能是由于pH值過高導致漢麻仁蛋白或胰蛋白酶部分變性引起的酶解效率減弱，使得酶解獲得的抗血栓肽減少。
較高的料液比有利于漢麻仁抗血栓肽發(fā)揮凝血酶抑制活性，特別是在料液比為1：16和1：23時，漢麻仁抗血栓肽的凝血酶抑制率均達到70％左右，過低的料液比降低了酶解液的凝血酶抑制活性，這可能是由于稀釋了體系中漢麻仁抗血栓肽的濃度導致的。
當加酶量為1％時抑制率較低，只有26％，這是由于反應體系中胰蛋白酶濃度較低，從而導致水解度較低，生成的漢麻仁抗血栓活性片段也較低。凝血酶抑制率在加酶量為5％時達到最大值71.55％，隨后隨著加酶量增加反而呈下降趨勢，分析原因可能是由于加酶量過高導致了底物過度酶解，減少了體系中漢麻仁抗血栓活性片段的濃度。
隨著酶解溫度的升高，凝血酶抑制率從平穩(wěn)逐漸降低，在41℃時達到最大值，隨后開始下降，在50℃時將至27.98％，這可能是因為過高的溫度導致胰蛋白酶活性下降，使?jié)h麻仁抗血栓肽的濃度降低。
響應面結(jié)果與分析：
利用Design?Expert.V8.0.6軟件對表中漢麻仁抗血栓活性肽的凝血酶抑制率數(shù)據(jù)結(jié)果進行多元回歸擬合，得到各因素與響應值凝血酶抑制率(Y)回歸模型擬合公式為：Y＝76.88?4.42A+4.77B+2.99C+8.13D?8.89AD+11.03BD+2.77CD?16.85A2?27.50B2?8.54C2?3.06D2。
表3 響應面試驗設計結(jié)果
表4為回歸模型方差的分析結(jié)果，F(xiàn)＝74.46，回歸模型p＜0.01，極顯著。失擬項p＝0.0020＜0.01，極顯著。模型回歸系數(shù)R2＝0.9797，這說明所建模型擬合效果較好，可以解釋97.97％的響應值變化。校正后的模型系數(shù)R2Adj＝0.9665，說明了模型的準確性較好。因此該方法可用于分析和預測漢麻仁抗血栓活性肽的提取工藝。從表中模型系數(shù)的分析可知，四個因素p值均小于0.01，達到極顯著水平，說明對漢麻仁抗血栓活性肽的提取影響明顯；在交互項中，AD和BD的p值均小于0.01，表明兩兩因素之間影響極顯著(參見圖6)。根據(jù)F值大小得出四個因素對漢麻仁抗血栓活性肽提取工藝的影響順序：pH＞料液比＞溫度＞酶添加量。漢麻仁抗血栓活性肽的最優(yōu)工藝參數(shù)為：溫度40℃，料液比1:25，酶添加量5.68％，pH8.0。該條件下預測的凝血酶抑制率最大，為87.83％。
表4 響應面回歸模型方差分析結(jié)果
注：*表示顯著(p＜0.05)，**表示極顯著(p＜0.01)
按照模型得出的最佳工藝條件進行了三次驗證試驗，最終所得凝血酶抑制率平均值為84 .70％，與回歸模型預測值相比，特異性活力相對誤差為3 .57％，結(jié)果表明，本方法具有較好的預測性和準確性，能夠預測和分析漢麻仁抗血栓活性肽的最佳提取工藝。
3.漢麻仁抗血栓肽的純化和序列檢測、鑒定：
材料與試劑：漢麻蛋白粉：本實驗室CO2超臨界萃取除油粉碎后獲得，蛋白質(zhì)含量69％；胰蛋白酶(豬源、EC3 .4、酶活力1:250)：上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸，氫氧化鈉，三羧甲基氨基甲烷(Tris)均為分析純。
方法：使用3000Da和5000Da分子截留量的超濾膜進行超濾純化，濾液進行凍干、收集后根據(jù)濃度需要配置成0 .005g/mL、0 .01g/mL、0 .02g/mL的溶液進行凝血酶抑制率的檢測。同時采用Maldi?tof和LC?MSMS方法進行分子量分布檢測和多肽序列鑒定。
結(jié)果：本研究采用超濾膜技術(shù)將獲得的混合漢麻仁抗血栓粗肽進行了3000Da以下和5000Da以下兩種分子量級的分級分離，并進行了凝血酶抑制率的檢測，結(jié)果如表5。通過超濾、凍干、定量取樣檢測，可見分子量在3000以下的漢麻仁抗血栓肽在濃度為0 .01g/mL有著更強的凝血酶抑制率，可以達到99％。
表5 不同分子量、不同濃度漢麻仁抗血栓肽凝血酶抑制率檢測結(jié)果
|
濃度(g/mL) |
3000Da以下 |
5000Da以下 |
|
0.005 |
83.55 |
48.39 |
|
0.01 |
99.38 |
62.44 |
|
0.02 |
88.56 |
59.64 |
采用LC?MSMS方法進行了3000Da以下多肽的鑒定，結(jié)果得到多肽序列1741個，氨基酸數(shù)量均在25個以下。分布結(jié)果統(tǒng)計如圖6所示，發(fā)現(xiàn)40％的多肽均在1000～1500Da之間，數(shù)量為677個，多數(shù)為13個氨基酸以下的多肽。500～1000Da的多肽含量為27 .5％，數(shù)量為302個。由此可見，酶解后漢麻仁蛋白分解成了更多小分子的多肽，這些小分子多肽的抗血栓活性更高。結(jié)合表5的結(jié)果看，酶解后仍有小部分大分子的漢麻仁多肽，會降低漢麻仁多肽的抗血栓活性。
4.漢麻仁抗血栓肽序列與凝血酶分子對接計算結(jié)果及體外驗證：
凝血酶的結(jié)構(gòu)從RCSBPDB數(shù)據(jù)庫下載，PDBID為2BVR。利用RDKit(https://rdkit.org)構(gòu)建1079個肽段的結(jié)構(gòu)。選取1079個多肽作為虛擬庫。在對接過程中，利用UCSFChimera2將受體和多肽轉(zhuǎn)化為MOL2格式用于之后的對接。對接時使用2BVR的天然配體(4CP)結(jié)合位點坐標生成盒子，采用網(wǎng)格參數(shù)文件計算網(wǎng)格。使用默認參數(shù)進行柔性配體對接，并為每個配體生成一個構(gòu)象。DOCK6是基于非鍵相互作用進行打分。對接后，利用obabel得到配體與受體的PDB復合物結(jié)構(gòu)。2BVR的分子對接袋如圖7所示。
