摘  要：CsMIXTA在調(diào)控大麻雌性花器官中腺毛的發(fā)生和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。為了研究CsMIXTA基因的表達(dá)調(diào)控，對(duì)CsMIXTA基因上游2199bp啟動(dòng)子序列進(jìn)行了克隆。通過(guò)PlantCARE預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子序列具有多個(gè)脅迫響應(yīng)元件與光響應(yīng)元件。根據(jù)預(yù)測(cè)的響應(yīng)元件分布情況，擴(kuò)增獲得5個(gè)5′端缺失的啟動(dòng)子片段。用克隆的啟動(dòng)子全長(zhǎng)和缺失片段分別構(gòu)建融合GUS基因的表達(dá)載體，并將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到煙草葉片和工業(yè)大麻糖葉中。通過(guò)GUS染色觀察發(fā)現(xiàn)，CsMIXTA啟動(dòng)子的核心區(qū)域位于-393~-99bp之間，包含赤霉素響應(yīng)元件TATC-box和轉(zhuǎn)錄起始元件TATA-box。通過(guò)LUC熒光素酶表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CsMIXTA啟動(dòng)子的核心區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄活性。并且研究還發(fā)現(xiàn)，CsMIXTA基因在工業(yè)大麻糖葉的腺毛中特異性表達(dá)。對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行脅迫響應(yīng)分析的結(jié)果顯示，低溫、脫落酸(ABA)和赤霉素(GA3)都能增強(qiáng)該啟動(dòng)子的活性。這些結(jié)果為CsMIXTA基因調(diào)控機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:工業(yè)大麻；CsMIXTA啟動(dòng)子；瞬時(shí)表達(dá)；GA3、ABA處理

 

大麻(Cannabis sativa L.)是大麻科大麻屬的一年生草本植物，也被稱為工業(yè)大麻、火麻、漢麻^[1]。大麻可以產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，比如萜烯類、大麻素等，其中包括具有重要醫(yī)用潛力的大麻二酚(Cannabidiol，CBD)^[2]。大麻中的腺毛是一種特殊的表皮毛結(jié)構(gòu)，是大麻次生代謝物產(chǎn)生的重要工廠^[3]。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)增加光照或改善營(yíng)養(yǎng)條件，能增加大麻中這些次級(jí)代謝物的含量^[4]。此外，使用包括植物激素在內(nèi)的多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也可以增加次級(jí)代謝物的含量^[5]。

研究表明，R2R3-MYB家族的一些成員可以調(diào)控表皮細(xì)胞發(fā)育^[6]。例如，在金魚(yú)草中發(fā)現(xiàn)MIXTA基因控制著錐形表皮細(xì)胞的分化^[7]。青蒿中的AaMYB1和AaMIXTA1^[8-9]，番茄中的SlMX1^[10]被確定為腺毛啟動(dòng)的正調(diào)控因子。過(guò)表達(dá)AaMYB1基因可以增加青蒿植株的腺毛密度^[8-9]，而AaMIXTA1和SlMX1的下調(diào)則會(huì)降低腺毛密度^[10]。大麻R2R3-MYB家族基因同樣對(duì)腺毛發(fā)育起重要作用^[11]。研究發(fā)現(xiàn)大麻R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子CsMIXTA在雌花中顯著表達(dá)。CsMIXTA在煙草中過(guò)表達(dá)后，煙草葉片的腺毛大小與密度明顯增加，且腺毛分支也顯著增加。這些結(jié)果表明CsMIXTA可能調(diào)控大麻雌性花器官中腺毛的發(fā)生和發(fā)育^[12]。然而，目前該基因的調(diào)控機(jī)制與組織表達(dá)特性尚不明確。

為了深入探究大麻CsMIXTA基因的功能和調(diào)控機(jī)制，本研究克隆了CsMIXTA基因2199bp啟動(dòng)子序列，并分析了該啟動(dòng)子序列的順式作用元件。通過(guò)5′端啟動(dòng)子缺失融合GUS基因在煙草和工業(yè)大麻中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了該啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)區(qū)和組織表達(dá)特異性，并初步驗(yàn)證了其順式作用元件的功能。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究CsMIXTA基因的功能和調(diào)控機(jī)制提供了參考。

 

1材料與方法

1.1材料與試劑

本研究使用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所保存的高CBD工業(yè)大麻種質(zhì)‘DMG265’為試驗(yàn)材料，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)471μmolm-2s-1，營(yíng)養(yǎng)期光周期為18h光照/6h黑暗，花期光周期為12h光照/12h黑暗，濕度50%~60%，溫度(25±2)℃。本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所特色蔬菜團(tuán)隊(duì)提供，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)471μmolm-2s-1、光周期18h光照/6h黑暗、濕度50%~60%、溫度(25±2)℃。采集成熟期雌花的糖葉，并立即用液氮暫存，隨后放入-80℃冰箱保存，用于提取總DNA。

