亞麻(Linum usitatissimum L.)是一年生的二倍體自花授粉植物，在中國、加拿大和印度廣泛種植[1]。它可分為纖維用亞麻和油用亞麻，是纖維和油脂兼用型的作物。油用亞麻簡稱胡麻，含有多種脂肪酸，其中α-亞麻酸(ALA)含量高達(dá) 50%。由于其豐富的營養(yǎng)特性，亞麻已經(jīng)成為飲食和疾病研究領(lǐng)域日益關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來，全球范圍內(nèi)極端天氣日益頻發(fā)，加劇了干旱地和鹽堿地的形成。因此，要實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，培育和篩選耐干旱和耐鹽堿的亞麻品種是提高其產(chǎn)量和充分利用逆境土地的有效途徑。
雖然亞麻喜涼爽濕潤氣候，耐寒、耐旱、耐貧瘠，在含鹽量0.2%以下的堿性土壤亦能栽培，但是土壤缺水和鹽堿化依然會對亞麻的產(chǎn)量、含油量、脂肪酸組分以及纖維的質(zhì)量產(chǎn)生重大影響[2-6]。亞麻比其他許多油料作物都更耐旱，但它的蒸騰系數(shù)很高，因此會損失大量水分[7]。劉瑩瑩等[8]發(fā)現(xiàn)，亞麻在干旱脅迫下，不同生育時期的干物質(zhì)積累量與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，影響亞麻籽粒產(chǎn)量的主導(dǎo)因子是千粒重。Quéro等[9]研究發(fā)現(xiàn)，b-氨基丁酸(b-aminobutyric acid，BABA)誘導(dǎo)了亞麻的干旱響應(yīng)過程。BABA會引起亞麻葉片中溶質(zhì)含量的重組，導(dǎo)致脯氨酸和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的積累，使亞麻更耐干旱。土壤鹽堿化會導(dǎo)致亞麻發(fā)芽和出苗延遲、幼苗存活率低、生長發(fā)育不穩(wěn)定以及減產(chǎn)。通過對亞麻的種質(zhì)資源進(jìn)行鹽堿脅迫，根據(jù)生物量、發(fā)芽率、幼苗性狀和產(chǎn)量篩選得到一批耐鹽堿品系[10-14]。為了解析亞麻耐鹽性的遺傳基礎(chǔ)，Yu等[15]利用深度測序技術(shù)分析了3種脅迫條件下樣本中的小RNA和降解物。研究發(fā)現(xiàn)，miR398a和miR530這2個miRNA與亞麻的鹽脅迫耐受性有關(guān)。將亞麻在堿-鹽脅迫、中性鹽脅迫和堿性脅迫下處理[16]發(fā)現(xiàn)，在中性鹽脅迫下，碳水化合物代謝受到影響；在堿-鹽脅迫下，光合作用和對生物刺激的反應(yīng)受到嚴(yán)重影響。堿-鹽脅迫下調(diào)控的差異表達(dá)基因多于堿性鹽脅迫或中性鹽脅迫下調(diào)控的差異表達(dá)基因，表明有更多的基因參與調(diào)控堿-鹽脅迫途徑。
植物中存在一個復(fù)雜而精細(xì)的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)應(yīng)對干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫，通過調(diào)控不同信號網(wǎng)絡(luò)之間的轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白酶類參與脅迫應(yīng)答。不同的環(huán)境脅迫下，特定的轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動子順式作用元件相結(jié)合激活或抑制下游靶基因的表達(dá)，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前已鑒定出多個參與非生物脅迫調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，如NCED、LEA、DREB、MYB/C、ABREs和AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子[17-18]。其中，AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5,19-22]，與植物生長發(fā)育[23-24]、生長激素[25-27]、低溫[28]、干旱[29-30]以及高鹽[31-34]的脅迫應(yīng)答等密切相關(guān)。