計算結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)合能絕對值在100分以上的多肽為90個，氨基酸數(shù)量分布于11?13個之間。綜合考慮肽段鑒定打分結(jié)果、虛篩打分結(jié)果及肽段豐度結(jié)果，選擇8個多肽序列進行了生物固相合成，并通過凝血酶抑制率試驗進行了驗證，結(jié)果如表6：
表6 合成多肽凝血酶抑制活性結(jié)果
漢麻仁十二肽序列DERQREIEQERR(Asp?Glu?Arg?Gln?Arg?Glu?Ile?Glu?Gln?Glu?Arg?Arg與凝血酶復合物結(jié)構(gòu)如圖8，最終選擇該序列進行固相合成并進行斑馬魚體內(nèi)抗血栓效果驗證。
血管內(nèi)皮損傷改善功效評價：
1.檢測材料
1.1.樣品配制信息
漢麻仁抗血栓肽，用標準稀釋水配制成20.0mg/mL母液，現(xiàn)用現(xiàn)配；
陽性對照：阿司匹林腸溶片(以下簡稱阿司匹林)，批號為BJ54728，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，陰涼干燥避光儲存。用DMSO配制成50.0mg/mL母液，?20℃儲存。
1.2.實驗動物
斑馬魚均飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中(水質(zhì)：每1L反滲透水中加入200mg速溶海鹽，電導率為450～550μS/cm；pH為6.5～8.5；硬度為50～100mg/LCaCO3)，由本公司養(yǎng)魚中心繁殖提供，實驗動物使用許可證號為：SYXK(浙)2022?0004，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認證(認證編號：001458)的要求。
黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后5天(5dpf)的斑馬魚用于漢麻仁抗血栓肽血管內(nèi)皮損傷改善功效最大檢測濃度(MTC)測定及其功效評價。
野生型AB品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為5dpf的斑馬魚用于漢麻仁抗血栓肽血管內(nèi)皮損傷性血栓血流動力學改善功效評價。
轉(zhuǎn)基因血管綠色熒光斑馬魚(fli?1品系)，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為5dpf的斑馬魚用于漢麻仁抗血栓肽血管內(nèi)皮損傷性血栓節(jié)間血管直徑改善功效評價。
野生型AB品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為5dpf的斑馬魚用于漢麻仁抗血栓肽血管內(nèi)皮損傷性血栓改善功效機制研究。
1.3.儀器、耗材與試劑
解剖顯微鏡(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相機(VertA1，上海土森視覺科技有限公司，China)；心跳血流分析系統(tǒng)(ZebraBlood3.4，View Point Life Sciences，F(xiàn)rance)；精密電子天平(CP214，OHAUS，USA)；6孔板(Nest Biotech，China)；電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(AZ100，Nikon，Japan)；高速冷凍離心機(Heraeus Fresco17，Thermo Fisher，Germany)；
全自動樣品快速研磨儀(JXFSTPRP?24L，上海凈信實驗設備科技部，China)；全自動核酸提取儀(Auto?Pure32A，杭州奧盛儀器有限公司，China)；普通PCR擴增儀(T100，BIO?RAD，Singapore)；熒光定量PCR儀(CFX Connect，BIO?RAD，Singapore)；紫外?可見光分光光度計(Nanodrop2000，Thermo，USA)；微孔板迷你離心機(BE?6100，海門市其林貝爾儀器制造有限公司，China)；光學粘性封膜B(MSB1001，Bio?rad，USA)；低位裙邊96孔板(透明)(HSP9601，Bio?rad，USA)。
甲基纖維素(批號C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；普納替尼(批號13771，MedChemExpress，USA)；鄰聯(lián)茴香胺(批號MKBX3619V，Sigma，USA)；二甲基亞砜(DMSO，批號BCCD8942，Sigma，Switzerland)；無水乙醇(批號20210901，國藥集團化學試劑有限公司，China)；30％H2O2(批號H2206859，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；