膠回收試劑盒購(gòu)自OMEGA公司；高保真酶ApexHFHSDNA聚合酶混合液FS、PCR酶AccurateTaqDNA預(yù)混液、DL2199Marker、DL10000Marker購(gòu)自艾科瑞生物公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ購(gòu)自NewEnglandBiolabs公司；DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；質(zhì)粒提取試劑盒、同源重組試劑盒購(gòu)自諾唯贊公司；Trelief5αChemicallyCompetentCell感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌GV3101、pClone007購(gòu)自北京擎科生物科技股份有限公司；GUS染色液、SilwettL-77購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物公司；MES、MgCl2、葡萄糖、乙酰丁香酮、抗壞血酸購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司；PluronicF-68購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；MS培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；由北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行引物合成及測(cè)序。植物啟動(dòng)子表達(dá)載體pCAMBIA1391、pNC-Green-LUC由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2CsMIXTA啟動(dòng)子克隆與分析

按DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取保存工業(yè)大麻‘DMG265’糖葉的總DNA。利用NCBI上的大麻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Cs10:GCA_900626175.2)獲取CsMIXTA基因的基因組信息(LOC115701410)，分析提取其起始ATG上游的啟動(dòng)子序列，使用Snapgene軟件設(shè)計(jì)啟動(dòng)子克隆引物，命名為MT-F與MT-R(表1)。以總DNA為模板對(duì)CsMIXTA基因起始ATG上游2199bp進(jìn)行克隆。通過(guò)膠回收試劑盒回收克隆的片段，并通過(guò)pClone007試劑盒進(jìn)行T載連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trelief5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆菌液質(zhì)粒送北京擎科生物科技股份有限公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與已知序列在Snapgene軟件上進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。

1.3CsMIXTA啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析

通過(guò)PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測(cè)上述克隆獲得的CsMIXTA基因啟動(dòng)子序列的順式作用元件的功能與位點(diǎn)。通過(guò)網(wǎng)站Softberry(http://www.softberry.com)對(duì)CsMIXTA啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

1.4CsMIXTA啟動(dòng)子5′端缺失克隆

根據(jù)預(yù)測(cè)獲得的順式作用元件的功能與位點(diǎn)，以已測(cè)序的2199bp啟動(dòng)子片段為模板進(jìn)行5′端缺失克隆。以已測(cè)序的啟動(dòng)子全長(zhǎng)質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見(jiàn)表1)，通過(guò)膠回收試劑盒回收克隆的片段，并通過(guò)pClone007試劑盒進(jìn)行T載連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trelief5α感受態(tài)細(xì)胞中，平板培養(yǎng)后挑取單菌落并進(jìn)行PCR鑒定，獲得陽(yáng)性克隆后進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

表1本研究所用引物

 

  

1.5CsMIXTA植物啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建

使用植物啟動(dòng)子表達(dá)載體pCAMBIA1391(圖1)對(duì)CsMIXTA基因啟動(dòng)子的表達(dá)活性進(jìn)行分析。依據(jù)載體上的多克隆位點(diǎn)信息，選用BamHⅠ單個(gè)限制性內(nèi)切酶，對(duì)啟動(dòng)子全長(zhǎng)以及缺失片段設(shè)計(jì)同源重組加臂引物(表1)。以啟動(dòng)子全長(zhǎng)以及缺失片段質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR克隆，純化擴(kuò)增產(chǎn)物后使用同源重組試劑盒將其與經(jīng)過(guò)BamHⅠ單酶切的pCAMBIA1391載體進(jìn)行同源重組連接。將同源重組液轉(zhuǎn)化到Trelief5α感受態(tài)細(xì)胞中，平板培養(yǎng)后挑取單菌落并進(jìn)行PCR鑒定，獲得陽(yáng)性克隆后進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

使用熒光素酶表達(dá)載體pNC-Green-LUC載體對(duì)CsMIXTA基因核心啟動(dòng)子區(qū)的表達(dá)活性進(jìn)行分析。該載體為NC克隆載體，使用NC克隆通用接頭對(duì)CsMIXTA基因核心啟動(dòng)子片段進(jìn)行加臂(表1)。以核心啟動(dòng)子片段為模板進(jìn)行PCR克隆，純化擴(kuò)增產(chǎn)物后使用NC克隆試劑盒將其與pNC-Green-LUC載體進(jìn)行連接。將同源重組液轉(zhuǎn)化到Trelief5α感受態(tài)細(xì)胞中，平板培養(yǎng)后挑取單菌落并進(jìn)行PCR鑒定，獲得陽(yáng)性克隆后進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

