摘  要：本發(fā)明公開了一種工業(yè)大麻染色體加倍的方法。本發(fā)明提供了一種工業(yè)大麻染色體加倍方法，包括如下步驟：用氨磺樂靈或以氨磺樂靈為活性成分的除草劑對工業(yè)大麻幼苗進行染色體加倍處理，培養(yǎng)，得到染色體加倍工業(yè)大麻，實現(xiàn)工業(yè)大麻染色體加倍；所述氨磺樂靈的使用濃度為35µM。本發(fā)明的實驗證明，使用主要成分為氨磺樂靈的商品化Surflan處理工業(yè)大麻幼苗的生長點，操作簡單并且獲得工業(yè)大麻四倍體的效率較高。

 

技術(shù)要點

1.一種工業(yè)大麻染色體加倍方法，包括如下步驟：

用氨磺樂靈或以氨磺樂靈為活性成分的除草劑對工業(yè)大麻幼苗進行染色體加倍處理，培養(yǎng)，得到染色體加倍工業(yè)大麻，實現(xiàn)工業(yè)大麻染色體加倍；所述氨磺樂靈的使用濃度為35µM。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述染色體加倍處理的時機為在所述工業(yè)大麻幼苗生長至雙子葉間的生長點漏出時；或所述染色體加倍處理的時機為工業(yè)大麻的種子播種后培養(yǎng)60?65小時。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述用氨磺樂靈或以氨磺樂靈為活性成分的除草劑對工業(yè)大麻幼苗進行染色體加倍處理為將所述氨磺樂靈或以氨磺樂為活性成分的除草劑滴加到所述工業(yè)大麻幼苗的生長點。

4.根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一所述的方法，其特征在于：所述染色體加倍處理的次數(shù)為2次，且在同一天進行2次處理。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述2次處理的時間點為在所述工業(yè)大麻幼苗一天中細胞分裂最旺盛的兩個時間點；或，所述2次處理的時間點為清晨和中午。

6.根據(jù)權(quán)利要求1?5中任一所述的方法，其特征在于：

所述染色體加倍處理為將除草劑工作液滴加到所述工業(yè)大麻幼苗的生長點，所述除草劑工作液中氨磺樂靈的含量為35µM。

7.根據(jù)權(quán)利要求1?6中任一所述的方法，其特征在于：所述染色體加倍工業(yè)大麻的染色體倍數(shù)比所述工業(yè)大麻幼苗多。

8.氨磺樂靈或以氨磺樂靈為活性成分的除草劑在工業(yè)大麻染色體加倍中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求1?7中任一所述的方法在工業(yè)大麻多倍體育種中的應(yīng)用。

 

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種工業(yè)大麻染色體加倍的方法。

 

背景技術(shù)

大麻（Cannabis sativa L .subsp .sativa），是桑科植物大麻亞科大麻屬，一年生草本植物。大麻干品中四氫大麻酚（THC）含量低于0.3%，即為工業(yè)大麻。工業(yè)大麻主要應(yīng)用于農(nóng)業(yè)種植、紡織、服裝、造紙、生物能源、醫(yī)藥和飼料等方面。工業(yè)大麻提取物中含有活性物質(zhì)，可用于抗癌、抗艾滋病、治療神經(jīng)疾病等；其天然抑菌效果，可廣泛應(yīng)用于抗菌功能纖維、天然防腐劑、殺菌藥物及噴劑、個人清潔用品等；另外，工業(yè)大麻提取物在抗紫外線，抗氧化活性上效果顯著，在化妝品領(lǐng)域可以起到抗紫外線、去皺、祛斑等效果。

多倍體育種是根據(jù)育種目標人為地改變植物染色體倍性進而選育新種質(zhì)或新品種的育種方法。對大麻進行多倍體種質(zhì)的誘導(dǎo)，是工業(yè)大麻種質(zhì)創(chuàng)新及新品種選育的一種有效途徑，有望提高大麻的藥效價值或改良其他品質(zhì)性狀。目前多倍體誘導(dǎo)多報道使用秋水仙素，其毒性大，成本高，誘變效率低，然而，直接利用商業(yè)化除草劑誘變工業(yè)大麻幼苗為四倍體尚未見報道。

