摘 要：研究發(fā)現(xiàn)含有半胱氨酸殘基即巰基的植物蛋白肽具有鉛離子螯合能力，可以降低鉛中毒人群體內(nèi)鉛的濃度，緩解中毒癥狀，減輕鉛損傷。本研究以脫脂亞麻籽餅為原料，從中提取亞麻籽蛋白并進(jìn)行酶解，優(yōu)化酶解工藝得到高巰基含量的酶解物，采用共價(jià)色譜法對(duì)亞麻籽蛋白酶解物中半胱氨酸肽進(jìn)行富集，并鑒定其結(jié)構(gòu)，最后通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)探究其與鉛離子的螯合機(jī)制，旨在獲得具有鉛離子螯合作用的半胱氨酸肽。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用proteaseM酶，在酶解溫度50℃、酶解pH3.5、酶添加量900U/g、酶解時(shí)間4h條件下，得到巰基含量為13.37μmol/g的亞麻籽蛋白酶解肽，鉛離子螯合量為11.40mg/g；通過(guò)共價(jià)色譜法對(duì)其進(jìn)行富集得到巰基含量為44.8μmol/g、鉛離子螯合量為24.98mg/g的亞麻籽蛋白源半胱氨酸肽，比亞麻籽蛋白提高了6.74倍和3.92倍；對(duì)亞麻籽蛋白源半胱氨酸肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到3種含有半胱氨酸的肽段，分別為WAIINLQHSGEGLCGRVV、CTGLLEAVAAALMMNIYIVGLNQLTDIE、QGGQGQQQQCEKQIQEQDYLRSCQQFLWEKVQKGGRS，且3種肽段都可以與鉛離子穩(wěn)定螯合，其中半胱氨酸中的巰基在螯合過(guò)程中起重要作用。以上結(jié)果表明，對(duì)亞麻籽蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化并富集，可以得到高巰基含量且能與鉛離子螯合的半胱氨酸肽，提高亞麻籽榨油后副產(chǎn)物的利用率，并為亞麻籽蛋白源半胱氨酸肽緩解鉛中毒的研究提供理論依據(jù)。
關(guān)鍵詞：亞麻籽蛋白；半胱氨酸肽；正交試驗(yàn)；制備；結(jié)構(gòu)鑒定
隨著工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展，有關(guān)鉛污染問(wèn)題已嚴(yán)重威脅公眾的健康。鉛（Pb）是人類最早使用的重金屬之一，在環(huán)境中的長(zhǎng)期積累使得其造成了廣泛的環(huán)境污染。鉛可以通過(guò)消化道、呼吸道及皮膚進(jìn)入人體，通過(guò)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致腎、肝、心臟、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，如酶活性耗竭，以及對(duì)人體脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)和DNA的損傷[1,2]。現(xiàn)今治療鉛中毒主要依賴螯合療法，然而美國(guó)國(guó)立研究院研究顯示，傳統(tǒng)的螯合劑普遍存在許多副作用和缺點(diǎn)，如血液鈣水平異常降低和腎臟損害等[3]。因此，開(kāi)發(fā)有效且安全的天然化合物用于防止鉛在人體中過(guò)度積累具有重要意義。
亞麻籽是內(nèi)蒙古地區(qū)的重要優(yōu)勢(shì)資源，富含α-亞麻酸（ALA）、亞麻籽膠、亞麻籽蛋白和木脂素等生物活性物質(zhì)[4]。將亞麻籽制取油脂后可以得到具有高蛋白含量的亞麻籽餅[5]。研究證實(shí)，亞麻籽蛋白氨基酸組成較為均衡，且具有抗氧化、降血糖、降膽固醇、抗高血壓、抗癌和免疫抑制等多種生理活性，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源[6-8]。但目前我國(guó)食品工業(yè)生產(chǎn)中的亞麻籽餅絕大多數(shù)被用作動(dòng)物飼料，這導(dǎo)致大量?jī)?yōu)質(zhì)植物蛋白資源的流失[9]。2020年被稱做植物基食品的元年，植物蛋白的深加工應(yīng)用在世界范圍內(nèi)備受關(guān)注，因此充分利用內(nèi)蒙古特色資源亞麻籽蛋白，對(duì)其進(jìn)行深度加工尤為重要。
