摘要：本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖工業(yè)大麻不定根的方法，以工業(yè)大麻無菌苗葉片直接誘導(dǎo)生成不定根，節(jié)省了愈傷組織誘導(dǎo)環(huán)節(jié)，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)基組分和激素，縮短了培養(yǎng)周期，提高了不定根產(chǎn)量；通過優(yōu)化蔗糖濃度、接種密度、通氣速率和動(dòng)態(tài)研究等生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了短期內(nèi)培育出能大量生產(chǎn)穩(wěn)定的CBD和多糖的工業(yè)大麻不定根，解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不定根產(chǎn)量低、無法檢測(cè)CBD和多糖等問題；工業(yè)大麻不定根由培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)至生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)，培育過程不受季節(jié)、氣候、土壤條件的制約，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度和生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)了全年快速培育能夠生產(chǎn)高CBD和多糖的不定根。

技術(shù)要點(diǎn)

1.一種培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，誘導(dǎo)工業(yè)大麻無菌苗：選取工業(yè)大麻種子，消毒后接種至固體培養(yǎng)基上，獲得工業(yè)大麻無菌苗；

S2，固體培養(yǎng)工業(yè)大麻不定根：無菌條件下，取工業(yè)大麻無菌苗外植體接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ中，進(jìn)行不定根直接誘導(dǎo)培養(yǎng)；將誘導(dǎo)出的不定根進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到增殖后的工業(yè)大麻不定根；

S3，懸浮培養(yǎng)工業(yè)大麻不定根：取增殖后的工業(yè)大麻不定根放入生物反應(yīng)器中進(jìn)行放大培養(yǎng)；

S4，收集生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的工業(yè)大麻不定根。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根方法，其特征在于，步驟S1中具體包括：

選取顆粒飽滿的工業(yè)大麻種子，用自來水沖洗干凈，并篩選出品質(zhì)優(yōu)良的種子，之后在無菌操作臺(tái)中用75％乙醇消毒20-30s后，無菌水清洗；再用1％升汞處理9-10min，無菌水清洗，用無菌濾紙吸去種子表面的水分；

接種至固體培養(yǎng)基上，在25±2℃條件下光照16/8h培養(yǎng)15-20d，獲得工業(yè)大麻無菌苗。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根方法，其特征在于，步驟S1中，所述固體培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基、30-40g/L蔗糖和7-8g/L瓊脂。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根方法，其特征在于，步驟S2中，工業(yè)大麻無菌苗外植體為葉片和根尖。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為3/4MS-MS培養(yǎng)基、0.5-1mg/L的IBA、30-40g/L蔗糖和7-8g/L瓊脂的培養(yǎng)基。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根方法，其特征在于，步驟S2中，將誘導(dǎo)出的不定根進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到增殖后的工業(yè)大麻不定根，具體包括：在無菌條件下，選擇上一步誘導(dǎo)狀態(tài)良好的不定根切成1-2cm左右接種至增殖培養(yǎng)基上，所述增殖培養(yǎng)基包括3/4MS-MS培養(yǎng)基、1.5-3mg/L的IBA、30-40g/L蔗糖和7-8g/L瓊脂。

7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一所述的培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根方法，其特征在于，培養(yǎng)基的pH＝5-6。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根方法，其特征在于，步驟S3中生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基包括3/4MS-MS培養(yǎng)基、1.5-3mg/LIBA和25-35g/L蔗糖。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根方法，其特征在于，步驟S3中生物反應(yīng)器中不定根的接種密度為10-15g/L，通氣速率為0.06-0.08vvm。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根方法，其特征在于，生物反應(yīng)器中不定根的暗培養(yǎng)時(shí)間為40-50d。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物組織培育技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根的方法。

技術(shù)背景

大麻(Cannabas satava L.)，屬于大麻科大麻屬，分布于中亞、歐美等國家，作為世界上最古老的一年生農(nóng)作物之一，被稱為擁有最佳可被規(guī)?；_發(fā)利用潛力的藥用植物。由于以植物大麻素為主的藥用市場(chǎng)發(fā)展迅速，很多國家卻明令禁止種植包括高產(chǎn)大麻素在內(nèi)的大麻品種，于是工業(yè)大麻逐漸成為熱點(diǎn)研究對(duì)象。

