摘 要：工業(yè)大麻miR156基因家族在堿性鹽脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，為探究工業(yè)大麻miR156基因家族響應(yīng)NaHCO3脅迫的分子機(jī)制，以鹽堿耐受型工業(yè)大麻品種火麻一號(hào)為供試材料，利用生物信息學(xué)和qRT-PCR方法，對(duì)miR156基因家族進(jìn)行分析。結(jié)果表明，工業(yè)大麻miR156家族基因與蘆筍、野草莓、蘋果和大豆的親緣關(guān)系較近。2條工業(yè)大麻pre-miR156序列，產(chǎn)生一條相同的miR156成熟體，且成熟體的保守性較高。在NaHCO3脅迫后的24h內(nèi)，工業(yè)大麻miR156基因表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)。該結(jié)果為進(jìn)一步研究工業(yè)大麻miR156基因家族及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)。
關(guān)鍵詞：工業(yè)大麻；miR156基因家族；NaHCO3脅迫
MicroRNAs（miRNA）是真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA，長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸。作為一種進(jìn)化上保守的miRNA，在增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫耐受性方面起著重要作用[1]。隨著高通量測(cè)序（Highthroughtputsequencing）技術(shù)發(fā)展，可找出數(shù)以千萬條miRNA。在草本植物中，Akdogan等[2]鑒定了小麥根和葉中響應(yīng)干旱的miRNA，干旱處理后，miR159、miR160、miR166、miR169、miR172、miR395、miR396、miR408、miR472、miR477、miR482、miR1858、miR2118和miR5049在小麥中差異表達(dá)顯著。Sun等[3]鑒定了蘿卜中響應(yīng)NaCl脅迫的miRNA，發(fā)現(xiàn)136個(gè)已知miRNA（屬于43個(gè)miRNA家族）和68個(gè)潛在的新miRNA（屬于51個(gè)miRNA家族），49個(gè)已知miRNA和22個(gè)新miRNA在鹽脅迫下差異表達(dá)，這些miRNA的靶基因主要注釋在信號(hào)感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子穩(wěn)態(tài)調(diào)控、基本代謝過程、次生脅迫響應(yīng)以及對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控等通路。在木本植物中，Pan等[4]在樺樹中鑒定了響應(yīng)熱脅迫的miRNA，發(fā)現(xiàn)206個(gè)miRNA，其中98個(gè)（57個(gè)已知miRNA和41個(gè)新miRNA）在高溫脅迫下差異表達(dá)。上述研究從組學(xué)角度揭示了miRNA在非生物脅迫過程中的調(diào)控作用，并未針對(duì)某個(gè)特定的miRNA展開研究。
miRNA156最先發(fā)現(xiàn)于擬南芥中，約由20個(gè)核苷酸組成，結(jié)構(gòu)保守，通過靶向SPL基因參與植物生長(zhǎng)發(fā)育[5]。越來越多證據(jù)表明，高度保守的miRNA156/SPL模式似乎平衡了植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答。過表達(dá)miRNA156可以增加苜蓿和水稻根部生物量，進(jìn)而提高其鹽堿耐受性[6]；最終，還可以提高苜蓿、柳枝稷等飼料用作物產(chǎn)量和品質(zhì)[7-8]。因此，有人認(rèn)為組成型表達(dá)miRNA156可提高植物對(duì)非生物脅迫耐受性[9-10]。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，鹽脅迫后1h是檉柳（Tamarixchinensis）中miR156響應(yīng)鹽脅迫調(diào)控的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)[11]。誘導(dǎo)ZmmiR156表達(dá)能提高煙草對(duì)干旱和鹽脅迫耐受性[12]。鹽脅迫早期，菊花miRNA156表達(dá)量先升高后降低，進(jìn)而可能通過調(diào)控CmSPL13或者其他靶基因參與鹽脅迫早期應(yīng)答[13]。但在白樺樹、蘋果樹等木本植物中，過表達(dá)miRNA156材料的耐鹽性呈降低趨勢(shì)[14-15]。故工業(yè)大麻miRNA156在響應(yīng)堿性鹽脅迫早期應(yīng)答過程中的表達(dá)模式仍有待進(jìn)一步探究。