研究表明，含有豐富半胱氨酸殘基的多肽與重金屬鉛離子具有較高的親和力，可以緩解重金屬中毒，減輕機(jī)體損傷[10]。孫媛[11]研究發(fā)現(xiàn)從小麥面筋蛋白中分離出含半胱氨酸肽（HCPs）可以與鉛離子結(jié)合，形成穩(wěn)定結(jié)合物，并且在體外模擬消化實(shí)驗(yàn)中以高結(jié)合率與鉛離子在胃腸道中進(jìn)行結(jié)合以發(fā)揮其解毒作用。Ding等[12]研究發(fā)現(xiàn)，大米蛋白水解物中的巰基肽（TCPs）與Hg2+、Cd2+和Pb2+均可發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，其中TCPs與Pb2+的親和力明顯大于Hg2+和Cd2+。阮瓊珠等[13]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白富含巰基，可通過(guò)結(jié)合鉛離子阻止其對(duì)機(jī)體造成傷害，降低血液與骨頭中鉛含量，同時(shí)可以改善小鼠的營(yíng)養(yǎng)狀況，增強(qiáng)鉛中毒小鼠的免疫力。除此之外還有谷胱甘肽（GSH）、金屬硫蛋白（MTs）和植物螯合素（PCs），這些金屬螯合肽與鉛離子結(jié)合的主要機(jī)制也是與半胱氨酸殘基進(jìn)行配位[14]。亞麻籽蛋白中含有較多半胱氨酸，本實(shí)驗(yàn)室前期使用木瓜蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，得到了巰基含量較高的亞麻籽蛋白酶解肽，但有研究表明，環(huán)境中的巰基極易被氧化形成二硫鍵從而失去活性，這種氧化反應(yīng)在堿性環(huán)境中更易發(fā)生，在酸性條件下巰基更為穩(wěn)定[15]。ProteaseM酶是一種酸性蛋白酶，可以在酸性環(huán)境下對(duì)亞麻籽蛋白進(jìn)行酶解，然而其對(duì)酶解產(chǎn)物中巰基含量的影響尚未可知。因此本文以脫脂亞麻籽餅為原料提取蛋白，通過(guò)單因素正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得巰基含量較高的亞麻籽蛋白酶解肽，進(jìn)一步通過(guò)ThiopropylCrystarose6FastFlow共價(jià)色譜法從中富集亞麻籽蛋白源半胱氨酸肽，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)一步采用分子對(duì)接技術(shù)，探究其與鉛離子的螯合作用，為亞麻籽蛋白的深加工利用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1原料與試劑
低溫脫脂亞麻籽餅（產(chǎn)自內(nèi)蒙古自治區(qū)）、ProteaseM酶（46800U/g，最適pH3.0~3.5，最適溫度50～55℃,購(gòu)自日本天野酶制劑株式會(huì)社）、ThiopropylCrystarose6FastFlow凝膠（購(gòu)自武漢晶誠(chéng)生物科技股份公司）；二硫蘇糖醇（DTT）（購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）（購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司）、EDTA（購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠）、甘氨酸（購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司）、正己烷、氫氧化鈉、鹽酸等為分析純（均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。
1.2儀器與設(shè)備
UV-2300紫外線分光光度儀，YC-2超低溫層析柜，HD-3紫外檢測(cè)儀，HL-2B恒流泵，TAS-990型原子吸收光譜儀，F(xiàn)DU-2200型真空濃縮冷凍干燥機(jī)，Ultimate3000納升液相色譜，Qexactive質(zhì)譜儀，Kromasil100-5C18高效液相色譜。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1深度脫脂亞麻籽餅粉的制備
將亞麻籽粕去雜破碎過(guò)80目篩，稱取樣品置于燒杯中，以1:3（g/mL）的料液比加入正己烷，置于25℃水浴鍋中，180r/min反應(yīng)120min，反應(yīng)結(jié)束后4000r/min離心15min取沉淀。重復(fù)以上操作兩次，將沉淀取出晾干備用。