無水乙酸鈉(批號F20090306，國藥集團化學試劑有限公司，China)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(批號027E2201CD，Vazyme，China)；FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)(批號X0320，天根生化科技(北京)有限公司，China)；預裝磁珠法通用型RNA提取試劑盒C(批號TL2210001643C，佛山奧維生物科技有限公司(ONREW)，China)。
檢測方法
2.1.MTC測定
隨機選取5dpf黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚于6孔板中，每孔(實驗組)均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予漢麻仁抗血栓肽(濃度見表7)，同時設置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3mL。除正常對照組外，其余各實驗組均水溶給予普納替尼建立斑馬魚血管內(nèi)皮損傷模型，28℃處理18h后，測定漢麻仁抗血栓肽對模型斑馬魚的MTC。
2.2.治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效評價
隨機選取5dpf黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚于6孔板中，每孔(實驗組)均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予漢麻仁抗血栓肽(濃度見表8)，陽性對照阿司匹林50.0μg/mL濃度，同時設置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3mL。除正常對照組外，其余各實驗組均水溶給予普納替尼建立斑馬魚血管內(nèi)皮損傷模型，28℃處理18h后，用鄰聯(lián)茴香胺進行染色，染色結(jié)束后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚置于解剖顯微鏡下拍照，用NIS?ElementsD3.20高級圖像處理軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計斑馬魚心臟紅細胞染色強度，以該指標的統(tǒng)計學分析結(jié)果評價漢麻仁抗血栓肽治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效。
統(tǒng)計學處理結(jié)果采用mean±SE表示。用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，p<0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。
2.3.血管內(nèi)皮損傷性血栓血流動力學改善功效評價
隨機選取5dpf野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔(實驗組)均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予漢麻仁抗血栓肽(濃度見表9)，陽性對照阿司匹林50.0μg/mL濃度，同時設置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3mL。除正常對照組外，其余各實驗組均水溶給予普納替尼建立斑馬魚血管內(nèi)皮損傷模型，28℃處理18h后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)下錄制斑馬魚血流視頻，分析統(tǒng)計斑馬魚血流速度，以該指標的統(tǒng)計學分析結(jié)果評價漢麻仁抗血栓肽血管內(nèi)皮損傷性血栓血流動力學改善功效。統(tǒng)計學處理結(jié)果采用mean±SE表示。用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，p<0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。
2.4.血管內(nèi)皮損傷性血栓節(jié)間血管直徑改善功效評價
隨機選取5dpffli?1品系斑馬魚于6孔板中，每孔(實驗組)均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予漢麻仁抗血栓肽(濃度見表10)，陽性對照阿司匹林50.0μg/mL濃度，同時設置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3mL。除正常對照組外，其余各實驗組均水溶給予普納替尼建立斑馬魚血管內(nèi)皮損傷模型，28℃處理18h后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照，用NIS?ElementsD3.20高級圖像處理軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚節(jié)間血管直徑，以該指標的統(tǒng)計學分析結(jié)果評價漢麻仁抗血栓肽血管內(nèi)皮損傷性血栓節(jié)間血管直徑改善功效。統(tǒng)計學處理結(jié)果采用mean±SE表示。用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，p<0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。