  

圖1植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

A：攜帶GUS的pCAMBIA1391；B：攜帶LUC的pNC-Green-LUC；Poly(A)：花椰菜花葉病毒多聚腺苷酸化信號(hào)；HygR：潮霉素抗性基因；35SP：花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；NOST：胭脂堿合酶基因終止子；Rluc：海腎熒光素酶；NCFrame：NC克隆框架；GUS：葡糖苷酸酶；LUC：螢火蟲(chóng)熒光素酶。

1.6農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的植物啟動(dòng)子表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，平板培養(yǎng)后挑取單菌落并進(jìn)行PCR鑒定，獲得陽(yáng)性后將單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至OD600為2，4000×g離心5min集菌，接著加入含有10mmolL−1MES、10mmolL−1MgCl2和200mmolL−1乙酰丁香酮的重懸液(pH5.6)，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌濃度使其OD600為1，并在室溫避光環(huán)境中靜置2~6h。選用移栽后30~40d的本氏煙草，將含有啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射至完全展開(kāi)的上部2片葉片中，并使用pCAMBIA1391空載體作為為陰性對(duì)照。

1.7農(nóng)桿菌介導(dǎo)的工業(yè)大麻瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

將1.2.5中使用的全長(zhǎng)啟動(dòng)子表達(dá)載體質(zhì)粒陽(yáng)性單菌落農(nóng)桿菌培養(yǎng)物重懸于含10mmolL−1MES、1×MS、2%葡萄糖、0.015%SilwettL-77、0.05%PluronicF-68、5mmolL−1抗壞血酸和200µmolL−1乙酰丁香酮的重懸液中，pH為5.6。將進(jìn)入花期1周后的工業(yè)大麻植株倒置浸泡在重懸液中，并放入真空室，打開(kāi)真空泵降低壓力，待壓力值達(dá)到80mbar后計(jì)算滲透時(shí)間。在低壓下5~15min后，緩慢打開(kāi)釋放閥，使農(nóng)桿菌進(jìn)入植物組織間隙。

1.8煙草與工業(yè)大麻GUS組織化學(xué)染色

在農(nóng)桿菌注射后的煙草葉片中打孔，獲得直徑為5mm的注射煙草葉盤。將葉盤放入GUS染液中，室溫避光條件下靜置過(guò)夜。取出染色后的葉片，進(jìn)行3~4次70%乙醇脫水，直到陰性對(duì)照呈白色。最后，在體式顯微鏡下觀察并拍攝樣品。

將侵染后的工業(yè)大麻糖葉摘下，放入GUS染液中，室溫避光條件下靜置過(guò)夜。取出染色后的葉片，進(jìn)行3~4次70%乙醇脫水，直到陰性對(duì)照呈白色。最后，在體式顯微鏡下觀察并拍攝樣品。

1.9煙草熒光素染色

在農(nóng)桿菌注射后的煙草葉背上噴施1mmolL−1熒光素酶底物，隨后室溫避光處理7min，放入植物活體成像儀中觀察并拍攝樣品。

1.10不同脅迫環(huán)境下工業(yè)大麻糖葉中CsMIXTA表達(dá)分析

分別使用100μmolL-1赤霉素和100μmolL-1脫落酸噴施于開(kāi)花期的工業(yè)大麻‘DMG265’糖葉。處理24h后，檢測(cè)糖葉中的CsMIXTA表達(dá)活性。

將工業(yè)大麻‘DMG265’置入4℃植物培養(yǎng)箱中，處理24h后檢測(cè)糖葉中的CsMIXTA表達(dá)活性。

本研究使用Bio-RadCFX進(jìn)行qPCR分析。qPCR反應(yīng)內(nèi)參為BUQ5^[13]，CsMIXTA引物見(jiàn)表1。試驗(yàn)采用4個(gè)生物重復(fù)。

 

2結(jié)果與分析

2.1CsMIXTA啟動(dòng)子克隆

以工業(yè)大麻‘DMG265’糖葉的DNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR克隆獲得2199bp的產(chǎn)物(圖2)，構(gòu)建T載測(cè)序比對(duì)顯示該片段與基因組Cs10中的CsMIXTA基因的啟動(dòng)子區(qū)序列一致，成功獲得CsMIXTA基因啟動(dòng)子片端。

  