1.3.2亞麻籽分離蛋白的制備
將深度脫脂亞麻籽餅粉以1:20（g/mL）的比例加入蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，調(diào)節(jié)pH至8.5，在50℃水浴鍋中以200r/min勻速攪拌2h，4000r/min離心15min取上清液，調(diào)節(jié)上清液pH至4.2，再以4000r/min離心15min取沉淀，以1:20（g/mL）的比例加入蒸餾水，攪拌分散，再以4000r/min離心15min，反復(fù)操作兩次洗滌沉淀，將最終沉淀加入適量蒸餾水調(diào)節(jié)pH至7.0，冷凍干燥備用。
1.3.3亞麻籽蛋白酶解物的制備及蛋白質(zhì)回收率計(jì)算
取亞麻籽蛋白以1:50（g/mL）的比例加入超純水?dāng)嚢杈鶆?，調(diào)節(jié)溶液pH值，添加proteaseM酶在恒溫水浴鍋中以固定的溫度開(kāi)始酶解。酶解完成后，在85℃以上水浴滅酶15min，然后將其降溫到室溫，4000r/min離心20min，最后將其上清液收集，冰凍干燥備用。采用凱氏定氮法測(cè)定其蛋白含量，蛋白質(zhì)回收率=上清液中總蛋白質(zhì)含量/底物蛋白質(zhì)含量×100%。
1.3.4單因素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)
以巰基含量為標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)酶解溫度（45、50、55、60、65℃)、pH（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）、酶解時(shí)間（3、4、5、6、7h）、酶添加量（400、900、1400、1900、2300U/g）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定各因素的最適值。以單因素實(shí)驗(yàn)為依據(jù)展開(kāi)正交試驗(yàn)，進(jìn)行對(duì)酶解工藝的優(yōu)化。
1.3.5共價(jià)色譜法富集亞麻籽蛋白源半胱氨酸肽
取1.3.4中最佳工藝條件下制得的亞麻籽蛋白酶解肽0.1g，加入50mL超純水?dāng)嚢杈鶆?，?.45μm濾膜對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾，制備上樣樣品。將凝膠用超純水溶脹，用5～10個(gè)床體積的去離子水洗滌干凈，并將其轉(zhuǎn)移到色譜柱中，利用UV檢測(cè)儀檢測(cè)流出液在280nm處的吸光值。用0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.5）調(diào)節(jié)色譜柱環(huán)境，將過(guò)濾的樣品進(jìn)行上樣，上樣速度為5mL/min，上樣結(jié)束后用上述Tris-HCl緩沖液進(jìn)行清洗，直到流出液的吸光值低于0.1為止，使用20mmol/LDTT對(duì)其進(jìn)行洗脫，吸光值發(fā)生改變開(kāi)始收集洗脫液，收集的洗脫液使用1000u超濾管4000r/min離心20min，收集超濾液冷凍干燥。
1.3.6巰基含量測(cè)定
參照Ellman’s試劑法[16]，稱取15mg樣品，用5mLTris-Gly緩沖液（每1L溶液中含有10.4gTris，6.9g甘氨酸，1.2gEDTA，pH8.0）溶解，加入0.1mLEllman’s試劑（0.2g2-硝基苯甲酸溶于50mLTris-Gly緩沖液），快速攪拌，在室溫避光處反應(yīng)1h，將反應(yīng)后的試樣以4000r/min離心10min，得到上清。在412nm（用無(wú)蛋白質(zhì)樣品的Tris-Gly緩沖劑作為對(duì)照）下測(cè)量上清液的吸光值。巰基含量計(jì)算公式：
式中：A412為樣品在412nm處的最大吸光值；D為稀釋系數(shù)；C為樣品質(zhì)量濃度（mg/mL）。
1.3.7鉛離子螯合量測(cè)定