2.5.血管內(nèi)皮損傷性血栓改善功效機制研究
隨機選取5dpf野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔(實驗組)均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予漢麻仁抗血栓肽(濃度見表11)，陽性對照阿司匹林50.0μg/mL濃度，同時設置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3mL，每個實驗組設置三次平行實驗。除正常對照組外，其余各實驗組均水溶給予普納替尼建立斑馬魚血管內(nèi)皮損傷模型。28℃處理12h后，使用全自動核酸提取儀提取各組斑馬魚總RNA，利用紫外?可見光分光光度計對總RNA濃度和純度進行測定。取2.00μg斑馬魚樣品總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明操作，合成20.0μLcDNA，通過q?PCR檢測β?actin、vegfr1和caspase?3基因的表達。用β?actin作為基因表達的內(nèi)參，計算vegfr1和caspase?3基因的RNA相對表達量。統(tǒng)計學處理結(jié)果采用mean±SE表示。用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，p<0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。
3.檢測結(jié)果
3.1.MTC
在本實驗條件下，漢麻仁抗血栓肽血管內(nèi)皮損傷最大檢測濃度(MTC)為125μg/mL。
詳見表7。
表7 漢麻仁抗血栓肽血管內(nèi)皮損傷濃度摸索實驗結(jié)果(n＝30)
3.2.治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效評價
在本實驗條件下，漢麻仁抗血栓肽有治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效，表現(xiàn)為增加心臟紅細胞染色強度。詳見表8、圖9?圖16。圖9?圖15中藍色虛線框處為分析部位斑馬魚心臟，圖16中，與模型對照組比較，**p<0.01，***p<0.001。
表8 漢麻仁抗血栓肽治療血管內(nèi)皮損傷性血栓功效評價實驗結(jié)果(n＝10)
與模型對照組比較，**p<0.01，***p<0.001
3.3.血管內(nèi)皮損傷性血栓血流動力學改善功效評價
在本實驗條件下，漢麻仁抗血栓肽有改善血流速度功效。詳見表9和圖17。圖17中，與模型對照組比較，**p<0.01，***p<0.001
表9 漢麻仁抗血栓肽血管內(nèi)皮損傷性血栓血流動力學改善功效評價實驗結(jié)果(n＝10)
在本實驗條件下，漢麻仁抗血栓肽具有血管內(nèi)皮損傷性血栓節(jié)間血管直徑改善功效。詳見表10、圖18和圖19～24。圖18?圖24中，黑色虛線框內(nèi)為斑馬魚節(jié)間血管分析區(qū)域，圖25中，與模型對照組比較，**p<0.01，***p<0.001
表10 漢麻仁抗血栓肽血管內(nèi)皮損傷性血栓節(jié)間血管直徑改善功效評價實驗結(jié)果(n＝10)
與模型對照組比較，**p<0.01，***p<0.001
3.5.1.RNA提取結(jié)果及引物序列信息
在實驗終點，提取斑馬魚總RNA，用紫外?可見光分光光度計測定RNA的濃度及A260/A280比值(表11)，A260/A280比值均在1.8?2.2之間，表明提取得到斑馬魚總RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)q?PCR實驗。引物序列見表12。
表11 總RNA的濃度及A260/A280比值(n＝3)
表12 引物序列信息
3.5.2血管內(nèi)皮損傷性血栓改善功效機制研究
VEGF通過和其受體VEGFR結(jié)合，調(diào)節(jié)血管生成。VEGFR1主要在血管內(nèi)皮細胞中表達，當其與VEGF蛋白結(jié)合后，胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導區(qū)的酪氨酸發(fā)生磷酸化，從而激活細胞內(nèi)信號通路，導致血管內(nèi)皮細胞的生長、增殖和成熟，促進新生血管的生成。Caspase?3可誘導內(nèi)皮細胞的凋亡，刺激內(nèi)皮細胞合成血小板活化因子，從而引起血小板聚集。
在本實驗條件下，漢麻仁抗血栓肽能上調(diào)vegfr1基因相對表達量，下調(diào)caspase?3基因相對表達量。詳見表13、圖26和圖27。圖26中，與模型對照組比較，*p<0.05，***p<0.001，圖27中，與模型對照組比較，*p<0.05。
表13 漢麻仁抗血栓肽血管內(nèi)皮損傷性血栓改善功效機制研究實驗結(jié)果(n＝3)
與模型對照組比較，*p<0.05，***p<0.001。
摘自國家發(fā)明專利，石杰，董艷，魏連會，張正海，姬妍茹，李國巍，楊慶麗，潘靜，高媛，李柏陽，高宇，申請?zhí)枺?/font>202311583578.X，申請日：2023.11.24