以上研究報(bào)道了miRNA156對(duì)植物鹽堿耐受性的調(diào)控作用，但對(duì)其分子調(diào)控機(jī)制研究尚不深入。尤其是在工業(yè)大麻中，miRNA156如何感知外界脅迫信號(hào)，并通過調(diào)控下游相關(guān)基因響應(yīng)NaHCO3脅迫的分子機(jī)制研究鮮有報(bào)道。為此，本研究采用生物信息學(xué)和qRT-PCR方法，對(duì)工業(yè)大麻miR156家族的基因前體序列和成熟體序列的保守性、二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)其在NaHCO3脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在豐富miRNA156基因家族的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和基因功能研究，為工業(yè)大麻的分子育種提供基因資源和理論參考。
1.材料與方法
1.1材料
以耐受型品種火麻一號(hào)為試驗(yàn)材料（火麻一號(hào)種子由黑龍江省科學(xué)院大慶分院提供）。待幼苗生長(zhǎng)到3對(duì)真葉時(shí)，在培養(yǎng)液中加入NaHCO3，使其濃度達(dá)到100mmol/L，對(duì)照組不加NaHCO3。分別在脅迫0、0.5、1、6、12、24h采集長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗根部樣品，于-80℃保存?zhèn)溆?/font>[16]。植物根部總RNA提取、cDNA合成和定量PCR試劑盒均購自天根生化科技有限公司。
1.2方法
1.2.1miRNA156成熟體和前體序列分析
采用數(shù)據(jù)庫miRBase（http://www.miRbase.org）對(duì)工業(yè)大麻中新發(fā)現(xiàn)的miRNA進(jìn)行比對(duì)，獲取相似度高的已知miRNA156家族前體和成熟體序列。采用MEGA5軟件進(jìn)行前體和成熟體序列的進(jìn)化關(guān)系分析，使用miRDeep2軟件預(yù)測(cè)新miRNA的前體序列和結(jié)構(gòu)，采用WebLogo3（http://weblogo.threeplusone.com/）繪制miR156家族序列保守性Logo圖。
1.2.2工業(yè)大麻miRNA156成熟體qRT-PCR
以cDNA作為模板，使用基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用U6作為miRNA的內(nèi)參基因，采用PowerqPCRPreMix（Genecopoeia）試劑盒，樣品設(shè)置3次重復(fù)。反應(yīng)條件：95℃,10min；（95℃,10s；60℃,40s）×40循環(huán)；（95℃,15s；60℃,60s；95℃,30s；60℃,15s）。用2-△△Ct法評(píng)價(jià)基因的相對(duì)表達(dá)量[17]。
表1qRT-PCR引物序列
2.結(jié)果與分析
利用軟件miRDeep2對(duì)novel_miR_75和novel_miR_179的候選前體序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，紅色為成熟序列，黃色為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，紫色為star序列（圖1（A）），前體序列均可形成較為穩(wěn)定的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且成熟體產(chǎn)生于前體的5’端上臂，保守性較強(qiáng)。從圖1（B）中可以看出，成熟序列相同或高度相似，花椒、煙草、刺頭朝鮮薊、大豆的miR156成熟體序列非常保守，而工業(yè)大麻miR156與其他植物miR156相比，在3’端有2個(gè)核苷酸不同。
圖1工業(yè)大麻pre-miR156的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和成熟體序列比對(duì)
由圖2可知，前體序列的89～110和175～216位點(diǎn)的堿基保守性較高，其他位點(diǎn)堿基保守性較低。成熟體序列基本產(chǎn)生于前體序列的89～110位點(diǎn)。12個(gè)miR156成熟體中12個(gè)堿基完全保守，8個(gè)保守性較高，3個(gè)堿基保守性較低。
圖2miRNA156家族成熟序列保守性分析