CBD是工業(yè)大麻中主要成分之一，無成癮性，在抗癲癇、保護(hù)神經(jīng)、抗炎、抑菌和抗氧化等方面極具效果，已被用于治療多種疾病，并具備研制成出色的抗氧化劑和抗生素的潛力。植物多糖具有調(diào)節(jié)腸道、抗氧化、抗腫瘤和降血糖等藥理活性，且毒副性較低，已經(jīng)成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)品開發(fā)的熱點(diǎn)。由于工業(yè)大麻種植受法律限制，導(dǎo)致CBD嚴(yán)重依賴工業(yè)大麻原材料提取分離來獲得。然而人工種植的工業(yè)大麻中CBD的積累受諸多因素影響，如品種、性別、年齡、生長環(huán)境和栽培方法等，這使得工業(yè)大麻原材料的品質(zhì)和可用性受到了限制，無法滿足市場(chǎng)需求。于是，尋找一種新的CBD和多糖的獲取途徑顯得尤為重要。

植物組織培養(yǎng)的不定根可以聚集植物中生物活性物質(zhì)并保持原植株的所有特性，較細(xì)胞培養(yǎng)遺傳性穩(wěn)定，較毛壯根培養(yǎng)更具安全性，不定根的代謝和活力相對(duì)更為穩(wěn)定，也不受季節(jié)、氣候、土壤條件的制約。生物反應(yīng)器可以為植物的新陳代謝提供優(yōu)良的生長環(huán)境，使目標(biāo)培養(yǎng)物快速并優(yōu)質(zhì)地生長發(fā)育，實(shí)現(xiàn)了全年快速生產(chǎn)不定根，可獲得更多次生代謝物質(zhì)和大量的不定根，已應(yīng)用于人參、地黃以及黃芪等不定根的生產(chǎn)?，F(xiàn)有的工業(yè)大麻不定根培養(yǎng)過程較為復(fù)雜且處于初級(jí)階段，如Farag和Kayser用愈傷組織誘導(dǎo)出不定根后建立了培養(yǎng)體系，該體系下的不定根中大麻二酚酸、四氫大麻酚酸和大麻萜酚酸含量極低，在培養(yǎng)28d時(shí)停止生產(chǎn)，也并未檢測(cè)到CBD和多糖，說明現(xiàn)有的培養(yǎng)體系不適用于培養(yǎng)工業(yè)大麻不定根來生產(chǎn)CBD和多糖。因此，如何通過工業(yè)大麻不定根培養(yǎng)體系改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)CBD和多糖成為急需解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

正文內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根的方法，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的前述問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根方法，包括以下步驟：

S1，誘導(dǎo)工業(yè)大麻無菌苗：選取工業(yè)大麻種子，消毒后接種至固體培養(yǎng)基上，獲得工業(yè)大麻無菌苗；

S2，固體培養(yǎng)工業(yè)大麻不定根：無菌條件下，取工業(yè)大麻無菌苗外植體接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ中，進(jìn)行不定根直接誘導(dǎo)培養(yǎng)；將誘導(dǎo)出的不定根進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到增殖后的工業(yè)大麻不定根；

S3，懸浮培養(yǎng)工業(yè)大麻不定根：取增殖后的工業(yè)大麻不定根放入生物反應(yīng)器中進(jìn)行放大培養(yǎng)；

S4，收集生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的工業(yè)大麻不定根。

優(yōu)選的，步驟S1中具體包括：

選取顆粒飽滿的工業(yè)大麻種子，用自來水沖洗干凈，并篩選出品質(zhì)優(yōu)良的種子，之后在無菌操作臺(tái)中用75％乙醇消毒20-30s后，無菌水清洗；再用1％升汞處理9-10min，無菌水清洗，用無菌濾紙吸去種子表面的水分；

接種至固體培養(yǎng)基上，在25±2℃條件下光照16/8h培養(yǎng)15-20d，獲得工業(yè)大麻無菌苗。

優(yōu)選的，步驟S1中，所述固體培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基、30-40g/L蔗糖和7-8g/L瓊脂。