圖2CsMIXTA啟動(dòng)子的克隆

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；P：全長(zhǎng)啟動(dòng)子。

2.2CsMIXTA啟動(dòng)子序列分析

利用在線網(wǎng)站PlantCARE對(duì)克隆的CsMIXTA基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，除具有啟動(dòng)子的基本元件84個(gè)TATA-box和15個(gè)CAAT-box外，該啟動(dòng)子序列還具有光響應(yīng)元件(Box4、AE-box、GATA-motif、G-box)、參與光反應(yīng)性的MYB結(jié)合位點(diǎn)(MRE)、晝夜節(jié)律控制元件(circadian)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、赤霉素響應(yīng)元件(TATC-box)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)等(圖3和表2)。

通過(guò)網(wǎng)站Softberry中的TTSplantTool在線程序?qū)寺〉腃sMIXTA基因啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果得到5個(gè)評(píng)分較高的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)分別位于-92bp、-487bp、-1074bp、-1375bp、-1835bp(表3)。

  

圖3CsMIXTA啟動(dòng)子序列分析

起始密碼按照ATG的“G”為+1位點(diǎn)，紅色下畫線標(biāo)注的“G”為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

表2 CsMIXTA啟動(dòng)子部分順式作用元件

   

表3 CsMIXTA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)

  

2.3CsMIXTA啟動(dòng)子缺失片段克隆

根據(jù)PlantCARE預(yù)測(cè)的順式作用元件將克隆獲得的CsMIXTA基因上游2199bp啟動(dòng)子片段分為5段啟動(dòng)子缺失片段。經(jīng)過(guò)克隆獲得了長(zhǎng)度分別為1756、1413、547、393、99bp的5個(gè)5′端缺失啟動(dòng)子片段，分別命名為P1、P2、P3、P4、P5(圖4)。與全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列P相比，P1片段缺失了低溫響應(yīng)元件LTR；P2片段缺失了晝夜節(jié)律控制元件circadian；P3片段缺失了光響應(yīng)元件G-Box和脫落酸響應(yīng)元件ABRE；P4片段缺失了光響應(yīng)元件GATA-motif和G-box；P5片段缺失了赤霉素響應(yīng)元件TATC-box，只含有TATA-box元件(圖5)。

 

  

圖4CsMIXTA啟動(dòng)子缺失片段克隆

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；P：全長(zhǎng)啟動(dòng)子；P1~P5：?jiǎn)?dòng)子缺失片段1~5。

  

圖5CsMIXTA啟動(dòng)子全長(zhǎng)及缺失片段示意圖

LTR:低溫響應(yīng)元件;Box4:光響應(yīng)元件;MRE:參與光反應(yīng)性的MYB結(jié)合位點(diǎn);circadian:晝夜節(jié)律控制響應(yīng)元件;AE-box:光響應(yīng)元件;

ABRE:脫落酸響應(yīng)元件;G-box:光響應(yīng)元件;GATA-motif:光響應(yīng)元件;TATC-box:赤霉素響應(yīng)元件;圖中數(shù)值單位為bp。

2.4CsMIXTA全長(zhǎng)及不同缺失啟動(dòng)子作用下煙草瞬時(shí)表達(dá)分析

為了驗(yàn)證CsMIXTA啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)區(qū)與表達(dá)活性，將全長(zhǎng)及缺失啟動(dòng)子片段同源重組到GUS表達(dá)質(zhì)粒中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到本氏煙草中，2d后取樣進(jìn)行GUS染色。由圖6可知，陰性對(duì)照(CK)為注射了pCAMBIA1391載體的煙草葉片，呈現(xiàn)無(wú)色，證明該載體不具備啟動(dòng)活性。全長(zhǎng)啟動(dòng)子片段P，缺失片段P1、P2、P3和P4注射的煙草葉片被染成不同成程度的藍(lán)色，證明CsMIXTA基因啟動(dòng)子全長(zhǎng)以及前4個(gè)缺失序列都具備啟動(dòng)GUS基因表達(dá)的能力。而啟動(dòng)子缺失片段P5注射的煙草葉片呈現(xiàn)無(wú)色，說(shuō)明該缺失片段不具備啟動(dòng)GUS基因的能力，由此確定啟動(dòng)子核心區(qū)域位于P4和P5之間，即-393~-99bp。此外，除P5外的啟動(dòng)子缺失片段以及全長(zhǎng)片段注射的煙草葉片上的大量表皮毛被上了較深的藍(lán)色。

  

