摘 要:為了探索相同配方培養(yǎng)基條件下不同苧麻種質(zhì)體細(xì)胞植株再生體系的差異,為苧麻組織培養(yǎng)及品種改良提供理論依據(jù),本試驗(yàn)以6個(gè)苧麻種質(zhì)(湘飼苧X4?湘飼苧X6?湘飼苧X7?A?B?C)為材料,采用相同配方的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),比較分析6個(gè)苧麻種質(zhì)的愈傷誘導(dǎo)率?不定芽誘導(dǎo)率和再生苗生根率?結(jié)果表明:以附加TDZ(噻苯隆,0.05mg/L)?2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸,0.03mg/L)和IAA(吲哚乙酸,0.01mg/L)的MS培養(yǎng)基為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí),湘飼苧X4?湘飼苧X6?湘飼苧X7?A?B和C的愈傷誘導(dǎo)率分別為76.67%?40.00%?30.00%?90.00%?90.00%和96.67%;以附加TDZ(0.5mg/L)?2,4-D(0.02mg/L)和IAA(0.03mg/L)的1/2MS培養(yǎng)基為不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí),湘飼苧X4?湘飼苧X6?湘飼苧X7?A?B和C的不定芽誘導(dǎo)率分別為11.62%?8.33%?5.88%?24.52%?21.15%和31.57%;以附加TDZ(0.02mg/L)?NAA(萘乙酸,0.05mg/L)和IAA(0.02mg/L)的MS培養(yǎng)基為生根培養(yǎng)基時(shí),湘飼苧X4?湘飼苧X6?湘飼苧X7?A?B和C的生根率都是100%?湘飼苧X7的愈傷誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率均最低,分別為30.00%和5.88%;C的愈傷誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率均最高,分別為96.67%和31.57%?綜合分析,基因型對苧麻外植體愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽形成具有重要影響?
關(guān)鍵詞:火苧麻;種質(zhì);組織培養(yǎng);不定芽;植株再生
在苧麻(Boehmerianivea)為蕁麻科(Urticaceae)苧麻屬(Boehmeria)的多年生草本植物,主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū),在世界上享有“中國草”(China grass)之譽(yù)稱?其栽培歷史在4000年以上,是我國最先利用的天然纖維之一?苧麻組織培養(yǎng)技術(shù)在苧麻品種改良?種質(zhì)資源的繁殖和保存?雜種優(yōu)勢的固定和遺傳轉(zhuǎn)化等方面具有重要作用?高再生率的體細(xì)胞再生體系對開展體細(xì)胞無性系變異規(guī)律研究及其種質(zhì)創(chuàng)新極為有利?迄今為止,苧麻離體再生體系的研究已取得了一定的進(jìn)展,研究內(nèi)容涉及基因型?激素?外植體類型?基本培養(yǎng)基等,但仍存在基因型差異顯著?植株再生頻率低?可重復(fù)操作性差等問題?本試驗(yàn)研究苧麻種質(zhì)基因型對體細(xì)胞植株再生的影響,以為苧麻的組織培養(yǎng)及植株再生提供理論依據(jù)?
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)采用6個(gè)苧麻種質(zhì),分別是湘飼苧X4?湘飼苧X6?湘飼苧X7?A?B和C,均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所提供?
1.2 試驗(yàn)方法
將6個(gè)苧麻種質(zhì)種苗移栽于裝有營養(yǎng)土的盆中進(jìn)行培養(yǎng),等植株長出新葉后,取嫩葉作為外植體,每個(gè)種質(zhì)各接種30片,3個(gè)重復(fù)共90片,用毛筆輕輕刷去雜質(zhì),用自來水沖洗,濾紙吸干,在超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸洗25s后,用無菌水沖洗3遍,再用0.1%升汞消毒7min,用無菌水沖洗5遍后,在無菌濾紙上將葉片切成0.5cm×0.5cm的方塊,并將其接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上?將葉塊的下表皮貼于培養(yǎng)基上,于暗室中誘導(dǎo)愈傷組織,一般5d后愈傷基本形成?10d后將愈傷轉(zhuǎn)接于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)條件:白天溫度26±2℃,夜間為20±2℃,每天光照11h,光照強(qiáng)度為1500~2000Lx?愈傷組織通過多次繼代,分化出不定芽,再將不定芽轉(zhuǎn)接在壯苗培養(yǎng)基上壯苗,待不定芽長至2~3cm時(shí),再將其轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中,10d后可以長出新根,即為完整的再生植株?愈傷組織?不定芽和根的誘導(dǎo)均設(shè)3次重復(fù)?