 

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供提供一種高效工業(yè)大麻染色體加倍方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中在工業(yè)大麻多倍體育種過程中處理試劑毒性大，誘導(dǎo)效率低等問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明第一方面提供了一種工業(yè)大麻染色體加倍方法，包括如下步驟：

用氨磺樂靈或以氨磺樂靈為活性成分的除草劑對工業(yè)大麻幼苗進行染色體加倍處理，培養(yǎng)，得到染色體加倍工業(yè)大麻，實現(xiàn)工業(yè)大麻染色體加倍；所述氨磺樂靈的使用濃度為35µM。

上文所述方法中，所述染色體加倍處理的時機為在所述工業(yè)大麻幼苗生長至雙子葉間的生長點漏出時；或所述染色體加倍處理的時機為工業(yè)大麻的種子播種后培養(yǎng)60?65小時。

上文中，所述工業(yè)大麻幼苗生長至雙子葉間的生長點漏出時具體可為所述工業(yè)大麻幼苗生長至雙子葉沒有完全伸開（用鑷子撥開可以看到生長點）或者雙子葉剛伸開漏出生長點時。

上文所述方法中，所述用氨磺樂靈或以氨磺樂靈為活性成分的除草劑對工業(yè)大麻幼苗進行染色體加倍處理為將所述氨磺樂靈或以氨磺樂為活性成分的除草劑滴加到所述工業(yè)大麻幼苗的生長點。

上文以氨磺樂為活性成分的除草劑的滴加量為1滴除草劑工作液。

上文所述方法中，所述染色體加倍處理的次數(shù)為2次，且在同一天進行2次處理。

上文所述方法中，所述2次處理的時間點為在所述工業(yè)大麻幼苗一天中細胞分裂最旺盛的兩個時間點；

或，所述2次處理的時間點為清晨和中午。

上文中，所述2次處理的時間點具體可為中國北方的清晨和中午。

上文中，所述2次處理的時間點具體可為中國山東濰坊的清晨和中午。

上文所述方法中，所述染色體加倍處理為將除草劑工作液滴加到所述工業(yè)大麻幼苗的生長點，所述除草劑工作液中氨磺樂靈的含量為35µM。

上文中，以氨磺樂靈為活性成分的除草劑在本發(fā)明的實施例中以除草劑Surflan 為例，配置除草劑工作液：除草劑Surflan使用助溶劑稀釋158倍成工作母液，再將工作母液用無菌水稀釋250倍至工作液，工作液中氨磺樂靈的含量為35 µM。

上文中，所述助溶劑可為氘代二甲亞砜。

上文所述方法中，所述染色體加倍工業(yè)大麻的染色體倍數(shù)比所述工業(yè)大麻幼苗多。

上文所述方法中，所述工業(yè)大麻幼苗是通過工業(yè)大麻種子播種培養(yǎng)后獲得。

上述播種培養(yǎng)的條件為每天16h光照（光照強度為2500lx），黑暗8h，培養(yǎng)溫度22℃，空氣的相對濕度為60%的條件下培養(yǎng)。

第二方面，本發(fā)明提供了氨磺樂靈或以氨磺樂靈為活性成分的除草劑在工業(yè)大麻染色體加倍中的應(yīng)用。

第三方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的方法在工業(yè)大麻多倍體育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的實驗證明，使用主要成分為氨磺樂靈的商品化Surflan處理工業(yè)大麻幼苗的生長點，操作簡單并且獲得工業(yè)大麻四倍體的效率較高。

附圖說明

圖1為實施例1生長點處理后培養(yǎng)3周植株對比。

  