圖6CsMIXTA啟動(dòng)子全長(zhǎng)及缺失片段作用下的煙草GUS染色

CK：陰性對(duì)照；P：全長(zhǎng)啟動(dòng)子；P1~P5：?jiǎn)?dòng)子缺失片段1~5。

2.5CsMIXTA核心啟動(dòng)子作用下煙草瞬時(shí)表達(dá)分析

為了驗(yàn)證CsMIXTA啟動(dòng)子核心啟動(dòng)區(qū)的表達(dá)活性，將核心啟動(dòng)區(qū)P4(393bp)片段通過(guò)NC克隆到LUC表達(dá)質(zhì)粒中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到本氏煙草中，2d后取樣進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。由圖7可知，CsMIXTA的核心啟動(dòng)子區(qū)具備轉(zhuǎn)錄活性。

 

 

圖7CsMIXTA啟動(dòng)子核心區(qū)域P4作用下的LUC熒光表達(dá)

a~c：P4-LUC注射區(qū)域；d：pNC-Green-LUC空載注射區(qū)域(陰性對(duì)照)。

2.6 CsMIXTA全長(zhǎng)啟動(dòng)子作用下工業(yè)大麻糖葉瞬時(shí)表達(dá)分析

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，CsMIXTA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在工業(yè)大麻糖葉中的表達(dá)如圖8所示，在糖葉中的不具備分泌能力的單細(xì)胞表皮毛均未被染上色，而大量頭狀無(wú)柄腺毛被染成藍(lán)色；部分頭狀有柄腺毛的腺毛柄被染成藍(lán)色。

  

圖8CsMIXTA全長(zhǎng)啟動(dòng)子作用下的工業(yè)大麻GUS染色

a：?jiǎn)渭?xì)胞表皮毛；b：頭狀無(wú)柄腺毛；c：頭狀有柄腺毛。

2.7不同脅迫處理下工業(yè)大麻糖葉中CsMIXTA表達(dá)分析

分析發(fā)現(xiàn)CsMIXTA啟動(dòng)子區(qū)含有低溫誘導(dǎo)、ABA和GA響應(yīng)元件，本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)4℃、ABA和GA3處理下CsMIXTA在工業(yè)大麻糖葉中的表達(dá)量。由圖9可知，4℃處理24h，CsMIXTA的表達(dá)量較正常培養(yǎng)條件下表達(dá)水平上調(diào)46%；ABA處理下CsMIXTA基因的表達(dá)量上調(diào)70%；GA3處理下CsMIXTA基因的表達(dá)量上調(diào)65%。說(shuō)明，低溫、GA3及ABA均能增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性。

  

圖9 3種脅迫處理對(duì)CsMIXTA表達(dá)模式的影響

*、**、***分別表示在0.05、0.01和0.001水平上差異顯著。

 

3討論

目前工業(yè)大麻腺毛分子機(jī)制研究較少，只有3個(gè)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道。bHLH轉(zhuǎn)錄因子CsMYC4使番茄腺毛密度增加，且其受茉莉酸甲酯正向調(diào)控^[14]。HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子CsHDG5可能正向調(diào)控腺毛發(fā)育^[15]。本研究中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子CsMIXTA在煙草中過(guò)表達(dá)提高了煙草腺毛密度^[12]，因此CsMIXTA啟動(dòng)子研究具有重要意義。

啟動(dòng)子具有多種順式作用元件，對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控具有重要的作用，能夠影響基因的表達(dá)水平和空間特異性，有助于研究基因的表達(dá)調(diào)控與組織表達(dá)特異性^[16-18]。本研究克隆了CsMIXTA基因上游的2199bp啟動(dòng)子序列，預(yù)測(cè)分析其順式作用元件，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子序列除了具有啟動(dòng)子基本元件TATA-box和CAAT-box外，還存在低溫響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、晝夜節(jié)律控制響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件等順式作用元件，這與擬南芥、玉米等MYB基因家族啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測(cè)結(jié)果相似^[19,20]。我們的研究表明CsMIXTA基因可能受到多個(gè)因素的誘導(dǎo)表達(dá)。

啟動(dòng)子的核心區(qū)域在基因表達(dá)水平上起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，啟動(dòng)子缺失法常用于研究啟動(dòng)子的核心區(qū)域^[21]。為了探索CsMIXTA基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域，本研究將啟動(dòng)子全長(zhǎng)和5個(gè)5′端缺失片段融合進(jìn)了具有GUS基因的植物表達(dá)載體并瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)各個(gè)片段轉(zhuǎn)化的煙草進(jìn)行GUS染色，發(fā)現(xiàn)只有99bp的缺失片段P5沒(méi)有被染色，不具備啟動(dòng)子活性。因此我們推測(cè)CsMIXTA基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域位于P4與P5(-393~-99bp)之間，此外本研究還將P4片段連接了LUC基因在煙草中進(jìn)行表達(dá)，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該核心啟動(dòng)區(qū)具有轉(zhuǎn)錄活性。依據(jù)此核心區(qū)域我們了結(jié)合Softberry預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，確定CsMIXTA基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為鳥(niǎo)嘌呤(G)，位于ATG上游196bp處。除此之外，在除P5外各個(gè)片段侵染的煙草葉片的表皮毛都被染上了較深的藍(lán)色，表明CsMIXTA啟動(dòng)子具有組織特異性，可能控制著表皮毛的發(fā)育。