AP2/ERF是植物轉(zhuǎn)錄因子最大的家族之一[35]，已從多種植物中鑒定出AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子[36]，如擬南芥、水稻[37]、小麥[38]、大豆[39]和葡萄[40]。AP2/ERF包含1個或2個非常保守的AP2/ERFDNA結(jié)合域(DNA-binding domain)，至少包含一個高度保守的AP2/ERFDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。大約由60~70個氨基酸殘基組成，可直接與下游靶基因啟動子上的GCC盒和/或脫水反應(yīng)元件(DRE)/C-重復(fù)元件(CRT)等順式作用元件相互作用[36]。根據(jù)AP2/ERFDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和相似性，可分為5個亞家族：AP2(APETALA2)、RAV(與ABI3/VP1有關(guān))、DREB(脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)、ERF(乙烯反應(yīng)因子)和其他因子[41]。其中AP2家族蛋白擁有2個重復(fù)的AP2結(jié)構(gòu)域[42]。近年來，很多研究表明過表達(dá)AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子在植物的耐旱和耐鹽性中具有重要作用[43-45]。水稻(Oryzasativa.L.)OsERF83是一個定位于細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子，在干旱和脫落酸(ABA)脅迫時被誘導(dǎo)，過表達(dá)OsERF83可以顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性，并增強(qiáng)了光化學(xué)效率[46]。ZmERF21(ZeamaysL.)在玉米中過表達(dá)顯著增加了干旱條件下的葉綠素含量和抗氧化酶的活性，ZmERF21可能通過與潛在靶基因的啟動子結(jié)合，直接調(diào)節(jié)與激素(乙烯、脫落酸)和Ca信號相關(guān)的基因以及其他應(yīng)激響應(yīng)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)玉米幼苗的耐旱性[47]。陸地棉GhERF13.12(Gossypiumhirsutum)在擬南芥中異源表達(dá)可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性，同時上調(diào)ABA信號傳遞、脯氨酸生物合成和ROS清除途徑的相關(guān)基因的表達(dá)。此外，沉默GhERF13.12導(dǎo)致棉花對鹽脅迫的耐受性降低[48]。從耐鹽甘薯系(Ipomoea batatas (L.) Lam.)ND98中克隆了一個AP2/ERF基因IbRAP2-12，在擬南芥中異源表達(dá)IbRAP2-12可以增強(qiáng)鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性。在鹽和干旱脅迫下，參與ABA信號、JA信號、脯氨酸生物合成和活性氧(ROS)清除途徑中的基因在IbRAP2-12過表達(dá)株系中被顯著上調(diào)[49]。
WRINKLED1(WRI1)是AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子家族成員，調(diào)節(jié)碳在糖酵解和脂肪酸生物合成途徑之間的分配[50]，之前有很多研究表明AtWRI1或WRI1的同源基因可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植物種子的含油量[51-55]，但是在植物耐逆方面的功能作用還鮮有報道。前期我們從亞麻中克隆了一個WRINKLED1的同源基因LuWRI1a，蛋白序列分析LuWRI1a包含2個AP2的DNA結(jié)合域，屬于AP2轉(zhuǎn)錄因子家族[56]。通過分析LuWRI1a的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)含有響應(yīng)光、干旱、低溫和激素等多個非生物脅迫應(yīng)激元件。本研究通過對LuWRI1a過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行NaCl鹽脅迫和PEG-6000模擬干旱脅迫處理，測定各項生長指標(biāo)和生理指標(biāo)，分析轉(zhuǎn)錄因子LuWRI1a在亞麻鹽脅迫和干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的功能，有助于揭示AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子在逆境環(huán)境下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為亞麻耐擬品種的改良提供新的候選基因。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
供試材料為亞麻(Linum usitatissimum)栽培品種隴亞10號和LuWRI1a過表達(dá)T3代純合轉(zhuǎn)基因株系LuWRI1a-OX-X，種子由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所亞麻研究室提供。
1.2 LuWRI1a過表達(dá)亞麻株系的獲得
