摘 要:以工業(yè)大麻花葉為原料，采用超聲波輔助橄欖油提取大麻二酚(CBD)，利用中心組合(CCD)方法對(duì)提取工藝的4種因素進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取條件為:超聲波功率95W、提取溫度62℃、提取時(shí)間45min、料液比1:9(g/mL)，該條件下CBD濃度為39.01μg/mL，提取率達(dá)到91.35%，此結(jié)果為CBD的多元化開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞:工業(yè)大麻；大麻二酚；橄欖油；響應(yīng)面法
引言
大麻素是含有C21結(jié)構(gòu)的萜酚類(lèi)化合物，是工業(yè)大麻的主要活性成分，能夠與人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)CB1和CB2受體結(jié)合，具有抗癲癇、抗炎、抗焦慮、抗氧化和神經(jīng)調(diào)節(jié)等作用［1］。2020年7月，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了大麻二酚(CBD)藥物Epidiolex，用于治療兒童結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物(TSC)相關(guān)的癲癇疾病，故CBD成為大麻素成分的研究熱點(diǎn)。工業(yè)大麻中四氫大麻酚酸(THCA)和四氫大麻酚(THC)含量非常低［2］，由工業(yè)大麻花葉提取制備的產(chǎn)品不含或含有極低的THC但富含CBD。CBD有益作用在制藥、化妝品、營(yíng)養(yǎng)和食品工業(yè)領(lǐng)域獲得了極大的關(guān)注，使其成為天然添加劑的重要來(lái)源［3］。
橄欖油是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的天然食用油，含有多種不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)，利用CBD的親脂性使橄欖油中富含CBD成分有助于其整體有益作用的提升［4－5］。目前，橄欖油提取CBD工藝還沒(méi)有達(dá)到最優(yōu)化，通常利用加熱浸漬回流方法提取，具有時(shí)間長(zhǎng)、效率低和操作復(fù)雜的缺點(diǎn)［6－7］，而長(zhǎng)時(shí)間高溫條件下可造成橄欖油揮發(fā)性有益成分損失。超聲波輔助提取是一種低成本且快速的提取技術(shù)，是改善浸漬提取工藝的最佳選擇［8］。本研究通過(guò)中心組合(CCD)方法闡明4種提取因素的顯著性，建立最佳提取條件并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
1材料和方法
1.1材料與試劑
收獲工業(yè)大麻頂端30cm花葉，水洗除雜后在110℃條件下脫羧1h，使CBDA脫羧轉(zhuǎn)化成CBD。脫羧原料粉碎后過(guò)60目樣品篩，低溫保存待用。實(shí)驗(yàn)樣本為5～20g，取自5kg的實(shí)驗(yàn)室樣本材料。為了確定所使用的樣本是原始實(shí)驗(yàn)樣本的真實(shí)等分，隨機(jī)選擇10個(gè)假定等分樣本進(jìn)行含量測(cè)試，CBD含量為3.3%，THC含量小于0.2%(符合法律要求)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)＜10%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣本是真正的等分，測(cè)試的CBD和THC含量是可靠的基礎(chǔ)數(shù)值。橄欖油(食品級(jí))購(gòu)買(mǎi)于超市。甲醇、乙腈和甲酸均為色譜級(jí)，百靈威科技有限公司生產(chǎn);CBD、CBDA、THCA和THC標(biāo)準(zhǔn)溶液均為1mg/mL，Cerilliant試劑公司生產(chǎn);其他試劑為常規(guī)市售化學(xué)試劑。
1.2主要儀器與設(shè)備
液相色譜儀(LC－15C)(島津儀器(蘇州)有限公司生產(chǎn))，萬(wàn)分之一天平(PB203-N)(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn))，超聲振蕩器(KQ3200DE)(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn))，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Allegra64R)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司生產(chǎn))，立式鼓風(fēng)烘箱(DHG-9035AE)(上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn))，全自動(dòng)柱膜通用固相萃取儀(SepathsUP)(萊伯泰科儀器股份有限公司生產(chǎn))。
1.3提取方法
