摘 要: 本發(fā)明適用于植物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，包括三種方法，分別為浸種萌發(fā)、群體效應和Box?Behnken響應面法優(yōu)化漢麻無菌萌發(fā)條件。本發(fā)明采用赤霉素、氯化鈣、硝酸鉀在室溫下浸種，一方面可以使種皮溶脹，增加了種皮透性，利于外源物質(zhì)的進入；另一方面提高了種子萌發(fā)率，克服了種子萌發(fā)休眠的問題。本發(fā)明確定了最適合漢麻種子無菌萌發(fā)的消毒方式，在保證種子低污染率的同時，種子無菌萌發(fā)率上有極大提高。本發(fā)明采用的無菌萌發(fā)方法保證了種子在無菌萌發(fā)過程中污染率低。本發(fā)明所用的儀器簡單，操作方便，易于進行工廠化漢麻種苗生產(chǎn)。
權(quán)利要求書
1.一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，其特征在于，包括以下步驟：選取籽粒飽滿、整齊一致的漢麻種子進行培養(yǎng)皿濾紙萌發(fā)；使用400mg/L的赤霉素、900mg/L的氯化鈣和2%的硝酸鉀在室溫下浸種6h；完成浸種后，將30粒種子均勻擺放于鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，然后添加適量的無菌水；最后將培養(yǎng)皿置于25℃的人工氣候箱中進行暗培養(yǎng)。
2.一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，其特征在于，包括以下步驟：選取籽粒飽滿、整齊一致的漢麻種子，用無菌水浸種5?6h；75%乙醇消毒30?60s后，用0.1%升汞消毒8min，期間過3?5次無菌水；接種10粒以上種子于1/2MS培養(yǎng)基。
3.一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，其特征在于，包括以下步驟：選取籽粒飽滿未露白的漢麻種子，用無菌水浸種5?6h；用75%乙醇消毒218s后再用3%次氯酸鈉消毒23min，然后用75%乙醇消毒211s后再用0.1%升汞消毒6min；消毒后用無菌水清洗3?5次；將漢麻種子接種于1/2MS培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基中接入10粒種子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，其特征在于，所述乙醇和次氯酸鈉聯(lián)合消毒期間以及乙醇和升汞聯(lián)合消毒期間均用無菌水清洗。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法。
背景技術(shù)
漢麻(Cannabis sativa L.)又叫火麻和線麻，是指種子、莖、葉及根部中的四氫大麻酚(Tetrahydrocannabinol,THC)含量小于0.3％的大麻。漢麻的繁殖主要包括通過種子繁殖、離體培養(yǎng)、莖扦插等方法。其中，漢麻無菌繁殖要優(yōu)于種子繁殖、人工克隆(莖扦插)等傳統(tǒng)方法。具有低成本高增殖率的、適應性強可擴展的和健壯的高質(zhì)量的組織培養(yǎng)系統(tǒng)被證明是更具成本效益的，且能夠使許多行業(yè)受益，包括園藝和谷類作物。目前利用微繁殖進行漢麻的芽體增殖、莖段再生的相關(guān)報道有很多，但實現(xiàn)漢麻全株再生的研究尚屬空白，如何構(gòu)建單細胞再生培養(yǎng)體系仍是一個具有挑戰(zhàn)性的課題。離體培養(yǎng)已成為一種常見做法。在不久的將來，試管微繁有望成為漢麻繁殖和遺傳保存的首選方法。
無菌萌發(fā)是通過組織培養(yǎng)技術(shù)將植物種子接種到培養(yǎng)基中并使其萌發(fā)，最后生長成幼苗的過程，操作培養(yǎng)過程中全程無菌。種子的無菌化發(fā)芽是組織培養(yǎng)的一項重要內(nèi)容，也是組織培養(yǎng)和快速繁殖的第一步。如果滅菌效果不好，就會使培養(yǎng)基上所形成的愈傷組織在培養(yǎng)過程中發(fā)生感染，從而導致不能進一步分化和生長。因此，在組培過程中應盡可能地避免由于材料消毒不徹底而造成的污染。不同的消毒劑和處理時間對種子的消毒效果不同。75％乙醇、次氯酸鈉和0.1％升汞都是比較常見的種子消毒劑。