1.3 培養(yǎng)基配方
愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+TDZ(噻苯隆,0.05mg/L)+2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸,0.03mg/L)+IAA(吲哚乙酸,0.01mg/L)?
不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:1/2MS培養(yǎng)基+TDZ(0.5L)+2mg/L,4-D(0.02mg/L)+IAA(0.03mg/L)?
壯苗培養(yǎng)基:MS+TDZ(0.05mg/L)+IAA(0.05mg/L)?
生根培養(yǎng)基:MS+TDZ(0.02mg/L)+NAA(0.05mg/L)+IAA(0.02mg/L)?
1.4 數(shù)據(jù)處理及方法
采用Excel2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理,用DPS9.01軟件進(jìn)行方差分析?本研究根據(jù)以下公式計(jì)算組織培養(yǎng)處理的愈傷組織誘導(dǎo)率?不定芽誘導(dǎo)率和生根率:
愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=(產(chǎn)生愈傷組織的葉片數(shù)/接種的葉片數(shù))×100;
不定芽誘導(dǎo)率(%)=(產(chǎn)生不定芽的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))×100;
生根率(%)=(生根小苗數(shù)/接種的不定芽數(shù))×100?
2 結(jié)果與分析
2.1 愈傷組織誘導(dǎo)
6個(gè)苧麻種質(zhì)愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果見表1和圖1?
在時(shí)間上,種質(zhì)A?B和C在接種后第2天葉片出現(xiàn)膨大,第3天誘導(dǎo)出愈傷組織,湘飼苧X4在第5天出現(xiàn)愈傷組織,湘飼苧X6和湘飼苧X7脫分化的時(shí)間最長,第7天才誘導(dǎo)出愈傷組織,且長出的愈傷組織不整齊?顏色上,A?B和C分別出現(xiàn)了米白?淺黃和淡紅等顏色,其他3個(gè)種質(zhì)的愈傷組織顏色較一致?在愈傷組織的質(zhì)量上,A?B和C的愈傷組織長勢相對較強(qiáng),質(zhì)地疏松,成小瘤﹑顆粒狀,且愈傷組織誘導(dǎo)率也較高,其中,C的愈傷誘導(dǎo)率最高,達(dá)96.67%,A和B的愈傷誘導(dǎo)率均為90.00%;湘飼苧X6和湘飼苧X7的愈傷組織長勢較弱,尤其是湘飼苧X7,愈傷組織質(zhì)地呈蓬松狀,少量的愈傷還出現(xiàn)了變褐現(xiàn)象,其愈傷組織誘導(dǎo)率最低,為30.00%,湘飼苧X6為40.00%;湘飼苧X4的愈傷組織誘導(dǎo)率為76.67%,處于中間位置,高于湘飼苧X6和湘飼苧X7,但低于A?B和C?
表1不同苧麻種質(zhì)愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果
“-”表示生長緩慢,生長勢弱;“+”表示生長勢一般;“++”表示生長勢較強(qiáng);“+++”表示生長勢很強(qiáng)?小寫字母不同表示種質(zhì)間差異顯著(P<0.05)?
圖1 干旱脅迫對火麻葉片相對含水量的影響
2.2 不定芽誘導(dǎo)
將6個(gè)種質(zhì)的愈傷組織轉(zhuǎn)接在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,每隔3d觀察1次,每隔3個(gè)星期繼代1次,觀察并記錄結(jié)果(表2,圖2)?根據(jù)表2,第1次繼代后,每個(gè)種質(zhì)都出現(xiàn)了不同程度的變褐現(xiàn)象,其中湘飼苧X4?湘飼苧X6和湘飼苧X7較嚴(yán)重,變褐的愈傷組織最后都出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象,嚴(yán)重影響了不定芽誘導(dǎo)率;湘飼苧X4?湘飼苧X6和湘飼苧X7的不定芽誘導(dǎo)率分別為11.62%?8.33%?5.88%;種質(zhì)A?B?C的情況較好,特別是種質(zhì)C?第2次繼代后,愈傷組織分化出了少量的芽和簇芽,其中B有15塊愈傷分化出了根,A的愈傷轉(zhuǎn)綠,質(zhì)地致密?第3次繼代后,A和B均分化出了芽,由于B分化了根,不利于芽和苗的再生,A的不定芽誘導(dǎo)率(24.52%)稍高于B(21.15%),不定芽誘導(dǎo)率最高的是種質(zhì)C(31.57%)?