在植物腺毛中發(fā)揮功能的R2R3MYB家族基因，其啟動(dòng)子大部分能在腺毛中特異表達(dá)。青蒿中能夠促進(jìn)腺毛發(fā)育和青蒿素合成的AaMIXTA1基因的啟動(dòng)子在腺毛中的表達(dá)比在其它區(qū)域強(qiáng)^[9]。棉花中與表皮毛發(fā)育相關(guān)的基因GaMYB2的啟動(dòng)子在棉花、擬南芥、煙草的腺毛中都具有特異表達(dá)^[22]。前人研究發(fā)現(xiàn)CsMIXTA可能調(diào)控大麻雌性花器官中腺毛的發(fā)生和發(fā)育^[12]。為驗(yàn)證CsMIXTA啟動(dòng)子在工業(yè)大麻的組織表達(dá)模式，本研究將CsMIXTA啟動(dòng)子全長(zhǎng)融合進(jìn)了具有GUS基因的植物表達(dá)載體并侵染工業(yè)大麻糖葉。結(jié)果顯示在工業(yè)大麻糖葉中沒(méi)有分泌能力的單細(xì)胞表皮毛都沒(méi)有被染成藍(lán)色，葉表面、頭狀無(wú)柄腺毛和部分頭狀有柄腺毛的腺毛柄被染成了藍(lán)色，且頭狀無(wú)柄腺毛被染得更深。由于在大麻中頭狀有柄腺毛是從頭狀無(wú)柄腺毛發(fā)育而來(lái)的^[23]，因此CsMIXTA可能在工業(yè)大麻腺毛的生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要得作用。

在植物表皮毛發(fā)育過(guò)程中受到GA等植物激素的調(diào)控。GA主要是通過(guò)誘導(dǎo)DELLA降解，協(xié)同促進(jìn)毛狀體的形成，如擬南芥^[24]、棉花^[25]。而R2R3-MYB中的部分轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控赤霉素的含量，如青蒿中AaMYB1和AtMYB61通過(guò)積極影響酶的表達(dá)，將GA9轉(zhuǎn)化為生物活性的GA4[9]，菊花中CmMYB2通過(guò)與CmBBX24的相互作用改變細(xì)胞GA含量^[26]。本研究中使用GA3對(duì)工業(yè)大麻進(jìn)行脅迫處理，CsMIXTA基因顯著上調(diào)，表明該基因?qū)Τ嗝顾啬軌虍a(chǎn)生應(yīng)答，可能間接調(diào)控表皮毛發(fā)育。

研究表明低溫脅迫下番茄SlMYB96表達(dá)量升高，揭示了SlMYB96能夠響應(yīng)低溫脅迫，將其沉默后番茄植株抗寒性降低。青海茄參MYB轉(zhuǎn)錄因子McMYB-86在低溫處理的24h內(nèi)顯著上調(diào)表達(dá)^[27]。水稻OsMYBR1的啟動(dòng)子區(qū)域含有ABRE，并且OsMYBR1過(guò)表達(dá)水稻對(duì)ABA的抗性更強(qiáng)，揭示了OsMYBR1過(guò)表達(dá)水稻通過(guò)ABA介導(dǎo)的途徑上調(diào)脅迫響應(yīng)基因增強(qiáng)耐旱性^[28]。本研究4℃、ABA對(duì)工業(yè)大麻進(jìn)行脅迫處理，并進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示CsMIXTA基因的相對(duì)表達(dá)量在這2個(gè)處理?xiàng)l件下都顯著上調(diào)，表明CsMIXTA基因能對(duì)低溫與ABA處理產(chǎn)生應(yīng)答。

 

4結(jié)論

本研究克隆了工業(yè)大麻CsMIXTA基因啟動(dòng)子，利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)了其可能存在的順式作用元件；通過(guò)GUS染色找到了CsMIXTA啟動(dòng)子的核心區(qū)域位于-393~-99bp；通過(guò)啟動(dòng)子瞬時(shí)轉(zhuǎn)化工業(yè)大麻糖葉，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子在腺毛中特異表達(dá)；對(duì)工業(yè)大麻糖葉進(jìn)行非生物脅迫處理，發(fā)現(xiàn)低溫、GA3及ABA均增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，這為深入探究CsMIXTA基因的功能及調(diào)控機(jī)制提供了理論和試驗(yàn)依據(jù)。

 

References

[1] 李秋實(shí),  孟瑩,  陳士林.  藥用大麻種質(zhì)資源分類與研究策略. 中國(guó)中藥雜志, 2019, 44: 4309–4316.