圖1

圖2為實施例1流式細胞儀檢測結(jié)果：其中左圖：二倍體DNA含量；右圖：四倍體DNA 含量。

  

圖2

圖3為實施例1生長點處理后培養(yǎng)10周植株對比。

  

圖3

圖4為35µM處理的結(jié)果。

  

圖4

圖5為70µM處理的結(jié)果。

  

圖5

圖6為105µM處理的結(jié)果。

  

圖6

圖7為35µM處理1次的結(jié)果。

  

圖7

圖8為35µM處理2次的結(jié)果。

  

圖8

圖9為工業(yè)大麻處理植株時期。

  

圖9

 

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。以下提供的實施例可作為本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員進行進一步改進的指南，并不以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明的限制。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

如無特殊說明，以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

下面實施例中的工業(yè)大麻HYJL?18來自濰坊市華以農(nóng)業(yè)科技有限公司。

下面實施例是在山東省濰坊市2023年2月進行，北緯35°41′至37°26′，東經(jīng)118°10′至120°01′。

實施例1、工業(yè)大麻染色體加倍方法一、材料和試劑的處理

1、工業(yè)大麻播種

將工業(yè)大麻種子直接播種到32孔穴盤中，穴盤中培養(yǎng)基質(zhì)是椰土基質(zhì)與蛭石1:1 混合，加少許水拌勻，做到“團不滴水，散則成沙”狀態(tài)，將種子埋入基質(zhì)1/2處，上部用基質(zhì)填滿穴盤，然后用手壓實基質(zhì)，有利于出苗一致。在每天16 h光照（光照強度為2500 lx），黑暗8 h，培養(yǎng)溫度22℃，空氣的相對濕度為60%的條件下培養(yǎng)。

2、試劑配制

商業(yè)化除草劑Surflan*A.S（Dow AgroSciences LLC，D02?083?012），有效成分為質(zhì)量體積比（每加侖4磅）40.4%的氨磺樂靈（分子式為 C12H18N4O6S）。

將除草劑Surflan用助溶劑氘代二甲亞砜(Sigma?Aldrich，151874)助溶至8.75 mM，再用無菌水稀釋250倍至氨磺樂靈的終濃度35 µM，得到除草劑工作液，其中氨磺樂靈的濃度為35 µM。

每1mL除草劑工作液配方：0.025 µL除草劑Surflan、3.975 µL助溶劑和996 µL的水組成。

二、除草劑Surflan加倍工業(yè)大麻染色體

氨磺樂靈處理組:待觀察上述一的1培養(yǎng)的工業(yè)大麻幼苗破土，生長至雙子葉剛剛伸開漏出生長點（如圖9所示，即在播種后60小時），在大麻一天細胞分裂最旺盛的兩個時間點：清晨7:00和中午13:00，分別在工業(yè)大麻幼苗生長點（兩個子葉之間的連接處）用10 µL 量程移液器滴加7µL（剛好1滴）上述一的2制備的除草劑工作液，繼續(xù)正常培養(yǎng)，正常培養(yǎng)條件：培養(yǎng)光照2500 lx，16 h，黑暗8 h，培養(yǎng)溫度22℃，空氣的相對濕度為60%；正常培養(yǎng)3周觀察。

未處理對照組：以未滴加除草劑工作液的工業(yè)大麻作為對照。

結(jié)果如圖1所示，可以看出，與未處理對照組植株相比，氨磺樂靈處理組（箭頭所示）得到植株明顯矮小。

三、染色體倍性鑒定

將上述二獲得氨磺樂靈處理組處理后5周的矮小植株移栽在培養(yǎng)盆正常培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)光照2500 lx，16 h，黑暗8 h，培養(yǎng)溫度22℃，空氣的相對濕度為60%；正常培養(yǎng)10周觀察。將上述二的未處理對照組的植株也進行移栽培養(yǎng)，得到對照組植株。

