摘 要：對采用高效液相色譜法（HPLC）測定工業(yè)大麻中大麻二酚（CBD）和四氫大麻酚（THC）的不確定度進(jìn)行評估，依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF1059.1-2012）和《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006-2019），建立了HPLC法測定工業(yè)大麻中CBD和THC的不確定度評定的數(shù)學(xué)模型，逐層對測定過程中各不確定度來源進(jìn)行分析，對各不確定度分量進(jìn)行計(jì)算，再對測定結(jié)果進(jìn)行合成不確定度和擴(kuò)展不確定度評估。結(jié)果表明，檢測CBD過程中，不確定度來源的主要因素所占分量由大到小排序?yàn)椋簶?biāo)準(zhǔn)溶液配制>標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合>重復(fù)次數(shù)>提取>樣品稱量；檢測THC過程中，不確定度來源的主要因素所占分量由大到小排序?yàn)椋簶?biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合>重復(fù)次數(shù)>標(biāo)準(zhǔn)溶液配制>提取>樣品稱量。CBD結(jié)果平均值為0.166g/100g，擴(kuò)展不確定度為0.0312g/100g，取值結(jié)果為X=（0.166±0.0312）g/100g，包含因子k=2；THC平均值為0.0522g/100g，擴(kuò)展不確定度為0.00344g/100g，取值結(jié)果為X=（0.0522±0.00344）g/100g,包含因子k=2。此方法適用于類似條件下CBD和THC測定不確定度的評定。
關(guān)鍵詞：不確定度評定；工業(yè)大麻；大麻二酚；四氫大麻酚；高效液相色譜法
工業(yè)大麻又稱大麻、火麻和漢麻[1]，允許種植的大麻品種為四氫大麻酚（THC）含量小于0.3%。目前應(yīng)用于紡織、食品、化妝品和制藥等多種行業(yè)，應(yīng)用范圍廣，經(jīng)濟(jì)價(jià)值大[2-7]。大麻葉中含有多種大麻酚類衍生物，已分離到15種以上，最主要且含量較高的是大麻二酚和四氫大麻酚[8]。具有止痛、抗炎、安眠、鎮(zhèn)痙和鎮(zhèn)靜等作用[9-15]。大麻二酚是工業(yè)大麻品質(zhì)評價(jià)的重要指標(biāo)，四氫大麻酚是工業(yè)大麻質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，為了確保檢測結(jié)果可信，對工業(yè)大麻中大麻二酚和四氫大麻酚檢測技術(shù)進(jìn)行不確定度評定尤為重要。
測量不確定度評定與檢測結(jié)果的合格判定直接相關(guān)[16]，對量值溯源和方法確認(rèn)具有重要意義[17]?！稒z測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》(GB/T 27025-2019)明確規(guī)定[18]，當(dāng)檢測結(jié)果處于臨界值或客戶有需求時(shí)，須提供檢測結(jié)果的不確定度。
本研究依據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006-2019）和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1-2012）規(guī)定的方法，對HPLC法測定大麻中CBD和THC的不確定度進(jìn)行評定，分析影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性的各種因素，旨在相關(guān)檢測過程中，盡可能控制不準(zhǔn)確性因素的影響，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
1 材料與方法
1.1 材料
整株工業(yè)大麻，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、吉林省麻類工程研究中心和吉林省麻類科技創(chuàng)新中心提供。
1.2 試劑
四氫大麻酚（THC）標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度1.0 mg/mL）和大麻二酚（CBD）標(biāo)準(zhǔn)品（濃度1.0 mg/mL）（美國Sigma-Aldrich公司），乙腈、甲醇和色譜純（美國Thermo Fisher公司），95%乙醇，分析純（上海國藥集團(tuán)），試驗(yàn)用水均為超純水，0.45μm濾膜（丹東百特儀器有限公司）。
1.3 儀器
1260Ⅱ高效液相色譜儀：安捷倫有限公司；VF 611超純水系統(tǒng)：德國 SARTORIUS公司；BT 124S電子天平（±0.001g）：中國賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。
1.4 方法
1.4.1 待測液制備
稱取100目的試樣1g（精確至0.01g）于回流瓶中，加入20mL 95%乙醇回流60min，重復(fù)一次，合并兩次提取液，過濾，減壓回收乙醇，用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，過0.45μm濾膜，上機(jī)測定。
1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制
大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取大麻二酚（CBD標(biāo)準(zhǔn)品：1.0mg，用2mL甲醇溶解，制成0.5mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于2~4℃條件下儲(chǔ)存，有效期為1年。