Li Q S, Meng Y, Chen S L. A new Cannabis germplasm classification system and research strategies of non-psychoactive medicinal cannabis. China J Chin MaterMed, 2019, 44: 4309–4316 (in Chinese with English abstract).

[2] Goncalves J, Rosado T, Soares S, SimaoAY, Caramelo D, LuisA, Fernandez N, Barroso M, Gallardo E, Duarte A P. Cannabis and its secondary metabolites: their use as therapeutic drugs, toxicological aspects, and analytical determination. Medicines (Basel), 2019, 6: 31.

[3] Tanney CA S, BackerR, GeitmannA, Smith D L L. Cannabis glandular trichomes: a cellular metabolite factory. Front Plant Sci, 2021, 12: 1923.

[4] BackerR, Schwinghamer T, Rosenbaum P, McCarty V, Bilodeau S E, LyuD, Ahmed M B, Robinson G, Lefsrud M, Wilkins O, Smith D L. Closing the yield gap for cannabis: a meta-analysis of factors determining cannabis yield. Front Plant Sci, 2019, 10: 495.

[5] Burgel L, Hartung J, Schibano D, Graeff-Hoenninger S. Impact of different phytohormones on morphology, yield and cannabinoid content of Cannabis sativa L. Plants (Basel), 2020, 9: 725.

[6] Chezem W R, Clay N K. Regulation of plant secondary metabolism and associated specialized cell  development by MYBs and bHLHs.Phytochemistry, 2016, 131: 26–43.

[7] Brockington S F, Alvarez-Fernandez R, Landis J B, Alcorn K, Walker R H, Thomas M M, Hileman L C, Glover B J. Evolutionary analysis of the MIXTA gene family highlights potential targets for the study of cellular differentiation. Mol BiolEvol, 2013, 30: 526–540.

[8] Matias-Hernandez L, Jiang W, Yang K, Tang K, Brodelius P E, Pelaz S. AaMYB1 and its orthologue AtMYB61 affect terpene metabolism and trichome development in Artemisia annua and Arabidopsis thaliana. Plant J, 2017, 90: 520–534.

[9] ShiP, Fu X, Shen Q, Liu M, Tang K. The roles of AaMIXTA1 in regulating the initiation of glandular trichomes and cuticle biosynthesis in Artemisia annua. New Phytol, 2017, 217: 261–276.

[10] Ewas M, Gao Y, Wang S, Liu X, Zhang H, Nishawy E M E, Ali F, ShahzadR, ZiafK, Subthain H. Manipulation of SlMXl for enhanced carotenoids accumulation and drought resistance in tomato. Sci Bull, 2016, 61: 1413–1418.

[11] Chalvin C, Drevensek S, Dron M, Bendahmane A, Boualem A. Genetic control of glandular trichome development.  Trends Plant Sci, 2020, 25:477–487.

[12] Haiden S R, Apicella P V, Ma Y, Berkowitz G A. Overexpression of CsMIXTA, a transcription factor from Cannabis sativa, increases glandular trichome density in tobacco leaves. Plants (Basel), 2022, 11: 1519.

[13] Alter H, Peer R, DombrovskyA, Flaishman M, Spitzer-Rimon B. Tobacco rattle virus as a tool for rapid reverse genetics screens and analysis of gene function in Cannabis sativa L. Plants (Basel), 2022, 11: 327.

[14] Huang X, Chen W, Zhao Y, Chen J, Ouyang Y, Li M, Gu Y, Wu Q, Cai S, Guo F, Zhu P, Ao D, You S, Vasseur L, Liu Y. Deep learning-based quantification and transcriptomic profiling reveal a methyl jasmonate-mediated glandular trichome formation pathway in Cannabis sativa. Plant J,2024.

[15] Ma G, Zelman AK, Apicella PV, Berkowitz G. Genome-wide identification and expression analysis of homeodomain leucine zipper subfamily IV(HD-ZIP IV) gene family in Cannabis sativa L. Plants (Basel), 2022, 11: 1307.

[16] 張春曉,  王文棋,  蔣湘寧,  陳雪梅.  植物基因啟動(dòng)子研究進(jìn)展.  遺傳學(xué)報(bào), 2004, 31: 1455–1464.