優(yōu)選的，步驟S2中，工業(yè)大麻無菌苗外植體為葉片和根尖。

優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為3/4MS-MS培養(yǎng)基、0.5-1mg/L的IBA、30-40g/L蔗糖和7-8g/L瓊脂的培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，步驟S2中，將誘導(dǎo)出的不定根進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到增殖后的工業(yè)大麻不定根，具體包括：在無菌條件下，選擇上一步誘導(dǎo)狀態(tài)良好的不定根切成1-2cm左右接種至增殖培養(yǎng)基上，所述增殖培養(yǎng)基包括3/4MS-MS培養(yǎng)基、1.5-3mg/L的IBA、30-40g/L蔗糖和7-8g/L瓊脂。

優(yōu)選的，培養(yǎng)基的pH＝5-6。

優(yōu)選的，步驟S3中生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基包括3/4MS-MS培養(yǎng)基、1.5-3mg/LIBA和25-35g/L蔗糖。

優(yōu)選的，步驟S3中生物反應(yīng)器中不定根的接種密度為10-15g/L，通氣速率為0.06-0.08vvm。

進(jìn)一步優(yōu)選的，生物反應(yīng)器中不定根的暗培養(yǎng)時(shí)間為40-50d。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明公開了一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖工業(yè)大麻不定根的方法，以工業(yè)大麻無菌苗葉片直接誘導(dǎo)生成不定根，節(jié)省了愈傷組織誘導(dǎo)環(huán)節(jié)，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)基組分和激素，縮短了培養(yǎng)周期，提高了不定根產(chǎn)量；通過優(yōu)化蔗糖濃度、接種密度、通氣速率和動(dòng)態(tài)研究等生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了短期內(nèi)培育出能大量生產(chǎn)穩(wěn)定的CBD和多糖的工業(yè)大麻不定根，解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不定根產(chǎn)量低、無法檢測(cè)CBD和多糖等問題；工業(yè)大麻不定根由培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)至生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)，培育過程不受季節(jié)、氣候、土壤條件的制約，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度和生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)了全年快速培育能夠生產(chǎn)高CBD和多糖的不定根。

附圖說明

此處的附圖被并入說明書中并構(gòu)成本說明書的一部分，示出了符合本申請(qǐng)的實(shí)施例，并與說明書一起用于解釋本申請(qǐng)的原理。

為了更清楚地說明本申請(qǐng)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明中的工業(yè)大麻不定根分別在培養(yǎng)皿(a)、搖瓶(b)和生物反應(yīng)器(c)中生長狀態(tài)的示意圖。

  

圖2是高效液相色譜儀檢測(cè)實(shí)施例1中的培養(yǎng)方法得到的工業(yè)大麻不定根中的CBD含量，其中(a)是CBD和CBG標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)峰；(b)是工業(yè)大麻不定根中CBD和CBG的檢測(cè)峰。

  

圖3是實(shí)驗(yàn)例中的蔗糖濃度影響工業(yè)大麻不定根生長和CBD及多糖積累的示意圖。

  

圖4是實(shí)驗(yàn)例中的接種密度影響工業(yè)大麻不定根生長和CBD及多糖積累的示意圖。

  

圖5是實(shí)驗(yàn)例中的通氣速率影響工業(yè)大麻不定根生長和CBD及多糖積累的示意圖。

  

圖6是本申請(qǐng)實(shí)施例的工業(yè)大麻不定根生長動(dòng)態(tài)研究的示意圖。

  

圖7是本申請(qǐng)實(shí)施例的利用生物反應(yīng)器高效培養(yǎng)工業(yè)大麻不定根生產(chǎn)大麻二酚和多糖的流程圖。

 

具體實(shí)施方法

正文內(nèi)容本申請(qǐng)的各種實(shí)施例可以以一個(gè)范圍的形式存在；應(yīng)當(dāng)理解，以一范圍形式的描述僅僅是因?yàn)榉奖慵昂?jiǎn)潔，不應(yīng)理解為對(duì)本申請(qǐng)范圍的硬性限制；因此，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為所述的范圍描述已經(jīng)具體公開所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的單一數(shù)值。例如，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為從1到6的范圍描述已經(jīng)具體公開子范圍，例如從1到3，從1到4，從1到5，從2到4，從2到6，從3到6等，以及所述范圍內(nèi)的單一數(shù)字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范圍為何皆適用。另外，每當(dāng)在本文中指出數(shù)值范圍，是指包括所指范圍內(nèi)的任何引用的數(shù)字(分?jǐn)?shù)或整數(shù))。