表2不同苧麻種質(zhì)不定芽誘導(dǎo)結(jié)果
圖2不同苧麻種質(zhì)愈傷組織9周后誘導(dǎo)出的不定芽
2.3 壯苗培養(yǎng)情況
由于愈傷組織上長出來的不定芽太小,生長能力弱,不能直接接種在生根培養(yǎng)基中生根,而需要在壯苗培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)壯苗?即將誘導(dǎo)出不定芽的愈傷塊轉(zhuǎn)接在附加TDZ(0.05mg/L)和IAA(0.05mg/L)的MS培養(yǎng)基中,每隔3d觀察1次,15d后觀察發(fā)現(xiàn),大部分不定芽生長較好,莖稈粗,葉子蔥綠,也有少許不定芽生長較慢,芽苗較矮,葉子較小?
2.4 根的誘導(dǎo)
待不定芽長至2~3cm,將其轉(zhuǎn)接在附加TDZ2mg/L)?IAA(0.02mg/L)和NAA(0.05mg/L)的MS培養(yǎng)基上,10d后,6個(gè)種質(zhì)全部生根?開始根少且短,植株矮小,1周后,整個(gè)三角瓶的底部都布滿了根,植株也隨著長高長大,從而形成了完整的再生植株?
圖3 不同苧麻種質(zhì)的不定芽生根情況(轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基后17d)
3 討論
潘昌立等研究發(fā)現(xiàn),基因型是苧麻外植體誘導(dǎo)愈傷組織和再生植株的決定因素,在相同培養(yǎng)條件下,不同基因型苧麻葉愈傷組織的綠芽誘導(dǎo)率表現(xiàn)為:湘苧6號(hào)(36.0%)>湘苧2號(hào)(34.0%)>Q8(20.0%)>蘆竹青(8.8%)>湘苧3號(hào)(3.3%)>C5(2.9%)?劉瑛等研究發(fā)現(xiàn),基因型和培養(yǎng)基組分是影響苧麻體細(xì)胞植株再生的內(nèi)因和主要外因,不同基因型苧麻葉愈傷組織的綠芽誘導(dǎo)率表現(xiàn)為:細(xì)野麻(36.0%)>贛苧3號(hào)(33.4%)>湘苧2號(hào)(32.0%)>89-12(20.0%)>湘苧3號(hào)(3.3%)?馬雄風(fēng)研究發(fā)現(xiàn),在相同培養(yǎng)條件下,不同基因型苧麻下胚軸愈傷的芽再生頻率表現(xiàn)為:中飼苧1號(hào)(83.77%)>中苧1號(hào)(81.77%)>NC01(80.59%);子葉愈傷組織的芽再生頻率表現(xiàn)為:NC01(60.29%)>中苧1號(hào)(57.14%)>中飼苧1號(hào)(50.51%)?王曉玲等將湘苧6號(hào)和湘苧2號(hào)的葉片在附加2.5mg/L6-BA和0.5mg/L2,4-D的MS?MSB?LS?B5和N6等5種培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)湘苧2號(hào)葉愈傷組織量均高于湘苧6號(hào)?王曉玲和彭定祥研究發(fā)現(xiàn),在附加0.5~2.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA,0.5-2.5mg/L6-BA和0.5mg/L2,4-D的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),黃殼早?湘苧2號(hào)?華苧3號(hào)和巴西麻6號(hào)適應(yīng)性強(qiáng),脫分化和分化均較容易,但華苧1號(hào)脫分化難?Wang等研究發(fā)現(xiàn),苧麻不定芽再生情況取決于基因型,將6種苧麻基因型在附加2.27μMTDZ和0.057μMIAA或2.27μMTDZ和0.054μMNAA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),5041-3的不定芽誘導(dǎo)率最高,分別為86.2%和64.5%,黃皮棍的不定芽誘導(dǎo)率最低,分別為46.5%和33.4%?
4 結(jié)論
本研究中,6個(gè)苧麻種質(zhì)的愈傷誘導(dǎo)率均較高,種質(zhì)C的愈傷誘導(dǎo)率最高,達(dá)96.67%,湘飼苧X7的愈傷誘導(dǎo)率最低,為30.00%;而6個(gè)種質(zhì)的不定芽誘導(dǎo)率卻相對較低,種質(zhì)C的不定芽誘導(dǎo)率最高,為31.57%,湘飼苧X7的不定芽誘導(dǎo)率最低,僅為5.88%?綜合分析,基因型是影響苧麻外植體愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽形成的重要因素
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文章摘自:何鵬亮,蔣美艷,邢虎成,揭雨成.苧麻種質(zhì)基因型對體細(xì)胞植株再生的影響[J].作物研究,2023,37(5):519-524.