以非轉(zhuǎn)基因“隴亞10號”(野生型)為陰性對照。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化隴亞10號，將包含重組質(zhì)pE101-BASTA-LuWRI1a的農(nóng)桿菌GV3101侵染亞麻下胚軸，轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)[57]。先后在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)[58]，每2周更換1次培養(yǎng)基，直至獲得完整植株，收獲T0代種子。將T0代種子播種在含有10mgmL-1Basta(Sigma Aldrich)的1/2MS培養(yǎng)基上，取抗性苗葉片用CTAB法提取DNA，用表達(dá)載體上的bar基因序列設(shè)計特異引物進(jìn)行PCR檢測，收獲T1代種子。通過Basta篩選和PCR檢測鑒定陽性植株，直至獲得T3代純合株系，用于后續(xù)試驗(yàn)。
1.3 LuWRI1a 家族成員啟動子分析
從亞麻基因組序列中提取 LuWRI1a 基因起始位置上游 2000 bp 的序列，在PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順式作用元件分析。
1.4 試驗(yàn)處理
將進(jìn)口的丹麥品質(zhì)草炭土和蛭石按3:1的體積混合均勻，取適量混合營養(yǎng)土裝入小花盆中，盆高18cm，直徑15cm。選取籽粒飽滿、大小均勻的亞麻種子約15粒，播種到花盆內(nèi)，室溫放置。用1/2Hogland營養(yǎng)液培養(yǎng)1個月，每隔3d澆灌100mL次-1。光照強(qiáng)度為125μmolm-2s-1，光周期為16h/8h(光照/黑暗)，將培養(yǎng)4周的幼苗進(jìn)行脅迫處理。試驗(yàn)設(shè)置4個處理，3次重復(fù)。挑選長勢相同的幼苗進(jìn)行如下處理：①鹽脅迫處理：用1/2Hoagland營養(yǎng)液配制200mmolL-1NaCl營養(yǎng)液，每隔3d澆灌100mL；②PEG-6000模擬干旱處理：用1/2Hoagland營養(yǎng)液配制25%PEG營養(yǎng)液，每隔3d澆灌100mL；對照組每隔3d澆灌100mL1/2Hogland營養(yǎng)液。脅迫處理2周后，觀察表型并測定相關(guān)生理指標(biāo)。每個株系選取9株進(jìn)行株高、根長、側(cè)根數(shù)和葉片數(shù)的測定。此外,每組不同處理的材料隨機(jī)挑選3株亞麻，剪取根部組織和地上組織,每個株系取3個重復(fù)。液氮速凍后于-80℃冰箱儲存。
1.5 測定與方法
脅迫處理2周后,使用蘇州科銘生物試劑盒測定超氧化歧化酶(Super oxide dismutase，SOD)活性、過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量以及抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)。。
1.6 超聲微波協(xié)同提取法引物合成及基因表達(dá)分析
根據(jù)本研究室公布的亞麻基因組序列(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，登錄號為QMEI02000000)CDS序列以及蛋白質(zhì)序列(https://doi.org/10.6084/m9.figshare.13614311.v3)，利用Primer5.0設(shè)計鑒定陽性植株的PCR引物和熒光定量引物。利用qRT-PCR方法檢測WRI1以及耐逆相關(guān)的4個關(guān)鍵基因LuAREB(L.us.o.m.scaffold233.70)、LuDREB(L.us.o.m.scaffold284.37)、LuLEA(L.us.o.m.scaffold47.25)、LuNCED(L.us.o.m.scaffold66.130)在對照和轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)模式[59]。以甘油醛-3-磷酸(GAPDH，Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase)為內(nèi)參基因。由上海生物化工公司合成所有引物(表1)。實(shí)時熒光定量PCR方法參照文獻(xiàn)[59]。
表1 PCR引物
1.7 數(shù)據(jù)分析
用Microsoft Excel 2010程序進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的整理，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計分析。利用GraphPad Prism8. 0軟件作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 LuWRI1a 啟動子順式作用元件分析