結(jié)果如圖3所示，可以看出，與對照組植株相比，氨磺樂靈組處理植株移栽后植株（圖中記作四倍體）仍然矮小。

將上述移栽后培養(yǎng)10周的各組植株進行染色體倍性鑒定，通過流式細胞儀檢測。

流式細胞儀檢測方法和參數(shù)：

1、取新鮮待測樣本（葉片）0.2g，置于培養(yǎng)皿中；

2、取CyStain UV Precise P試劑盒（Sysmex，目錄號05?5002）中的細胞核裂解液500µL 加于樣本周圍，用鋒利刀片將切碎，以充分提取出完整的細胞核，提取時間60秒；

3、將培養(yǎng)皿中的液體用50µm celltrics濾網(wǎng)過濾至樣品管中；

4、向樣品管中加入CyStain UV Precise P試劑盒中的DAPI熒光染液2000µL，避光染色2分鐘；

5、上機測試。

檢測儀器：Sysmex Partec品牌的CyFlow Space流式細胞儀。

實驗原理是：首先游離細胞核，然后用熒光染液將細胞核染色體上的堿基染色，再用儀器檢測細胞核里被染色的堿基發(fā)出的熒光強度，結(jié)果的橫坐標是熒光強度，縱坐標是細胞數(shù)量。熒光強度與DNA含量成正比，所以可計算得出樣本不同的倍性。

橫坐標信號值在400的為四倍體植株，橫坐標信號值在200的為二倍體植株。

結(jié)果如圖2所示，左圖為對照組，其為二倍體DNA含量；右圖為氨磺樂靈組處理組，其為四倍體DNA含量，可以看出，氨磺樂靈組移栽后的植株為四倍體植株，未處理對照組移栽后的植株為二倍體植株。

本實驗共處理24株工業(yè)大麻，獲得四倍體的工業(yè)大麻為3株，成功率為12.5%。

實施例2、工業(yè)大麻染色體加倍方法的條件摸索

一、除草劑工作液濃度摸索

1、材料和試劑的處理

與實施例1的方法相同，不同的僅為將實施例1的一的2中除草劑Surflan用助溶劑助溶至8.75mM，再用無菌水稀釋至氨磺樂靈的終濃度分別為35µM、75µM和105µM，作為除草劑工作液。

2、除草劑Surflan加倍工業(yè)大麻染色體

按照實施例1的二的方法，僅在清晨7:00滴加1下不同濃度的除草劑工作液1次。

移栽后正常培養(yǎng)10周觀察。

結(jié)果如圖4?6和表1所示，可以看出，35µM致死率低。

表1為不同濃度除草劑工作液組

 

二、除草劑工作液處理次數(shù)摸索

與實施例1的方法基本相同，不同的僅為按照實施例1的二的方法，僅在清晨7:00 滴加35 µM除草劑工作液1次。以按照實施例1的二的方法滴加2次35 µM除草劑工作液作為對比。

移栽后正常培養(yǎng)10周觀察。

結(jié)果如圖7?8和表2所示，可以看出，35 µM處理2次，四倍體成功率明顯提高。

表2為除草劑工作液不同處理次數(shù)

  

  

以上對本發(fā)明進行了詳述。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的宗旨和范圍，以及無需進行不必要的實驗情況下，可在等同參數(shù)、濃度和條件下，在較寬范圍內(nèi)實施本發(fā)明。雖然本發(fā)明給出了特殊的實施例，應(yīng)該理解為，可以對本發(fā)明作進一步的改進。總之，按本發(fā)明的原理，本申請欲包括任何變更、用途或?qū)Ρ景l(fā)明的改進，包括脫離了本申請中已公開范圍，而用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)進行的改變。按以下附帶的權(quán)利要求的范圍，可以進行一些基本特征的應(yīng)用。

 

文章摘自國家發(fā)明專利，一種工業(yè)大麻染色體加倍的方法，發(fā)明人：王亮，孫希祿，王喜萍，張婷，申請?zhí)枺?/font>202411119803.9，申請日：2024.08.15