1.3.1超聲波輔助提取CBD方法
橄欖油體積120mL、提取時(shí)間15～75min、提取溫度35℃~75℃,樣品質(zhì)量5～20g，超聲波功率30~150W，超聲波頻率40kHz。
1.3.2常規(guī)浸漬回流提取CBD方法
稱(chēng)取5g樣品放置于250mL三口圓底燒瓶中，連接回流冷凝器，加入120mL橄欖油，攪拌作用下使樣品完全分散浸濕。100℃條件下加熱120min，從t0(到達(dá)100℃的時(shí)間)開(kāi)始，間隔15min取樣100μL用于液相色譜分析。
1.3.3CBD含量分析方法
稱(chēng)取0.1g提取后橄欖油，用5mL色譜級(jí)甲醇充分渦旋混合后超聲震蕩30min離心分離，合并3次提取液定容至25mL，移取2mL溶液過(guò)0.22μm濾膜，在－18℃條件下保存待測(cè)。高壓液相色譜(HPLC)色譜條件:InertsoilODS-3色譜柱150×4.6mm，3μm，等度洗脫。流動(dòng)相:乙腈/水=75∶25(V∶V)。流動(dòng)相中，甲酸含量0.1%，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，柱溫30℃,進(jìn)樣量10μL，流速0.7mL/min。定量計(jì)算方法:外標(biāo)法，在0.06～100μg制備外標(biāo)曲線(xiàn)。CBD標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=54070x－25417(R2=0.9998)。每個(gè)樣品測(cè)試3次，RSD＜10%。定量計(jì)算如表1所示，對(duì)同一天內(nèi)的提取樣品完成含量測(cè)試。
表1 CBD定量計(jì)算依據(jù)
1.3.4CBD提取率計(jì)算
提取率為含量百分比(%)，計(jì)算方法如式(1)所示。
提取率(%)
1.3.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
根據(jù)中心組合(CCD)方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以功率(X1)、溫度(X2)、液料比(X3)和時(shí)間(X4)為自變量，以響應(yīng)變量(Y)CBD濃度(μg/mL)為目標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。模型參數(shù)根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)定，如表2所示。模型建立和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)均使用Design-Expert13處理，設(shè)計(jì)30組試驗(yàn)。
表2 CBD提取因素自變量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
注:α=2。
通過(guò)響應(yīng)面法得到的二階多項(xiàng)式模型方程對(duì)響應(yīng)變量進(jìn)行擬合，如式(2)所示。
其中，Y為CBD含量的響應(yīng)變量，Xi、Xj為獨(dú)立因子，β0、βi、βij為模型的回歸系數(shù)。
1.3.6模型驗(yàn)證
通過(guò)計(jì)算最優(yōu)超聲波輔助提取條件的相對(duì)誤差對(duì)提取模型進(jìn)行驗(yàn)證，相對(duì)誤差計(jì)算如式(3)所示。
1.3.7統(tǒng)計(jì)分析與評(píng)價(jià)
采用Design-Expert13軟件進(jìn)行優(yōu)化和統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)評(píng)估回歸方程中統(tǒng)計(jì)項(xiàng)的顯著性。采用SPSS27.0的多重比較檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估實(shí)驗(yàn)平均值之間的顯著性差異，P值＜0.05和＜0.001被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和高度顯著性。
2結(jié)果與分析
2.1模型擬合
采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最大限度地提高橄欖油中的CBD濃度，實(shí)際試驗(yàn)進(jìn)行3d，數(shù)據(jù)結(jié)果沒(méi)有差異。自變量功率、溫度、時(shí)間和液料比對(duì)響應(yīng)變量影響分析如表3所示。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算多項(xiàng)式方程系數(shù)，用于預(yù)測(cè)CBD濃度，響應(yīng)變量的回歸方程為:CBD=34.15+2.55X1+2.58X2-6.85X3+0.8783X4+0.04X1X2+1.87X3X4-5.26X12-0.7137X22-3.64X32-3.75X42。此外，所有測(cè)試數(shù)據(jù)具有較低的RSD(＜4%)，平均值變化較低且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與預(yù)測(cè)值接近，表明模型可以有效地用于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