根據(jù)馮偉等[17]的方法，將100mg樣品溶于10mL超純水，磁力攪拌器攪拌1h使樣品完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.5，加入鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入超純水將溶液體積補(bǔ)充到20mL，使得溶液Pb2+的最終質(zhì)量濃度為6mg/mL。調(diào)節(jié)水浴鍋溫度為37℃,以150r/min均速攪拌2h，反應(yīng)結(jié)束后10000r/min離心3min，將上清液采用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定Pb2+質(zhì)量濃度。Pb2+螯合量（Qe）可參照下方公式計(jì)算。
式中：Qe為Pb2+螯合量/mg/g；C0為初始溶液中Pb2+的質(zhì)量濃度/mg/L；C1為反應(yīng)后溶液中Pb2+質(zhì)量濃度/mg/L；m為亞麻籽蛋白質(zhì)量/g；V為最終溶液體積/L。
1.3.8氨基酸序列測(cè)定
采用MALDI-TOF-MS/MS進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定，色譜柱為C18（3μm，100A）及AcclaimPePmap100（75μm×2cm），流動(dòng)相：A相（0.1g/100mLFA水溶液）、B相（0.1g/100mLFA乙腈溶液）。將樣品用體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶解，過(guò)柱進(jìn)行純化處理，將純化后的樣品使用含有體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸超純水溶解，使用體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶解體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸和5mg/mLα-氰基-4-羥基肉桂酸，將其作為基質(zhì)溶液與樣品溶合（按照1:1比例）。取1μL上述混合溶液，將其分別點(diǎn)在Scorce384靶上，常溫下風(fēng)干進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)樣品的一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行350～2000u掃描，分辨率70000，得到MALDI-MS圖，從圖中選擇出待測(cè)離子進(jìn)行二級(jí)掃描，掃描范圍依賴于一級(jí)母離子質(zhì)荷比自動(dòng)選擇，NCEs為28%，分辨率17500，溫度360℃,離子源電壓1800V，以HCD碎裂模式進(jìn)行分析，得到MALDI-MS/MS圖譜，分析得到樣品一級(jí)結(jié)構(gòu)。
1.3.9分子對(duì)接
利用Modeller進(jìn)行結(jié)構(gòu)的模建。使用鑒定出的半胱氨酸肽序列通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)搜索模板蛋白，運(yùn)行腳本進(jìn)行序列對(duì)比，而后進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，通過(guò)Prochek得出的拉式圖對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估，完成模型的構(gòu)建，隨后利用AutoDockVina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，將鉛離子對(duì)接到建立好的模型中，使用Pymol軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)可視化查看及結(jié)構(gòu)分析。
1.3.10數(shù)據(jù)處理
所有實(shí)驗(yàn)做3次平行，使用Origin2021處理圖片，用SPSS17.0處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行顯著性分析。
2結(jié)果與分析
2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果分析
2.1.1酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物中巰基含量的影響