應(yīng)用PlantCARE軟件對基因啟動子區(qū)進(jìn)行分析(圖1)發(fā)現(xiàn)，pLuWRI1a含有豐富的順式作用元件，除了含有TATA-BOX、CAAT-box等核心功能響應(yīng)元件外，還包含多個其他類型的順式作用元件。根據(jù)功能注釋可分為與光響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件(ACE、AE-box、GT1-motif、Box4和Gap-box)，與激素響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件(TGACG-motif、CGTCA-motif和TCA-element)，與發(fā)育相關(guān)的元件(MBSI、O2-site)，以及與非生物脅迫響應(yīng)的相關(guān)元件(MBS、LTR、MYB、MYC和ARE)，結(jié)果見表2。因此推測，LuWRI1a可能參與鹽脅迫、干旱等非生物逆境脅迫響應(yīng)等表達(dá)調(diào)控途徑。
圖1 亞麻LuWRI1a啟動子順式作用元件
表2 LuWRI1a 啟動子順式作用元件的推測功能
2.2 LuWRI1a轉(zhuǎn)基因亞麻的獲得和分子鑒定
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將過表達(dá)載體P101--BASTA-LuWRI1a轉(zhuǎn)化亞麻栽培品種隴亞10號的下胚軸，獲得轉(zhuǎn)化苗(圖2)，使用載體上的bar基因特異引物對轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行PCR鑒定(圖3-A)，獲得7個轉(zhuǎn)基因株系。根據(jù)qRT-PCR的檢測結(jié)果，選擇表達(dá)量較高的3個不同的轉(zhuǎn)基因株系OE-2、OE-20和OE-22進(jìn)行下一步試驗(yàn)(圖3-B)。
圖2 轉(zhuǎn)基因亞麻的獲得
圖3 轉(zhuǎn)基因亞麻的分子鑒定
2.3 轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性分析
為進(jìn)一步研究LuWRI1a的耐旱性和耐鹽性，分別用25%的PEG-6000和200mmolL-1的NaCl對野生型亞麻(隴亞10號)和轉(zhuǎn)基因亞麻進(jìn)行2周脅迫處理。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系的株高、主根長、側(cè)根數(shù)和葉片數(shù)在正常培養(yǎng)條件下與野生型相比均無明顯差異。在200mmolL-1NaCl脅迫下，野生型亞麻株高較低，葉片發(fā)黃，嚴(yán)重干枯，萎蔫程度較轉(zhuǎn)基因株系嚴(yán)重，這表明過表達(dá)LuWRI1a基因亞麻的耐鹽能力比野生型亞麻更強(qiáng)。PEG-6000脅迫處理后，野生型植株和轉(zhuǎn)基因株系均未出現(xiàn)萎蔫，轉(zhuǎn)基因株系葉片部分失綠，表型無明顯差異(圖4)。
圖4 脅迫處理后野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株的表型
轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫處理后，相對株高、側(cè)根數(shù)及葉片數(shù)與野生型相比差異極顯著；在干旱脅迫處理后，各指標(biāo)與野生型相比差異不顯著。表明過表達(dá)LuWRI1a的轉(zhuǎn)基因株系對鹽脅迫的耐受性更高(圖5)。鹽脅迫處理2周后，野生型植株的生長受到了抑制，側(cè)根數(shù)目明顯減少，轉(zhuǎn)基因植株的平均側(cè)根數(shù)相比對照分別提高36.36%、30.91%和23.63%。平均根長分別提高9.46%、15.44%和8.63%，平均葉片數(shù)分別提高18.07%、31.73%和9.64%；干旱脅迫處理2周后，轉(zhuǎn)基因植株與對照相比無顯著差異，平均主根長分別提高3.08%、5.17%和負(fù)0.23%，平均側(cè)根數(shù)分別提高25.9%、22.29%和22.89%，平均葉片數(shù)分別提高5.5%、6.88%和4.59%。
圖5 鹽脅迫和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株性狀分析
2.4 非生物脅迫對轉(zhuǎn)基因植株抗氧化物質(zhì)酶活性和MDA含量的影響
超氧化歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性以及丙二醛(MDA)的含量是植物在耐逆條件下的重要生理指標(biāo)。正常培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性比野生型植株的低，APX 活性比野生型植株的高，CAT 活性和 MDA 含量并無明顯差異。鹽脅迫和干旱脅迫后，3 種抗氧化酶的活性與對照相比極顯著升高，而 MDA 含量極顯著降低。