四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確吸取1mg/mL的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于-20℃條件下儲(chǔ)存，有效期為3年。
1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制
大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取適當(dāng)體積的大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋，配制成0.02mg/mL、0.04 mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。于2~4℃條件下儲(chǔ)存，有效期為1個(gè)月。
四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取適當(dāng)體積的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋，配制成0.002 mg/mL、0.004 mg/mL、0.006 mg/mL、0.008 mg/mL、0.010 mg/mL、0.020mg/mL、0.040 mg/mL、0.060mg/mL、0.080mg/mL、0.10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。于-20℃條件下儲(chǔ)存，有效期為6個(gè)月。
1.4.4 色譜條件
色譜柱：C18柱，柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒度3.5μm；或者性能相當(dāng)?shù)纳V柱。
柱溫：35℃。
流動(dòng)相：乙腈-水（68∶32，v/v）。
流動(dòng)相流速：1.0mL/min。
進(jìn)樣體積：10μL。
1.5 數(shù)學(xué)模型的建立
大麻二酚和四氫大麻酚含量計(jì)算公式：
式中：X為試樣中大麻二酚和四氫大麻酚含量（g/100g），C 為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得大麻二酚和四氫大麻酚的濃度（mg/mL），V為試樣定容體積（mL），m為試樣質(zhì)量（g），f為稀釋倍數(shù)；10為單位換算。
2 結(jié)果與分析
2.1 來源分析
根據(jù) JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[19]，按照檢測流程和數(shù)學(xué)模型，不確定度的來源見圖1。
（1）重復(fù)次數(shù)引入的不確定度 Urel(f)；
（2）樣品稱量引入的不確定度 Urel(M1)；
（3）提取過程引入的不確定度 Urel(C提)；
（4）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度 Urel(C標(biāo))；
（5）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合求濃度引入的不確定度 Urel(C擬)。
圖1 不確定度來源與分析
2.2 不確定度分量的評定
2.2.1 重復(fù)次數(shù)引入的不確定度Urel(f)
采用同一大麻樣品、同一檢驗(yàn)員、同一臺(tái)儀器重復(fù)處理測定10次，用標(biāo)準(zhǔn)偏差評定重復(fù)次數(shù)引入的不確定度，測定結(jié)果見表1和表2。
由表1計(jì)算大麻二酚μ(fCBD)和 Urel(fCBD)為：
表1 大麻中大麻二酚含量測定結(jié)果
注：平均值：0.166g/100g，標(biāo)準(zhǔn)偏差：0.000483g/100g
表2 大麻中四氫大麻酚含量測定結(jié)果
注：平均值：0.0522g/100g，標(biāo)準(zhǔn)偏差：0.0000876g/100g
由表2計(jì)算四氫大麻酚μ(fTHC)和U(fTHC)為：
2.2.2樣品稱量引入的不確定度U(M)
樣品稱量引入的不確定度主要是電子天平。電子天平最大允許誤差為+0.15 mg,按矩形分布計(jì)算,則電子天平引人的不確定度μ(M,)為:
電子天平引人的相對不確定度 U.(M,)為:
2.2.3 提取過程引入的不確定度U.(C”)
提取過程中引人的不確定度主要是容量器具(25m量筒和25m容量瓶,根據(jù) JG 196-2006《常用玻璃量器》…,其不確定度和相對不確定度計(jì)算結(jié)果見表3。
表3 容量器具引入的相對不確定度
2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度 Urel(C 標(biāo))
2.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度 Urel(ρ1)
由大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可知，標(biāo)準(zhǔn)品純度≥ 98%，按正態(tài)分布計(jì)算，取3。標(biāo)準(zhǔn)品純度不確定度 Urel(ρ1CBD)為：
由四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可知，標(biāo)準(zhǔn)品純度≥98%，按正態(tài)分布計(jì)算，取3。標(biāo)準(zhǔn)品純度不確定度 Urel(ρ1THC)為：