固定酶解pH為3.0、酶添加量900U/g和酶解時(shí)間5h，通過(guò)改變酶解溫度，研究酶解產(chǎn)物中巰基含量的變化，溫度依次為45、50、55、60、65℃,結(jié)果如圖1所示。
圖 1 不同酶解條件對(duì)酶解產(chǎn)物中巰基含量的影響
由圖1可知，酶解產(chǎn)物中的巰基含量在45℃到55℃的溫度變化中逐漸升高，當(dāng)酶解溫度為55℃時(shí)，酶解產(chǎn)物中巰基含量達(dá)到最高，為8.37μmol/g。隨著酶解溫度升高，體系內(nèi)蛋白分子的運(yùn)動(dòng)速度加快，導(dǎo)致酶與亞麻籽蛋白碰撞幾率增加[18]，亞麻籽蛋白的酶解程度提高，可能導(dǎo)致更多的巰基暴露出來(lái)，因此酶解產(chǎn)物中巰基含量升高。酶解溫度在55℃到65℃變化時(shí)，酶解產(chǎn)物中的巰基含量下降，這是因?yàn)閜roteaseM酶作為蛋白酶，其分子間的肽鍵具有特定的空間結(jié)構(gòu)，反應(yīng)溫度升高，分子吸收能量過(guò)多會(huì)引起次級(jí)鍵解體，因此會(huì)喪失或部分喪失酶的活性，使得酶解速率下降[19]，酶解產(chǎn)物的相對(duì)減少可能導(dǎo)致暴露出的巰基減少，產(chǎn)物中的巰基含量降低。因此，選擇最適合的酶解溫度為55℃。
2.1.2酶解pH對(duì)酶解產(chǎn)物中巰基含量的影響
固定酶解溫度為55°C、酶添加量900U/g和酶解時(shí)間5h，改變酶解pH分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，其酶解產(chǎn)物中巰基含量的變化如圖1所示。
由圖1可以看出，在酶解pH從2.0到3.0變化時(shí)，酶解產(chǎn)物中的巰基含量逐漸增加，在酶解pH為3.0時(shí)達(dá)到最大值，為8.62µmol/g。但隨著酶解pH的持續(xù)上升，酶解產(chǎn)物中巰基的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。pH值對(duì)酶促反應(yīng)的影響，主要體現(xiàn)在對(duì)酶活力的影響，體系過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)影響酶的活性，導(dǎo)致酶解反應(yīng)無(wú)法達(dá)到最佳效果[20]，而酶解程度的降低可能會(huì)導(dǎo)致暴露出的巰基減少。因此，選擇3.0為最合適的酶解pH。
2.1.3酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物中巰基含量的影響
固定酶添加量為900U/g、酶解pH3.0和酶解溫度55℃條件下，研究酶解時(shí)間對(duì)產(chǎn)物巰基含量的影響，酶解時(shí)間依次為3、4、5、6、7h，結(jié)果如圖1所示。
從圖1可以看出，酶解時(shí)間由3h增加到4h時(shí)，酶解產(chǎn)物的巰基含量上升，酶解4h時(shí)巰基含量達(dá)到8.74µmol/g。酶解反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，亞麻籽蛋白擴(kuò)散到溶液中與酶分子快速結(jié)合，酶解反應(yīng)迅速[21]，導(dǎo)致亞麻籽蛋白中的巰基快速暴露出來(lái)，巰基含量升高明顯。隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)物濃度增加，由于產(chǎn)物對(duì)酶的抑制作用，使得酶的活力下降，酶解反應(yīng)進(jìn)行不徹底[22]，可能導(dǎo)致酶解產(chǎn)物中暴露出的巰基減少，巰基含量呈緩慢下降趨勢(shì)。因此，選擇4h為最合適的酶解時(shí)間。
2.1.4酶添加量對(duì)酶解產(chǎn)物中巰基含量的影響
固定酶解為pH3.0、酶解時(shí)間5h和酶解溫度55°C，研究酶添加量對(duì)酶解產(chǎn)物中巰基含量的影響，酶的添加量依次為400、900、1400、1900、2300U/g，結(jié)果如圖1所示。