影響種子萌發(fā)的因素有兩個：一是內(nèi)因，二是外因。其本身的條件主要有包括完整的活胚和胚胎生長所需的養(yǎng)分；外部條件影響因子有水、氧、適宜的溫度和光照、包括浸種時間和滲透調(diào)節(jié)劑濃度等。滲透調(diào)節(jié)是一種能夠調(diào)節(jié)種子生理代謝，增加種子對物質(zhì)、能量的利用，從而增強種子的活力、促進種子的發(fā)芽的有效的種子誘導方法。使用不同滲透調(diào)節(jié)劑進行浸種能夠更快地打破種子休眠、促進胚芽生長、縮短培育周期，從整體上提高了漢麻種子的發(fā)芽質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，旨在解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，包括以下步驟：
選取籽粒飽滿、整齊一致的漢麻種子進行培養(yǎng)皿濾紙萌發(fā)；使用400mg/L的赤霉素、900mg/L的氯化鈣和2％的硝酸鉀在室溫下浸種6h；完成浸種后，將30粒種子均勻擺放于鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，然后添加適量的無菌水；最后將培養(yǎng)皿置于25℃的人工氣候箱中進行暗培養(yǎng)。
一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，包括以下步驟：
選取籽粒飽滿、整齊一致的漢麻種子，用無菌水浸種5?6h；75％乙醇消毒30?60s后，用0.1％升汞消毒8min，期間過3?5次無菌水；接種10粒以上種子于1/2MS培養(yǎng)基。
一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，包括以下步驟：
選取籽粒飽滿未露白的漢麻種子，用無菌水浸種5?6h；用75％乙醇消毒218s后再用3％次氯酸鈉消毒23min，然后用75％乙醇消毒211s后再用0.1％升汞消毒6min；消毒后用無菌水清洗3?5次；將漢麻種子接種于1/2MS培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基中接入10粒種子。
進一步的，所述乙醇和次氯酸鈉聯(lián)合消毒期間以及乙醇和升汞聯(lián)合消毒期間均用無菌水清洗。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
1、本發(fā)明用400mg/L的赤霉素、900mg/L的氯化鈣和2％的硝酸鉀在室溫下浸種6h，一方面可以使種皮溶脹，增加了種皮透性，利于外源物質(zhì)的進入；900mg/L的氯化鈣浸泡使種子的萌發(fā)率提高1.11?18.89％。2％的硝酸鉀浸泡使種子萌發(fā)率提高了6.66?24.45％。另一方面，赤霉素的浸泡在提高種子萌發(fā)率方面的能力較強，種子萌發(fā)率提高了1.11?17.78％。克服了種子萌發(fā)休眠的問題。
2、本發(fā)明采用Box?Behnken響應面法優(yōu)化漢麻無菌萌發(fā)條件，得到各因素對漢麻種子發(fā)芽率影響的大小為：75％乙醇消毒時間＞消毒時間＞消毒劑濃度。確定最適合漢麻種子無菌萌發(fā)的消毒方式，在保證種子低污染率的同時，種子無菌萌發(fā)率上有極大提高，種子無菌萌發(fā)率達到38.08％。
3、本發(fā)明采用的無菌萌發(fā)方法保證了種子在無菌萌發(fā)過程中污染率低，克服了在傳統(tǒng)萌發(fā)種子因種子數(shù)目少、內(nèi)生菌多，在無菌萌發(fā)過程中易污染的問題。
4、本發(fā)明所用的儀器簡單，操作方便，易于進行工廠化漢麻種苗生產(chǎn)。
附圖說明
圖1為實施例2中群體效應對種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率的影響。
圖2為實施例3中75％乙醇消毒時間和次氯酸鈉濃度的交互作用。
圖3為實施例3中75％乙醇消毒時間和次氯酸鈉消毒時間的交互作用。
圖4為實施例3中次氯酸鈉濃度和次氯酸鈉消毒時間的交互作用。
圖5為實施例3中75％乙醇消毒時間和升汞濃度的交互作用。
圖6為實施例3中75％乙醇消毒時間和升汞消毒時間的交互作用。
圖7為實施例3中升汞濃度和升汞消毒時間的交互作用。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的具體實現(xiàn)進行詳細描述。
本發(fā)明一個實施例提供的一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，包括以下步驟：
浸種萌發(fā)：選取籽粒飽滿、整齊一致的漢麻種子進行培養(yǎng)皿濾紙萌發(fā)；使用400mg/L的赤霉素、900mg/L的氯化鈣和2％的硝酸鉀在室溫下浸種6h；完成浸種后，將30粒種子均勻擺放于鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中(先對濾紙、培養(yǎng)皿和接種用的鉗子進行消毒滅菌)，然后添加適量的無菌水，使濾紙充分浸泡并保留能使種子發(fā)芽的水分；最后將培養(yǎng)皿置于25℃的人工氣候箱中進行暗培養(yǎng)；