在本申請(qǐng)中，在未作相反說明的情況下，使用的方位詞如“上”和“下”具體為附圖中的圖面方向。另外，在本申請(qǐng)說明書的描述中，術(shù)語“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，諸如“第一”和“第二”等之類的關(guān)系術(shù)語僅僅用來將一個(gè)實(shí)體或者操作與另一個(gè)實(shí)體或操作區(qū)分開來，而不一定要求或者暗示這些實(shí)體或操作之間存在任何這種實(shí)際的關(guān)系或者順序。在本文中，“和/或”，描述關(guān)聯(lián)對(duì)象的關(guān)聯(lián)關(guān)系，表示可以存在三種關(guān)系，例如，A和/或B，可以表示：?jiǎn)为?dú)存在A，同時(shí)存在A和B，單獨(dú)存在B的情況。其中A，B可以是單數(shù)或者復(fù)數(shù)。在本文中，“至少一個(gè)”是指一個(gè)或者多個(gè)，“多個(gè)”是指兩個(gè)或兩個(gè)以上。“至少一種”、“以下至少一項(xiàng)(個(gè))”或其類似表達(dá)，是指的這些項(xiàng)中的任意組合，包括單項(xiàng)(個(gè))或復(fù)數(shù)項(xiàng)(個(gè))的任意組合。例如，“a,b,或c中的至少一項(xiàng)(個(gè))”，或，“a,b,和c中的至少一項(xiàng)(個(gè))”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分別可以是單個(gè)，也可以是多個(gè)。

除非另有特別說明，本申請(qǐng)中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等，均可通過市場(chǎng)購買得到或者可通過現(xiàn)有方法制備得到。

本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根的方法，包括以下步驟：

S1，誘導(dǎo)工業(yè)大麻無菌苗：選取工業(yè)大麻種子，消毒后接種至固體培養(yǎng)基上，獲得工業(yè)大麻無菌苗；

S2，固體培養(yǎng)工業(yè)大麻不定根：無菌條件下，取工業(yè)大麻無菌苗外植體接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ中，進(jìn)行不定根直接誘導(dǎo)培養(yǎng)；將誘導(dǎo)出的不定根進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到增殖后的工業(yè)大麻不定根；

S3，懸浮培養(yǎng)工業(yè)大麻不定根：取增殖后的工業(yè)大麻不定根放入生物反應(yīng)器中進(jìn)行放大培養(yǎng)；

S4，收集生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的工業(yè)大麻不定根。

在一些實(shí)施方式中，步驟S1中具體包括：

選取顆粒飽滿的工業(yè)大麻種子，用自來水沖洗干凈，并篩選出品質(zhì)優(yōu)良的種子，之后在無菌操作臺(tái)中用75％乙醇消毒20-30s后，無菌水清洗；再用1％升汞處理9-10min，無菌水清洗，用無菌濾紙吸去種子表面的水分；

接種至固體培養(yǎng)基上，在25±2℃條件下光照16/8h培養(yǎng)15-20d，獲得工業(yè)大麻無菌苗。

在一些實(shí)施方式中，步驟S1中，所述固體培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基、30-40g/L蔗糖和7-8g/L瓊脂。

在一些實(shí)施方式中，步驟S2中，工業(yè)大麻無菌苗外植體為葉片和根尖。

在一些實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為3/4MS-MS培養(yǎng)基、0.5-1mg/L的IBA、30-40g/L蔗糖和7-8g/L瓊脂的培養(yǎng)基。

在一些實(shí)施方式中，步驟S2中，將誘導(dǎo)出的不定根進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到增殖后的工業(yè)大麻不定根，具體包括：在無菌條件下，選擇上一步誘導(dǎo)狀態(tài)良好的不定根切成1-2cm左右接種至增殖培養(yǎng)基上，所述增殖培養(yǎng)基包括3/4MS-MS培養(yǎng)基、1.5-3mg/L的IBA、30-40g/L蔗糖和7-8g/L瓊脂。