鹽脅迫處理后，野生型亞麻的SOD活性為112.36Ug-1，轉(zhuǎn)基因亞麻的SOD酶活性分別為133.02、137.21和122.25Ug-1，比野生型提高0.18%、0.22%和0.09%(圖6-A)；野生型亞麻的CAT酶活性為37.85Ug-1，轉(zhuǎn)基因亞麻的CAT酶活性分別為45.19、52.62和42.63Ug-1，比野生型提高0.19%、0.39%和0.13%(圖6-B)；野生型亞麻的APX酶活性為29.24Ug-1，轉(zhuǎn)基因亞麻的APX酶活性分別為41.19、42.13和40.41Ug-1，比野生型提高0.41%、0.44%和0.38%(圖6-C)；野生型亞麻的MDA含量為63.75nmol g-1，轉(zhuǎn)基因亞麻的MDA含量分別為30.11、22.22和33.93nmol g-1，比野生型亞麻降低0.53%、0.65%和0.47%(圖6-D)。
干旱脅迫處理后，野生型亞麻的SOD活性為106.27Ug-1，轉(zhuǎn)基因亞麻的SOD酶活性分別為136.73、149.00和129.02Ug-1，比野生型提高0.28%、0.40%和0.21%(圖6-A)；野生型亞麻的CAT酶活性為34.63Ug-1，轉(zhuǎn)基因亞麻的CAT酶活性分別為40.18、38.11和43.63Ug-1，比野生型提高0.16%、0.10%和0.26%(圖6-B)；野生型亞麻的APX酶活性為32.74Ug-1，轉(zhuǎn)基因亞麻的APX酶活性分別為41.06、41.61和39.06Ug-1，比野生型提高0.25%、0.27%和0.19%(圖6-C)；野生型亞麻的MDA含量為76.95nmol g-1，轉(zhuǎn)基因亞麻的MDA含量分別為60.27、42.08和57.94nmol g-1，比野生型亞麻降低0.22%、0.45%和0.25%(圖6-D)。
圖6 過表達(dá)LuWRI1a亞麻的酶活性測定
2.5 逆境脅迫響應(yīng)基因在轉(zhuǎn)基因亞麻中的表達(dá)分析
為研究 LuWRI1a 在逆境脅迫響應(yīng)中可能的分子機(jī)制，本研究分析了非生物脅迫響應(yīng)途徑中的 4 個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，AREB2( ABA-responsive element binding)、DREB2(dehydration-responsive element binding)、LEA(late embryogenesis-abundant protein)和NCED(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase)在野生型亞麻和轉(zhuǎn)基因亞麻中的表達(dá)水平[60]。通過實(shí)時熒光定量(qRT-PCR)分析表明，在鹽脅迫和干旱脅迫的處理下，這 4 個逆境脅迫相關(guān)基因均上調(diào)表達(dá)(圖 7)。LuAREB2 在正常和逆境脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量與野生型相比差異極顯著(圖 7-A)。LuDREB2 在正常條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量沒有明顯差異，在干旱脅迫處理后較對照顯著上調(diào)，而在鹽脅迫處理后極顯著上調(diào)(圖 7-B)。LuLEA 在正常培養(yǎng)和鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量均極顯著高于野生型，但在干旱脅迫處理后，株系間差異不顯著(圖 7-C)。正常條件下和干旱脅迫處理后，LuNCED 較對照無明顯差異，在鹽脅迫處理后，基因的表達(dá)量升高，但株系間差異不顯著(圖 7-D)。表明，在逆境脅迫下，尤其在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株中 LuWRI1a 通過上調(diào) LuAREB、LuDREB、LuLEA 和 LuNCED 等逆境脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，來參與調(diào)控亞麻轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性。
圖7 脅迫處理下轉(zhuǎn)基因亞麻逆境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)分析
3 討論
干旱、高鹽、極端天氣、洪水和病蟲害等各種生物和非生物脅迫對植物的生長和發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。目前，非生物脅迫已被認(rèn)為是造成全世界作物損失的主要因素之一，并導(dǎo)致大多數(shù)主要農(nóng)作物產(chǎn)量下降高達(dá)50%[61]。在非生物脅迫下，植物中的轉(zhuǎn)錄因子與脅迫應(yīng)答基因啟動子的順式作用元件結(jié)合，通過在轉(zhuǎn)錄水平上激活或抑制應(yīng)答基因，調(diào)節(jié)逆境脅迫給植物帶來的損傷[5,17]。近年來，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族備受關(guān)注。研究表明，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控植物發(fā)育和脅迫響應(yīng)的多種過程，如生殖發(fā)育、細(xì)胞增殖、非生物和生物脅迫響應(yīng)以及植物激素響應(yīng)。因此，闡明AP2/ERF在脅迫信號中的調(diào)控機(jī)制非常重要，可以通過調(diào)控AP2/ERF來提高作物的抗逆性。