本發(fā)明一個實施例提供的一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，包括以下步驟：
群體效應：選取籽粒飽滿、整齊一致的漢麻種子，用無菌水浸種5?6h；75％乙醇消毒30?60s后，用0.1％升汞消毒8min，期間過3?5次無菌水；接種10粒以上種子于1/2MS培養(yǎng)基；
本發(fā)明一個實施例提供的一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法，包括以下步驟：
Box?Behnken響應面法優(yōu)化：選取籽粒飽滿未露白的漢麻種子，用無菌水浸種5?6h；用75％乙醇消毒218s后再用3％次氯酸鈉消毒23min，然后用75％乙醇消毒211s后再用0.1％升汞消毒6min；消毒后用無菌水清洗3?5次(聯(lián)合消毒期間也要過無菌水)；將漢麻種子接種于1/2MS培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基中接入10粒種子。
實施例1、漢麻種子的浸種萌發(fā)：
主要儀器：人工氣候箱、濾紙、培養(yǎng)皿、鑷子。
本實施例中漢麻種子的浸種萌發(fā)按照以下步驟進行：
(1)選種：選取籽粒飽滿、整齊一致的漢麻種子。
(2)浸種：使用赤霉素、氯化鈣、硝酸鉀(見表1)在室溫下浸種6h。
(3)暗培養(yǎng)：把浸種完畢的種子，均勻擺放30粒于鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中(先對濾紙、培養(yǎng)皿和接種用的鉗子進行消毒滅菌)，然后添加適量的無菌水，使濾紙充分浸泡并保留能使種子發(fā)芽的水分。最后將培養(yǎng)皿置于25℃的人工氣候箱中進行暗培養(yǎng)。
表1 赤霉素、氯化鈣、硝酸鉀浸種處理
無菌水浸種作為對照(CK)。每個品種皆13個處理，各處理均3次重復。3d后統(tǒng)計漢麻種子的發(fā)芽勢，7d后統(tǒng)計發(fā)芽率。
表2 赤霉素浸種對不同品種漢麻種子的影響
表3 氯化鈣浸種對不同品種漢麻種子的影響
表4 硝酸鉀浸種對不同品種漢麻種子的影響
實驗結(jié)果表明(見表2、表3和表4)：400mg/L的赤霉素浸泡使種子萌發(fā)率提高了1.11?17.78％。900mg/L的氯化鈣浸泡使種子萌發(fā)率提高了1.11?18.89％。2％的硝酸鉀浸泡使種子萌發(fā)率提高了6.66?24.45％。
實施例2、漢麻種子的無菌萌發(fā)中接種數(shù)目：
主要儀器：電磁爐、高壓滅菌鍋、無菌操作臺、組織培養(yǎng)室、錐形瓶、培養(yǎng)皿、鑷子、酒精燈、燒杯、量筒、容量瓶、移液管、玻璃棒、天平、酸度計。
本實施例中漢麻種子的浸種萌發(fā)按照以下步驟進行：
(1) 選種：選取籽粒飽滿、整齊一致的漢麻種子。
(2)浸種：用無菌水浸種5?6h。
(3)消毒：75％乙醇消毒30?60s后，用0.1％升汞消毒8min，期間過3?5次無菌水。
(4)接種：接種于1/2MS培養(yǎng)基。(本實施例和本發(fā)明中的所有實施例中，無菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制時所使用的1/2MS培養(yǎng)基為本領(lǐng)域公用的配方)。
(5)培養(yǎng)將接種好的培養(yǎng)基放置于培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)條件為25℃，暗培養(yǎng)。
每個處理設3個重復，每3瓶為1個重復。室溫下暗培養(yǎng)3d后測定萌發(fā)情況，第7d測定其發(fā)芽率。
實驗結(jié)果表明(見圖1)：漢麻種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率隨著接種粒數(shù)的增加而上升，20粒時發(fā)芽率高達42.22％。經(jīng)過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，各接種數(shù)目的種子的發(fā)芽勢之間存在顯著性差異，發(fā)芽率之間存在極顯著差異，說明群體效應對漢麻種子發(fā)芽率具有影響，種子數(shù)目越多，種子越易發(fā)芽。10粒和15粒的發(fā)芽率分別是12.22％、13.33％，一般選擇接種10粒種子，有利于種子萌發(fā)，并且方便觀察。