在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基的pH＝5-6。

在一些實(shí)施方式中，步驟S3中生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基包括3/4MS-MS培養(yǎng)基、1.5-3mg/L IBA和25-35g/L蔗糖。

在一些實(shí)施方式中，步驟S3中生物反應(yīng)器中不定根的接種密度為10-15g/L，通氣速率為0.06-0.08vvm。

在一些實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器中不定根的暗培養(yǎng)時(shí)間為40-50d。

下面結(jié)合具體的實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本申請(qǐng)。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本申請(qǐng)而不用于限制本申請(qǐng)的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照國家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。若沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)，則按照通用的國際標(biāo)準(zhǔn)、常規(guī)條件、或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

實(shí)施例

本實(shí)施例提供了一種培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖的工業(yè)大麻不定根的方法，包括以下步驟：

1.1工業(yè)大麻無菌苗的誘導(dǎo)

選取顆粒飽滿的工業(yè)大麻種子，用自來水沖洗干凈，并篩選出品質(zhì)優(yōu)良的種子，之后在無菌操作臺(tái)中用75％乙醇消毒20-30s后，無菌水清洗；再用1％升汞處理9-10min，無菌水清洗，用無菌濾紙吸去種子表面的水分，接種至含MS培養(yǎng)基、30-40g/L蔗糖和7-8g/L瓊脂的固體培養(yǎng)基上，在25±2℃條件下光照16/8h(光照/黑暗)培養(yǎng)15-20d，獲得生長狀態(tài)較好的工業(yè)大麻無菌苗，備用；

1.2工業(yè)大麻不定根固體培養(yǎng)

為了篩選出最佳的固體培養(yǎng)條件，分別進(jìn)行了以下的篩選實(shí)驗(yàn)過程：

(1)外植體類型篩選

在無菌條件下，分別切取6-9個(gè)工業(yè)大麻無菌苗葉片(1×1cm)、莖段(1-2cm)和根尖(1-2cm)接種至含1/2MS-MS培養(yǎng)基、0.5-1mg/L的IBA、30-40g/L蔗糖和7-8g/L瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(pH＝5-6)中，進(jìn)行不定根的直接誘導(dǎo)培養(yǎng)，每個(gè)水平10個(gè)重復(fù)，收集不定根，調(diào)查其生物量。

結(jié)果見表1，當(dāng)接種葉片和根約7d后，長出不定根；培養(yǎng)30-40d后，不定根生長狀態(tài)較好，葉片、莖段和根的不定根誘導(dǎo)率分別達(dá)到93％、85％和98％，其鮮重達(dá)到0.44g/L，干重達(dá)到0.04g/L。說明葉部更適合用于工業(yè)大麻不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

表1外植體類型對(duì)工業(yè)大麻不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

外植體類型	誘導(dǎo)時(shí)間(d)	誘導(dǎo)率(％)	鮮重(g/L)	干重(g/L)
葉片	7±0.07	98±0.01	0.44±0.03	0.04±0.01
莖段	10±0.06	85±0.02	0.23±0.02	0.02±0.01
根尖	7±0.09	93±0.01	0.34±0.03	0.03±0.01

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝10)表示。

(2)增殖培養(yǎng)基類型篩選

為了篩選出最佳增殖培養(yǎng)基種類，將上一步的不定根培養(yǎng)6代后，分別接種在含B5、MS、1/2MS和WPM培養(yǎng)基中，并在每個(gè)培養(yǎng)基中均添加1mg/L的IBA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂(pH＝5-6)，在25±2℃條件下暗培養(yǎng)40d，收集不定根，并調(diào)查不定根的生物量。

結(jié)果見表2所示，接種在含有MS培養(yǎng)基中的不定根的生物量鮮重和干重分別為1.71±0.01g/L和0.12±0.01g/L，明顯高于其他培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的不定根的鮮重和干重。說明MS培養(yǎng)基有利于不定根的生長。

表2培養(yǎng)基類型對(duì)工業(yè)大麻不定根增殖培養(yǎng)的影響

  

  