從圖1可以看出，酶解產(chǎn)物中巰基含量在酶添加量從400U/g上升到900U/g的過(guò)程中迅速增加，在酶添加量較少的情況下，底物濃度較大，酶被底物飽和，故而酶解反應(yīng)與酶添加量成正比，隨著酶添加量的增加，酶解反應(yīng)充分進(jìn)行，暴露出的巰基也逐漸增加[23]。在酶添加量為900U/g時(shí)，巰基含量為8.53μmol/g，達(dá)到最高。但隨著酶添加量的持續(xù)增加，酶解反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，酶分子之間接觸面變大且互相影響，降低酶分子與亞麻籽蛋白的反應(yīng)效率[24]，酶解反應(yīng)效率的降低可能導(dǎo)致暴露出的巰基減少，因此酶解產(chǎn)物中的巰基含量呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。因此將900U/g作為酶的添加量。
2.2正交試驗(yàn)結(jié)果分析
在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)的因素水平列于表1中，在表2中列出了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。
表1正交試驗(yàn)因素水平
表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
由表2可以得知，四個(gè)因素對(duì)酶解產(chǎn)物中巰基含量的影響程度為B>D>A>C，即酶解時(shí)間>酶添加量>酶解溫度>酶解pH，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出的最優(yōu)預(yù)測(cè)水平關(guān)系為A1B2C3D2，即酶解溫度50℃,酶解時(shí)間4h，酶解pH3.5，酶添加量900U/g。在上述條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，得到酶解產(chǎn)物的巰基含量為13.37μmol/g。進(jìn)一步對(duì)最適酶解條件下蛋白質(zhì)的回收率進(jìn)行分析，得到酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)回收率為34.78%。
2.3亞麻籽蛋白源半胱氨酸肽富集及巰基含量、鉛螯合量測(cè)定
最優(yōu)酶解條件下制得的亞麻籽蛋白酶解物中的半胱氨酸肽，通過(guò)ThiopropylCrystarose6FastFlow共價(jià)色譜法進(jìn)行富集，富集實(shí)驗(yàn)的吸附及解吸曲線如圖2所示，比較富集產(chǎn)物與蛋白及酶解肽的巰基含量和鉛螯合量，結(jié)果見(jiàn)表3。
圖2 Thiopropyl Crystarose 6 Fast Flow 共價(jià)色譜法吸附及解吸曲線
在富集實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中，每 10 min 記錄一次流出液的吸光值變化情況，得到如圖 2 所示的吸附與解吸曲線，取第二個(gè)峰的產(chǎn)物冷凍干燥，即為富集產(chǎn)物。
表3 巰基含量和鉛螯合量對(duì)比
注：數(shù)據(jù)代表3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，每行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。
由表3可知，在經(jīng)過(guò)單因素正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件后，亞麻籽蛋白酶解物的巰基含量增加，達(dá)到亞麻籽蛋白的2.01倍，鉛螯合量達(dá)到1.79倍。經(jīng)ThiopropylCrystarose6FastFlow共價(jià)色譜法得到的半胱氨酸肽，其巰基含量達(dá)到亞麻籽蛋白酶解肽的3.35倍之多，而鉛螯合量是酶解肽的2.19倍。以上結(jié)果均表明采用共價(jià)色譜法能有效的對(duì)含巰基的肽段進(jìn)行富集，得到鉛螯合量較高的亞麻籽蛋白源半胱氨酸肽。
2.4亞麻籽蛋白源半胱氨酸肽一級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定
取上述富集產(chǎn)物，從中鑒定出3種含有半胱氨酸的肽段，其一級(jí)結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量及蛋白來(lái)源如表4所示。
表4結(jié)構(gòu)鑒定表