實施例3、Box?Behnken響應面法優(yōu)化漢麻無菌萌發(fā)的消毒條件：
主要儀器：電磁爐、高壓滅菌鍋、無菌操作臺、組織培養(yǎng)室、錐形瓶、培養(yǎng)皿、鑷子、酒精燈、燒杯、量筒、容量瓶、移液管、玻璃棒、天平、酸度計。
本實施例中Box?Behnken響應面法優(yōu)化漢麻無菌萌發(fā)的消毒條件按照以下步驟進行：
(1)75％酒精、升汞、次氯酸鈉單因素試驗；
A.選種：選取籽粒飽滿、整齊一致的漢麻種子。
B.浸種：用無菌水浸種5 6h。
C.消毒：選用不同消毒劑和消毒濃度及消毒時間進行消毒，消毒工作結(jié)束后，再用無菌水清洗種子3 5次。具體處理如下(如表5、表6、表7、表8、表9)。
表5 75％乙醇消毒處理
表6 次氯酸鈉消毒20min處理
表7 2％次氯酸鈉消毒處理
表8 升汞消毒8min處理
表9 0.1％升汞消毒處理
D.接種：將10粒漢麻種子用酒精燈加熱后的鑷子接種到1/2MS培養(yǎng)基上。本實例和本發(fā)明中的所有實施例中，無菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制時所使用的1/2MS培養(yǎng)基為本領(lǐng)域公用的配方。
E.培養(yǎng)：培養(yǎng)將接種好的培養(yǎng)基放置于培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)條件為25℃，暗培養(yǎng)。
每個處理設3個重復，每3瓶為1個重復。室溫(25?26℃)下暗培養(yǎng)7d，統(tǒng)計其發(fā)芽勢和發(fā)芽率以及污染率。
(2) Box?Behnken響應面法優(yōu)化漢麻無菌萌發(fā)條件；
A.設計Box Behnken響應面法實驗：確定各因素最優(yōu)水平后，再運用Design Expert13軟件的Box Behnken響應面來設計優(yōu)化實驗，得到兩個3因素3水平實驗，以探究漢麻無菌萌發(fā)的最佳條件。具體實驗因素與水平如下(見表10、表11)。
表10 75％乙醇、次氯酸鈉消毒處理
表11 75％乙醇、升汞消毒處理
B.選種：選取籽粒飽滿、整齊一致的漢麻種子。
C.浸種：用無菌水浸種5?6h。
D.消毒：利用不同消毒劑及其濃度和時間的滅菌組合進行聯(lián)合消毒，消毒后用無菌水清洗3?5次。
E.接種：將10粒漢麻種子用酒精燈加熱后的鑷子接種到1/2MS培養(yǎng)基上。本實例和本發(fā)明中的所有實施例中，無菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制時所使用的1/2MS培養(yǎng)基為本領(lǐng)域公用的配方。
F.培養(yǎng)：培養(yǎng)將接種好的培養(yǎng)基放置于培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)條件為25℃，暗培養(yǎng)。
每個處理設3個重復，每3瓶為1個重復。暗培養(yǎng)7d，統(tǒng)計發(fā)芽勢、發(fā)芽率。
G.回歸模型建立：將表12、表13中的數(shù)據(jù)錄入到Design?Expert13軟件中，對其進行整理并進行回歸分析。在此基礎上得出了兩個二次回歸方程a和b。并對回歸模型進行方差分析及顯著性檢驗。
表12 75％乙醇消毒時間、次氯酸鈉濃度和次氯酸鈉消毒時間對漢麻種子無菌萌發(fā)的影響
表13 75％乙醇消毒時間、升汞濃度和升汞消毒時間對漢麻種子無菌萌發(fā)的影響
實驗結(jié)果表明(見圖2至圖7)：在3D響應曲面圖中，所有的曲面開口都朝下，所以漢麻種子無菌萌發(fā)的發(fā)芽率具有極大值。利用Design?Expert13軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，得到最優(yōu)的消毒處理組合，使用最優(yōu)的消毒處理組合對種子進行處理，得出最高的種子萌發(fā)率。即：75％乙醇消毒218s后再用3％次氯酸鈉消毒23min的種子萌發(fā)率為38.08％；75％乙醇消毒211s后再用0.1％升汞消毒6min的種子萌發(fā)率為21.50％。
以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應該視為本發(fā)明的保護范圍，這些均不會影響本發(fā)明實施的效果和專利的實用性。
文章摘自國家發(fā)明專利，一種促進漢麻種子無菌萌發(fā)的處理方法；發(fā)明人：祁宏英，徐洪國，費義瑩，李文聰，張建鵬，阮金花；申請?zhí)?/font>：202410600700.8；申請日：2024.05.14。