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝10)表示。

(3)鹽強(qiáng)度篩選

將誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的不定根分別接種至含1/4MS、1/2MS、3/4MS和MS培養(yǎng)基中，并且每個(gè)培養(yǎng)基中均添加2mg/L的IBA、30g/L蔗糖和8g/L瓊脂(pH＝5-6)，在25±2℃條件下暗培養(yǎng)40d，收集不定根，并調(diào)查不定根的生物量。

結(jié)果見表3，在培養(yǎng)基濃度從1/4MS到3/4MS的條件下，不定根的生物量逐漸增加。在3/4MS培養(yǎng)基中，不定根的鮮重(1.76±0.01g/L)和干重(0.22±0.02g/L)達(dá)到最高，高于3/4MS時(shí)，生物量略有降低，但并無顯著變化。故在實(shí)際培養(yǎng)過程中選擇3/4MS-MS為適宜的鹽強(qiáng)度。

表3鹽強(qiáng)度對(duì)工業(yè)大麻不定根增殖培養(yǎng)的影響

鹽強(qiáng)度	鮮重(g/L)	干重(g/L)
1/4MS	1.24±0.03	0.26±0.01
1/2MS	1.32±0.02	0.20±0.01
3/4MS	1.76±0.06	0.24±0.02
MS	1.71±0.01	0.22±0.02

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝10)表示。

(4)激素類型和濃度篩選

為提升不定根的產(chǎn)量，分別評(píng)估了IBA、萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸(IAA)激素對(duì)不定根生長的影響，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

將誘導(dǎo)獲得的不定根分別接種至含不同激素種類(IBA、NAA和IAA)及濃度(0.5-4mg/L)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基包括3/4MS培養(yǎng)基、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH＝5,在25±2℃條件下暗培養(yǎng)30d后，收集不定根，并調(diào)查不定根的生物量。

結(jié)果見表4，IBA處理的不定根生物量及生長狀態(tài)要優(yōu)于其他生長素處理組(NAA和IAA)，當(dāng)培養(yǎng)基中添加2mg/L的IBA時(shí)，不定根鮮重(3.26±0.01g/L)和干重(0.31±0.02g/L)要高于1mg/L NAA和IAA的最佳處理組。而IAA(1mg/L)和NAA(1mg/L)對(duì)不定根生長的促進(jìn)作用不太明顯。故在實(shí)際培養(yǎng)過程中選擇1.5-3mg/L的IBA為適宜的激素條件。

表4激素對(duì)工業(yè)大麻不定根增殖培養(yǎng)的影響

  

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝10)表示。

為了進(jìn)一步準(zhǔn)確確定收集到的不定根中的多糖及CBD含量，本發(fā)明中采用液相色譜測(cè)定不定根中的多糖以及CBD含量，具體測(cè)試方法如下所示：

(1)待測(cè)樣品的制備

將不定根凍干樣品(0.1g)按照固液比(1:30)浸入90％(v/v)甲醇中，在50℃下超聲提取30min后過濾，重復(fù)提取3次，合并濾液作為待測(cè)樣品。

(2)CBD和大麻萜酚(CBG)含量測(cè)定

取待測(cè)樣品經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾后，采用高效液相色譜法測(cè)定。選用的色譜柱為C18反相色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)，波長225nm。流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，等度洗脫0～20min，A：80％。流動(dòng)相流速為1mL/min，CBD標(biāo)準(zhǔn)品的制備梯度濃度0.02-0.2mg/mL。通過分析標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積的關(guān)系，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CBD在不定根中的含量。但不定根中并未檢測(cè)到CBG物質(zhì)。

(3)多糖含量檢測(cè)

取0.5mL待測(cè)樣品和0.5mL的80％甲醇溶液混勻，加入1mL 5％的苯酚，然后再加入5mL濃硫酸，反應(yīng)30min后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)490nm的吸光度。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，不定根中總多糖的含量以毫克葡萄糖(純化≥98)當(dāng)量/g DW樣品表示。

2.1驗(yàn)證培養(yǎng)方式對(duì)工業(yè)大麻不定根的影響

為便于將來工業(yè)大麻不定根的大規(guī)模生產(chǎn)，對(duì)比了固體培養(yǎng)、搖瓶和生物反應(yīng)器培養(yǎng)的不定根中CBD和多糖含量。