工業(yè)大麻受NaHCO3脅迫后，根部不同時(shí)間點(diǎn)miRNA156表達(dá)變化規(guī)律顯示（圖3），miRNA156的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)。0.5h時(shí)工業(yè)大麻根部miRNA156的表達(dá)量最高，較對(duì)照增加了2.1倍。
圖3NaHCO3脅迫下工業(yè)大麻miRNA156表達(dá)模式
注：不同小寫字母代表差異顯著（p<0.05）。
系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示：成熟體miRNA中，novel_miR_179和蘋果（Malusdomestica）的miR156m聚在一起，novel_miR_75與大豆（Glycinemax）的miR156u聚在一起（圖4（A））；miRNA前體序列中，novel_miR_179和蘆筍（Asparagusofficinalis）的miR156a聚在一起，novel_miR_75與野草莓（Fragariavesca）的miR156h聚在一起（圖4（B））。
圖4工業(yè)大麻miR156家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
3.討論
在植物miRNA的研究中，已在72種植物中鑒定出7385種成熟miRNA和6150種前體miRNA[18]。其中，miR156家族是植物中數(shù)量最多且高度保守的成員之一，在根、莖、葉的 形態(tài)發(fā)生、花的發(fā)育等方面起著重要作用，同時(shí)在抗逆性等方面起著至關(guān)重要的調(diào)控作用[19]。在水稻[20]、萱草[21]、苜蓿[22]、花生[23]等多種植物受到逆境脅迫時(shí)，均發(fā)現(xiàn)miR156具有重要的調(diào)控作用，且過表達(dá)miR156增加了植物對(duì)逆境脅迫的耐受性[10]。
通常miRNA的表達(dá)水平與外界環(huán)境改變有一定相關(guān)性[24-25]，受NaHCO3脅迫，工業(yè)大麻miR156的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)。NaHCO3脅迫0.5h時(shí)工業(yè)大麻根部miR156的表達(dá)量最高，較對(duì)照增加了2.1倍，該規(guī)律在檉柳中也有類似報(bào)道[11]。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)工業(yè)大麻novel_miR_179和蘋果的miR156m聚在一起，novel_miR_75與大豆miR156u聚在一起，這些已知的miR156基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育方面具有重要的調(diào)控作用[26-27]。在pre-miRNA序列的進(jìn)化樹中，novel_miR_179和蘆筍miR156a聚在一起，novel_miR_75與野草莓miR156h聚在一起，這些已知的miR156基因在調(diào)控開花與性別分化方面具有重要作用[28-29]。可見。miR156在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性方面具有重要的調(diào)控作用[7,30]。故推測(cè)工業(yè)大麻novel_miR_75和novel_miR_179在抗逆性調(diào)控方面也具有重要的作用。
相同或者相似的成熟體miRNA可能來源于不同的前體miRNA[31]。本研究中，novel_miR_75和novel_miR_179的候選前體來源于不同的染色體，且候選前體具有不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)，說明工業(yè)大麻miR156基因家族前體序列具有較大差異。novel_miR_75和novel_miR_179的成熟體均產(chǎn)生于前體的5’端上臂，且成熟體序列的同源性較高，說明不同的前體miRNA可能產(chǎn)生了相同的成熟體miR156，該規(guī)律在辣椒中也有類似報(bào)道[32]。
目前，從生理特性、農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量性狀等角度揭示了工業(yè)大麻品種間的鹽堿耐受性差異[33]，但從miRNA角度的研究鮮有報(bào)道。miR156及其靶基因SPL轉(zhuǎn)錄因子可用于改良植物性狀，進(jìn)而影響抗逆性和產(chǎn)量[6,34-35]。本研究通過生物信息學(xué)和qRT-PCR方法分析了工業(yè)大麻miR156基因?qū)aHCO3脅迫的響應(yīng)，為后續(xù)研究miR156及其靶基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和工業(yè)大麻鹽堿耐受性提供了理論參考。
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