WRI1屬于AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子，前期WRI1的研究大多集中在種子含油量方面。例如，在擬南芥中過表達(dá)AtWRI1，種子含油量增加大約10%~20%[62]。在玉米中過表達(dá)ZmWRI1，種子含油量提高了大約31%[63]，在擬南芥和油菜中過表達(dá)BnWRI1，種子含油量分別增加了約20%和10%[64]。近年來，有一些研究表明WRI還有可能參與植物非生物脅迫信號途徑。大豆GmWRI1a(Glycinemax)啟動子存在乙烯、茉莉酸、赤霉素3種激素響應(yīng)元件，受這3種激素脅迫誘導(dǎo)[65-66]，并受ABA、NaCl和糖信號等調(diào)控[67]?；ㄉ?/font>AhWRI1-1基因?qū)?/font>3種非生物脅迫均有響應(yīng)。低溫脅迫下表達(dá)量明顯上調(diào)，在干旱脅迫下明顯下調(diào)。AhWRI1-2基因在高鹽、低溫、干旱非生物脅迫下表達(dá)量均有上調(diào)。AhWRI1-1和AhWRI1-2這2個基因可能參與了花生對高鹽、低溫、干旱的抗性調(diào)節(jié)[68]。
生長指標(biāo)方面，鹽脅迫后野生型亞麻萎蔫程度較轉(zhuǎn)基因株系嚴(yán)重，干旱脅迫后表型差異不明顯；轉(zhuǎn)基因植株的相對株高、主根長度、側(cè)根數(shù)目及葉片數(shù)在鹽脅迫和干旱脅迫處理后均升高，尤其在鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因植株各指標(biāo)均明顯高于對照，表明過表達(dá)LuWRI1a的轉(zhuǎn)基因株系對鹽脅迫的耐受性更高。這個結(jié)果說明生長抑制是亞麻對鹽脅迫和干旱脅迫的主要反應(yīng)之一，LuWRI1a能抵抗鹽脅迫和干旱脅迫對亞麻生長的抑制。
活性氧(reactive oxygen species，ROS)是指在生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的、含氧自由基和易形成自由基的過氧化物的總稱。當(dāng)植物在逆境脅迫時，會誘導(dǎo)植物細(xì)胞中活性氧的積累，ROS的過度積累導(dǎo)致會導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[69]，從而進(jìn)一步產(chǎn)生有毒物質(zhì)[70]?；钚匝跚宄赶到y(tǒng)是清除過量的活性氧物質(zhì)，維持植物體內(nèi)動態(tài)平衡最有效的機(jī)制[71]，一般包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)，植物通過這些酶類抗氧化劑維持細(xì)胞的正常發(fā)育。通過測定抗氧化物質(zhì)酶活性，發(fā)現(xiàn)脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系的3種抗氧化酶APX、SOD和CAT的活性比野生型均顯著性升高。丙二醛(MDA)能加劇膜脂損傷，它的含量代表膜脂過氧化的程度[72]。鹽脅迫和干旱脅迫處理后，野生型株系的MDA含量均比處理前升高，而轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量均顯著低于野生型。這些結(jié)果表明過表達(dá)LuWRI1a能夠增強(qiáng)在鹽脅迫和干旱脅迫下亞麻的抗氧化能力，通過減輕對細(xì)胞膜造成的氧化損傷，增強(qiáng)耐逆性。
實(shí)時熒光定量(qRT-PCR)分析表明，在鹽脅迫和干旱脅迫的處理下，4個逆境脅迫相關(guān)基因LuAREB2、LuDREB2、LuLEA和LuNCED均上調(diào)表達(dá)，說明LuWRI1a可能是通過激活LuAREB2、LuDREB2、LuLEA和LuNCED等逆境脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性。
本研究結(jié)果表明，亞麻轉(zhuǎn)錄因子LuWRI1a啟動子區(qū)含有多個參與非生物脅迫應(yīng)答的響應(yīng)元件。進(jìn)一步挖掘LuWRI1a在逆境脅迫下的的功能，發(fā)現(xiàn)LuWRI1a通過抵抗鹽脅迫和干旱脅迫對亞麻生長的抑制，增強(qiáng)活性氧清除能力、減輕膜脂的氧化損傷，激活逆境脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)等途徑，增強(qiáng)了亞麻的耐逆性。
4 結(jié)論
綜上所述，LuWRI1a可能是一個多功能基因，它不僅參與脂肪酸合成代謝途徑，還有可能參與植物非生物脅迫信號途徑。本研究為亞麻耐逆品種改良提供了新的基因資源，為培育亞麻耐逆新品系提供理論依據(jù)。
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