Zhang CX, Wang WQ, Jiang XN, Chen XM. Review on plant gene promoters. J Genet Genomics, 2004, 31: 1455–1464 (in Chinese with English abstract).

[17] 馬倩, 馬寶月,  穆波,  馬慧.  植物基因啟動(dòng)子的克隆及分析的研究進(jìn)展. 中國(guó)農(nóng)業(yè)文摘-農(nóng)業(yè)工程, 2018, 30(3): 23–29.

Ma Q, Ma B Y, Mu B, Ma H. Research progress on cloning and analysis of plant gene promoter. Agric Sci Eng China, 2018, 30(3): 23–29 (in Chinese with English abstract).

[18] 毛燕, 鄭名敏, 牟成香, 謝吳兵, 唐琦. 滲透脅迫下玉米自然反義轉(zhuǎn)錄本cis-NATZmNAC48啟動(dòng)子的功能分析. 作物學(xué)報(bào), 2024, 50: 354–362.

Mao Y, Zheng M M, Mou C X, Xie W B, Tang Q. Function analysis of the promoter of natural antisense transcript cis-NATZmNAC48  in maize under osmotic stress. Acta Agron Sin, 2024, 50: 354–362 (in Chinese with English abstract).

[19] Ambawat S, Sharma P, YadavN R, Yadav R C J P. MYB transcription factor genes as regulators for plant responses: an overview. PhysiolMol Biol Plants, 2013, 19: 307–321.

[20] Du H, Feng B R, Yang S S, Huang YB, TangY X. The R2R3-MYB transcription factor gene family in maize. PLoS One, 2012, 7: e37463.

[21] 周悅, 趙志華, 張宏寧, 孔佑賓. 大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14啟動(dòng)子克隆與功能分析. 作物學(xué)報(bào), 2022, 48: 590–596.

Zhou Y, Zhao Z H, Zhang HN, Kong YB. Cloning and functional analysis of the promoter of purple acid phosphatase gene GmPAP14 in soybean. ActaAgron Sin, 2022, 48: 590–596 (in Chinese with English abstract).

[22] Shangguan X X, Xu B, Yu Z X, Wang L J, Chen XY. Promoter of a cotton fibre MYB gene functional in trichomes of Arabidopsis and glandular trichomes of tobacco. J Exp Bot, 2008, 59: 3533–3542.

[23] Livingston S J, Quilichini T D, Booth J K, Wong D C J, Rensing K H, Laflamme-Yonkman J, Castellarin S D, Bohlmann J, Page J E, Samuels A L. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. Plant J, 2020, 101: 37–56.

[24] Maes L, Inze? D, Goossens A. Functional specialization of the TRANSPARENT TESTA GLABRA1 network allows differential hormonal control of laminal and marginal trichome initiation in Arabidopsis rosette leaves. Plant Physiol, 2008, 148: 1453–1464.

[25] Xia X C, Hu Q Q, Li W, Chen Y, Han LH, Tao M, Wu WY, LiX B, Huang GQ. Cotton (Gossypium hirsutum) AZ3 and SLR1 function in jasmonate and gibberellin mediated epidermal cell differentiation and elongation. Plant Cell Tissue Organ Cult, 2018, 133: 249–262.

[26] Zhu L, GuanY, Liu Y, Zhang Z, Jaffar MA, Song A, Chen S, Jiang J, Chen F. Regulation of flowering time in chrysanthemum by the R2R3 MYB transcription factor CmMYB2 is associated with changes in gibberellin metabolism. HorticRes, 2020, 7: 96.

[27] 趙悅, 趙艷艷, 李強(qiáng)鋒, 段紅俊. 青海茄參MYB轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學(xué)及應(yīng)答低溫脅迫分析. 分子植物育種, 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)[2023-12-06],https://link.cnki.net/urlid/46.1068.s.20231205.1916.027.

Zhao Y, Zhao Y Y, Li Q F, Duan H J. Bioinformatics analysis of MYB transcription factor family in mandragora chinghaiensis under low temperature induction. Mol Plant Breed, Published online [2023-12-06], https://link.cnki.net/urlid/46.1068.s.20231205.1916.027 (in Chinese with English abstract).

[28] Yin X, Cui Y, Wang M, Xia X. Overexpression of a novel MYB-related transcription factor, OsMYBR1, confers improved drought tolerance and decreased ABA sensitivity in rice. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 490: 1355–1361.

 

 

文章摘自：周智滿,張小雨,高峰,等.工業(yè)大麻腺毛發(fā)育基因CsMIXTA啟動(dòng)子克隆及功能分析[J/OL].作物學(xué)報(bào),1-13[2024-08-19].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20240709.1425.004.html.