由表4可知，3種肽段的分子質(zhì)量在2000～4500u之間，其一級(jí)結(jié)構(gòu)即氨基酸序列分別為WAIINLQHSGEGLCGRVV、CTGLLEAVAAALMMNIYIVGLNQLTDIE、QGGQGQQQQCEKQIQEQDYLRSCQQFLWEKVQKGGRS。
2.5肽Ⅰ、肽Ⅱ和肽Ⅲ與鉛離子的分子對(duì)接
為了進(jìn)一步確定亞麻籽蛋白源半胱氨酸肽與鉛離子的螯合作用，本研究選用鑒定出的三條含有半胱氨酸的肽段，利用分子對(duì)接探究其與鉛離子的螯合模式。
圖3肽Ⅰ與鉛離子的螯合模式
注：圖中2.2～2.5分別表示肽鏈上各結(jié)合位點(diǎn)與鉛離子的配位距離(×10-10m）。余同。
如圖3所示，肽Ⅰ的氨基酸序列為WAIINLQHSGEGLCGRVV，它與鉛離子的螯合模式主要有以上三種。圖3a中，肽Ⅰ通過(guò)Cys14鏈上的S原子，以及Glu11、Gln7和Val18鏈上的O原子，與Pb2+間形成6組配位鍵，對(duì)接螯合能為-2.246kcal/mol；圖3b中，肽Ⅰ通過(guò)Cys14鏈上的S原子，以及Ala2和Leu13鏈上的O原子，與Pb2+間形成3組配位鍵，對(duì)接螯合能為-2.168kcal/mol；圖3c中，肽Ⅰ通過(guò)Cys14鏈上的S原子，以及Leu6、Gln7、Leu13和Val18鏈上的O原子，與Pb2+間形成5組配位鍵，對(duì)接螯合能為-2.149kcal/mol。
圖4肽Ⅱ與鉛離子的螯合模式
肽Ⅱ的氨基酸序列為CTGLLEAVAAALMMNIYIVGLNQLTDIE，如圖4所示，它與鉛離子的螯合模式主要有以上兩種。圖4a中，肽Ⅱ通過(guò)Cys1鏈上的S原子，以及Asn15、Gly3、Tyr17、Ile18和Leu4鏈上的O原子與Pb2+間形成6組配位鍵，對(duì)接螯合能為-2.209kcal/mol；圖4b中，肽Ⅱ通過(guò)Cys1鏈上的S原子，以及Glu6、Ala7和Val8鏈上的O原子與Pb2+間形成4組配位鍵，對(duì)接螯合能為-2.088kcal/mol。
圖 5 肽Ⅲ與鉛離子的螯合模式
如圖5所示，肽Ⅲ的氨基酸序列為QGGQGQQQQCEKQIQEQDYLRSCQQFLWEKVQKGGRS，它與鉛離子的螯合模式主要有以上三種。圖5a中，肽Ⅲ通過(guò)Cys10鏈上的S原子，以及Gln24、Glu11鏈上的O原子，與Pb2+間形成6組配位鍵，對(duì)接螯合能為-2.098kcal/mol；圖5b中，肽Ⅲ通過(guò)Cys10鏈上的S原子、Cys23上的S原子，以及Cys23和Gln24鏈上的O原子，與Pb2+間形成5組配位鍵，對(duì)接螯合能為-2.025kcal/mol；圖5c中，肽Ⅲ通過(guò)Cys23鏈上的S原子，以及Glu16、Glu17、Ser22和Ser37鏈上的O原子，與Pb2+間形成7組配位鍵，對(duì)接螯合能為-2.022kcal/mol。
結(jié)果表明，三種含有半胱氨酸的肽段均可以與鉛離子進(jìn)行螯合，且對(duì)接螯合能都為負(fù)值，表明其與鉛離子的螯合狀態(tài)穩(wěn)定。其中，半胱氨酸在螯合作用中發(fā)揮重要作用，如肽Ⅰ提供的Cys14位點(diǎn)、肽Ⅱ提供的Cys1位點(diǎn)以及肽Ⅲ提供的Cys10、Cys23位點(diǎn)，都在螯合過(guò)程中提供了S原子。
3結(jié)論
本研究確定了亞麻籽蛋白的最佳酶解工藝，得到的酶解產(chǎn)物巰基含量達(dá)到亞麻籽蛋白的2.01倍，鉛螯合量為1.79倍。富集后得到亞麻籽蛋白源半胱氨酸肽，巰基含量達(dá)到亞麻籽蛋白的6.74倍，鉛螯合量為3.92倍。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到3種含有半胱氨酸的肽段，分別為WAIINLQHSGEGLCGRVV、CTGLLEAVAAALMMNIYIVGLNQLTDIE、QGGQGQQQQCEKQIQEQDYLRSCQQFLWEKVQKGGRS，三種肽段均可以與鉛離子穩(wěn)定螯合，且螯合過(guò)程中半胱氨酸的巰基發(fā)揮重要作用。綜上，本研究證明了對(duì)亞麻籽蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化并富集，可以得到高巰基含量且能與鉛離子螯合的半胱氨酸肽，旨在提高亞麻籽榨油后副產(chǎn)物的利用率，并為亞麻籽蛋白源半胱氨酸肽作為解毒劑緩解鉛中毒的研究提供理論依據(jù)。
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