表3 實(shí)驗(yàn)獲得的橄欖油中CBD濃度
方差分析結(jié)果如表4所示，CBD的測(cè)定系數(shù)(R2)和調(diào)整測(cè)定系數(shù)(Radj)分別為0.9821和0.9654，R2和Radj值接近且≈1，表明模型很好地?cái)M合了實(shí)驗(yàn)值［9］。
此外，失擬誤差P值也是不顯著的。結(jié)果表明，二階多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型能很好地反映CBD的提取濃度，該擬合模型具有良好的實(shí)用性。F值分析比較可知，影響萃取率大小的因素依次為:X3＞X2＞X1＞X4。通過(guò)P值分析可知，X1、X2、X3、X1X3、X3X4、X12、X32、X42對(duì)CBD濃度有極顯著影響(P＜0.0001)。
2.2響應(yīng)面分析
根據(jù)影響因素交互顯著性分析繪制了功率vs料液比和料液比vs時(shí)間響應(yīng)面和二維等高線(xiàn)圖。生物活性成分在溶劑中溶解是一個(gè)物理過(guò)程，無(wú)論哪種提取方法都是基于增加目標(biāo)化合物與溶劑接觸，從而提高目標(biāo)化合物的提取率。超聲輔助提取是基于空化效應(yīng)提高溶劑滲入植物組織或溶質(zhì)擴(kuò)散到提取介質(zhì)的能力［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在60～120W，CBD濃度隨著超聲波功率增加而提高，對(duì)提高CBD濃度是顯著的，如圖1所示。提高功率可使更多溶劑滲透到細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)生物活性成分接觸，有利于獲取更多的生物活性成分。溶質(zhì)和溶劑之間濃度差也是影響提取效率的重要因素，高濃度差通過(guò)增加植物組織和溶劑主體之間濃度梯度促進(jìn)提取效率提高，這也是傳質(zhì)過(guò)程中的驅(qū)動(dòng)力，高濃度差可以得到更高的提取率和濃度。如圖2所示，隨著料液比增加，高濃度差促進(jìn)提取效率的提高。當(dāng)液料比大于9.0時(shí)，CBD濃度呈下降趨勢(shì)，由于提取體系中溶劑流動(dòng)性的提高，表面結(jié)合作用影響顯著增加。
表4 超聲波輔助提取條件回歸模型方程對(duì)CBD含量方差分析
注:P＜0.05用*表示，P＜0.01用＊＊表示，P＜0.0001用＊＊＊表示。
圖1 功率X1和液料比X3對(duì)CBD濃度的影響
圖2液料比X3和提取時(shí)間X4對(duì)CBD提取濃度的影響
2.3提取條件驗(yàn)證
確定的最優(yōu)提取條件為超聲波功率95W、溫度62℃、提取時(shí)間45min、液料比1∶9。驗(yàn)證提取條件，在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=6)，實(shí)驗(yàn)平均值為39.01±3.15μg/mL，預(yù)測(cè)值為39.13μg/mL，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間差異較小，證明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂辛己玫念A(yù)測(cè)性能，優(yōu)化提取工藝可應(yīng)用于更大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中。
2.4與常規(guī)方法比較
將最優(yōu)超聲波輔助提取條件與常規(guī)浸漬提取進(jìn)行比較。如表5所示，超聲波輔助提取方法顯著提高了CBD的提取效率。
表5 與常規(guī)提取方法比較
3結(jié)論
以橄欖油為提取溶劑，通過(guò)響應(yīng)面方法考察了超聲波輔助提取4種因素對(duì)CBD提取效率的影響。與常規(guī)浸漬回流提取方法相比，超聲波輔助方法顯著提高了CBD的提取效率。響應(yīng)面優(yōu)化提取模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值具有一致性，表明提取模型具有良好的實(shí)用性，可以用來(lái)預(yù)測(cè)設(shè)定試驗(yàn)因素條件下橄欖油提取CBD工藝參數(shù)的響應(yīng)值，該研究結(jié)果可為橄欖油提取CBD工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
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文章摘自：高寶昌,石雨,田媛,等.超聲波輔助橄欖油提取大麻二酚工藝研究[J].黑龍江科學(xué),2024,15(08):6-9+13.