在無菌條件下，取6-9個(gè)工業(yè)大麻不定根剪切至1-2cm左右接種到3/4MS-MS培養(yǎng)基、1.5-3mg/L IBA、30-40g/L蔗糖以及7-8g/L瓊脂(pH＝5-6)的培養(yǎng)皿中進(jìn)行固體培養(yǎng)；選取6-8g/L新鮮的不定根接種至含100-200mL液體培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，在25±2℃的90-110r/min轉(zhuǎn)速下暗培養(yǎng)30-40d，收獲不定根；再將4-6g/L新鮮的不定根剪切至1-2cm左右放入裝有1-2L液體培養(yǎng)基的3L氣升式生物反應(yīng)器中，將通氣速率調(diào)至0.05-0.1vvm，在25±2℃下暗培養(yǎng)30-40d。

結(jié)果見表5、圖1和圖2所示，從圖1中可發(fā)現(xiàn)搖瓶中生長的不定根呈淡黃色，且較長，表面并無白色“絨毛”，團(tuán)狀生長，其干重明顯高于固體培養(yǎng)，經(jīng)液相測(cè)試后不定根中CBD和多糖含量也顯著提升，分別達(dá)到0.57±0.01mg/g DW和518.81±0.01mg/g DW。而生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的不定根較長，產(chǎn)生較多的氣泡，其形態(tài)與搖瓶中的較為相似，不定根的干重提高至3.21±0.01g/L，明顯高于固態(tài)培養(yǎng)以及搖瓶培養(yǎng)。此外，經(jīng)過液相檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)生物培養(yǎng)器中的不定根積累了較多的CBD和多糖(0.81±0.02mg/g DW和569.32±0.01mg/g DW)，顯著高于其他兩種培養(yǎng)方式，由此說明生物反應(yīng)器能夠培養(yǎng)出高效生產(chǎn)CBD和多糖的工業(yè)大麻不定根。

表5培養(yǎng)皿、搖瓶和生物反應(yīng)器中不定根生長和CBD及多糖積累的結(jié)果

  

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝5)表示。

2.2工業(yè)大麻不定根生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系的建立

(1)篩選蔗糖濃度

在無菌條件下，取增殖培養(yǎng)后的不定根在生物反應(yīng)器中進(jìn)行2-3代增殖培養(yǎng)后，將4g/L新鮮的不定根剪切至1-2cm左右放入含3/4MS-MS培養(yǎng)基、1.5IBA和10-40g/L蔗糖的1-2L液體培養(yǎng)基(pH＝5-6)的3L氣升式生物反應(yīng)器中，將通氣速率調(diào)至0.05vvm，在25±2℃下暗培養(yǎng)30d后收集不定根，調(diào)查不定根的生物量，并檢測(cè)不定根中CBD及多糖含量。

結(jié)果見圖3，當(dāng)培養(yǎng)基中的蔗糖濃度由10g/L逐漸升高至30g/L時(shí)，不定根的生物量和CBD及多糖含量逐漸增加；蔗糖濃度高于30g/L時(shí)，不定根生物量和CBD及多糖含量逐漸降低。故在實(shí)際規(guī)?；囵B(yǎng)工業(yè)大麻不定根過程中選擇25-35g/L為適宜的蔗糖濃度，更有助于不定根的生長以及CBD及多糖含量的積累。

(2)篩選接種密度

分別取增殖培養(yǎng)后的5-20g/L新鮮工業(yè)大麻不定根接種至裝有含3/4MS培養(yǎng)基、1.5mg/L IBA和25g/L蔗糖的液體培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，將通氣速率調(diào)至0.05vvm，暗培養(yǎng)30d時(shí)，收集不定根進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果見圖4，當(dāng)在生物反應(yīng)器中接入5-10g/L不定根時(shí)，其生物量逐漸上升，此時(shí)CBD和多糖含量也在增加；當(dāng)接種密度高于10g/L時(shí)，不定根的生物量和CBD及多糖含量逐漸降低。故在實(shí)際規(guī)?；囵B(yǎng)工業(yè)大麻不定根過程中選擇10-15g/L為適宜的接種密度。