2.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的不確定度 Urel(ρ2)
稱量 1.0 mg 大麻二酚引入的相對不確定度Urel(mCBD),計(jì)算方法同 2.2.2。
配制大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用 2 mL 容量瓶，引入的相對不確定度 Urel(V2（) 見表 3）。
配制四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用1 mL單標(biāo)吸管和5 mL容量瓶，引入的相對不確定度Urel(THC)見表3。
2.2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的不確定度Urel(ρ3)
配制標(biāo)準(zhǔn)溶液過程中使用1mL單標(biāo)吸管和1mL容量瓶，各自引入的相對不確定度見表3。配制大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的相對不確定度Urel(ρ3CBD)為：
配制四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的相對不確定度Urel(ρ3THC)為：
標(biāo)準(zhǔn)溶液配制合成不確定度Urel(C 標(biāo))為：
2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合求濃度引入的不確定度Urel(C擬)
大麻二酚采用6個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。四氫大麻酚采用10個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。相應(yīng)的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度用最小二乘法進(jìn)行擬合，結(jié)果見表4。
表4 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)
擬合曲線求樣品溶液中大麻二酚平均濃度產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為μ(C 擬)：
式中：SR為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差，Ai為各溶液峰面積，C為樣品溶液的平均質(zhì)量濃度，C為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的平均質(zhì)量濃度，Ci為各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值，a為回歸方程斜率，b為截距，P為樣品平行測定次數(shù)，n為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的點(diǎn)數(shù)。
大麻二酚最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度引入的相對不確定度 Urel(CCBD)為：
擬合曲線求樣品溶液中四氫大麻酚平均濃度產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為μ(C 擬)：
四氫大麻酚最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度引入的相對不確定度 Urel(CTHC)為：
2.3 大麻中大麻二酚和四氫大麻酚含量測定的合成不確定度和擴(kuò)展不確定度
大麻二酚合成不確定度 Urel(總 CBD)為：
四氫大麻酚合成不確定度 Urel(總 THC)為：
大麻中大麻二酚含量為 0.166 g/100 g，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：
大麻中四氫大麻酚含量為 0.052 2 g/100 g，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：
2.4 不確定度分量影響比較各不確定度分量的比較結(jié)果見圖2和圖3。
圖2 大麻二酚合成相對不確定度分量比較
圖3 四氫大麻酚合成相對不確定度分量比較
3 結(jié)論
CBD結(jié)果平均值為0.166g/100g，擴(kuò)展不確定度為0.0312g/100 g，取值結(jié)果為X=（0.166±0.0312）g/100g；THC結(jié)果平均值為0.0522g/100g，擴(kuò)展不確定度為0.00344g/100g，取值結(jié)果為X=（0.0522±0.00344）g/100g。
測定CBD過程中引入不確定度的各分量影響因素排序?yàn)椋簶?biāo)準(zhǔn)溶液配制>標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合>重復(fù)次數(shù)>提取>樣品稱量；測定THC過程中引入不確定度的各分量影響因素排序?yàn)椋簶?biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合>重復(fù)次數(shù)>標(biāo)準(zhǔn)溶液配制>提取>樣品稱量。
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文章摘自：張鑫,劉麗宅,王多伽,等.HPLC法測定工業(yè)大麻中大麻二酚和四氫大麻酚的不確定度評定[J].東北農(nóng)業(yè)科學(xué),2024,49(05):81-86.