(3)篩選通氣速率

取增殖培養(yǎng)后的的10g/L新鮮工業(yè)大麻不定根接種至裝有含3/4MS培養(yǎng)基、1.5mg/L IBA和25g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，分別將通氣速率調(diào)至0.05-0.125vvm，暗培養(yǎng)30d時(shí)，收集不定根進(jìn)行調(diào)查。

結(jié)果見圖5，通氣速率在0.075vvm時(shí)，不定根生長狀態(tài)和CBD及多糖含量明顯提高。故在實(shí)際規(guī)模化培養(yǎng)工業(yè)大麻不定根過程中可選擇0.06-0.08vvm為適宜的通氣速率。

(4)動(dòng)態(tài)研究

取增殖培養(yǎng)后的10/L新鮮工業(yè)大麻不定根接種至裝有含3/4MS培養(yǎng)基、1.5mg/LIBA和25g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，將通氣速率調(diào)至0.06vvm，分別暗培養(yǎng)10-50d，收集不同時(shí)間段的不定根進(jìn)行調(diào)查。

結(jié)果見圖6，不定根培養(yǎng)至40-50d時(shí)，其生物量和CBD及多糖含量明顯升高。故在實(shí)際規(guī)模化培養(yǎng)工業(yè)大麻不定根過程中可選擇培養(yǎng)周期為40-50d。

綜上所述，本申請(qǐng)?zhí)峁┑呐囵B(yǎng)方法，能夠提高工業(yè)大麻葉片誘導(dǎo)的不定根成功率，優(yōu)化的增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為3/4MS-MS培養(yǎng)基、1.5-3mg/L的IBA和30-40g/L蔗糖濃度可明顯提高不定根產(chǎn)量，此時(shí)不定根的長勢(shì)較好，培養(yǎng)周期短；此外，不定根在含3/4MS-MS培養(yǎng)基、1.5-3mg/L IBA和25-35g/L蔗糖液體培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中接種10-15g/L不定根，通氣速率設(shè)為0.06-0.08vvm，暗培養(yǎng)40-50d時(shí)，此時(shí)不定根的干重及其CBD和多糖含量與搖瓶相比，分別提升了8.95倍、3.47倍和1.18倍。進(jìn)一步說明采用本發(fā)明中的生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系得到的工業(yè)大麻不定根能夠培養(yǎng)出高效生產(chǎn)CBD和多糖，該培養(yǎng)方式也具備規(guī)?；a(chǎn)的潛力。

因此，本申請(qǐng)不僅可以提高工業(yè)大麻不定根產(chǎn)量、CBD和多糖的積累，同樣也成功地實(shí)現(xiàn)了工業(yè)大麻不定根的擴(kuò)大培養(yǎng)，為利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)CBD和多糖提供了技術(shù)參考，也為解決人工栽培的工業(yè)大麻中CBD產(chǎn)量低的卡脖子難題建立了新途徑。

通過采用本發(fā)明公開的上述技術(shù)方案，得到了如下有益的效果：

本發(fā)明公開了一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)高效生產(chǎn)大麻二酚和多糖工業(yè)大麻不定根的方法，以工業(yè)大麻無菌苗葉片直接誘導(dǎo)生成不定根，節(jié)省了愈傷組織誘導(dǎo)環(huán)節(jié)，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)基組分和激素，縮短了培養(yǎng)周期，提高了不定根產(chǎn)量；通過優(yōu)化蔗糖濃度、接種密度、通氣速率和動(dòng)態(tài)研究等生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了短期內(nèi)培育出能大量生產(chǎn)穩(wěn)定的CBD和多糖的工業(yè)大麻不定根，解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不定根產(chǎn)量低、無法檢測(cè)CBD和多糖等問題；工業(yè)大麻不定根由培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)至生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)，培育過程不受季節(jié)、氣候、土壤條件的制約，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度和生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)了全年快速培育能夠生產(chǎn)高CBD和多糖的不定根。

 

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視本發(fā)明的保護(hù)范圍。

 

 

摘自國家發(fā)明專利，發(fā)明人：付玉杰;安曉麗;楊杰;焦驕;張謖;李洪權(quán)，申請(qǐng)?zhí)枺?/font>202311141683.8，申請(qǐng)日：2023.09.05