摘 要：工業(yè)大麻作為多用途經(jīng)濟作物，其相關產(chǎn)業(yè)及創(chuàng)新性應用蓬勃發(fā)展，對其種質資源提出更高的要求，因此根據(jù)不同產(chǎn)業(yè)需求培育多功能、抗逆性強的品種至關重要。轉錄組測序技術發(fā)展迅速，已被廣泛應用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學及生命科學等領域。利用轉錄組測序技術精準鑒定、深度發(fā)掘優(yōu)異基因并解析分子機理，對工業(yè)大麻品種遺傳改良及產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展具有重要意義。因此，研究闡述了轉錄組測序技術在工業(yè)大麻的基因組組裝、新基因挖掘、抗脅迫機制、分子育種及其纖維發(fā)育調控等領域的研究成果，以期為工業(yè)大麻分子育種研究提供參考。
關鍵詞：工業(yè)大麻；轉錄組；纖維產(chǎn)量；抗逆性；激素
工業(yè)大麻(Cannabis sativa L.)是大麻科、大麻屬(Cannabis L.)一年生直立草本植物，其四氫大麻酚(Tetrahydrocannabinol, THC)含量小于0.3%,不具有毒品利用價值，可進行種植加工及利用[1]。工業(yè)大麻作為最早種植的經(jīng)濟作物之一，在中國已有六千多年的栽種歷史[2],根據(jù)其用途，可將大麻分為纖用、籽用、藥用、籽纖兼用和纖藥兼用等類型[3]。據(jù)統(tǒng)計，世界上由大麻衍生出的產(chǎn)品達2萬多種，涉及紡織、造紙、食品、醫(yī)藥及復合材料等領域，如：麻皮可制成服裝、紙張、繩索等，其葉、花、根可以入藥，也可以用作土壤肥料；莖稈可制成密度板等新型復合材料，具有極高的經(jīng)濟價值[4]。
轉錄組測序技術(RNA-Seq),是指將高通量測序方法應用到由mRNA逆轉錄生成的cDNA上，能夠迅速準確獲得特定物種組織或器官在特定生理狀態(tài)下幾乎所有轉錄本序列信息和表達信息[5],該技術具有速度快、準確度高、操作成本低等優(yōu)勢[6]。隨著測序技術的發(fā)展，轉錄組測序技術在工業(yè)大麻的基因轉錄組、新基因挖掘、抗脅迫機制、分子育種及其纖維發(fā)育調控等研究領域獲得重大突破，在缺少參考基因組的條件下，轉錄組測序技術不僅能獲得樣本中的序列信息，還能對序列的表達量進行定量分析，研究差異基因的表達情況[7,8]。由于工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展以及創(chuàng)新性應用如火如荼，當下產(chǎn)業(yè)發(fā)展對種質資源提出更高的要求，同時工業(yè)大麻種植也逐步由耕地向條件惡劣的非種植地擴大轉移，這使培育多功能、抗逆性強工業(yè)大麻品種迫在眉睫[9],因此精準鑒定、深度發(fā)掘優(yōu)異基因和特色品種資源并解析其分子機理，對工業(yè)大麻品種遺傳改良及產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展至關重要。伴隨著轉錄組技術和生物信息的迅速發(fā)展以及測序成本的減少，轉錄組測序技術在工業(yè)大麻中廣泛應用。因此，本文闡述了轉錄組測序技術在工業(yè)大麻上的研究現(xiàn)狀，并展望了其在工業(yè)大麻中的應用前景。
1 轉錄組測序分析相關概念
轉錄組的概念最早于1995年由Velculescu提出，廣義上指特定生理條件下，細胞內所有轉錄產(chǎn)物的集合，主要包括mRNA和非編碼RNA,狹義上指所有編碼蛋白質的mRNA的總和[10]。轉錄組測序在有參考基因的條件下，可以進行序列可變剪切的調控[11,12,13]、轉錄圖譜的繪制[14,15]、基因家族篩選及驗證分析[16];在沒有參考基因組的條件下，轉錄組測序也可以進行新基因的深度挖掘[17,18,19]、代謝途徑的確定[20]和低豐度轉錄本的發(fā)掘[21,22]。轉錄組學研究涉及的方法多樣，如雜交技術、cDNA芯片、高通量測序等?，F(xiàn)階段轉錄組學研究主要使用高通量測序技術，通過高通量測序技術反映某一物種的mRNA特定情況和時間點下基因的表達情況[8]。
高通量測序技術(High-throughput sequencing)又稱為“下一代測序技術”,指能夠一次同時對大量核酸分子進行平行序列測定的技術[23]。自1953年沃森、克里克通過雙螺旋結構認識核酸的空間結構后，人們開始探究其序列信息，測序技術發(fā)展也由此拉開序幕。1977年生物化學家Sanger發(fā)明了鏈終止測序法，至今仍被人們認為是第一代測序技術。隨著測序需求日益增多，第一代測序法費時費力、成本高，已不能滿足人們的需求，因此開發(fā)出第二代測序技術。第二代測序技術以更低的成本實現(xiàn)了高通量和自動化，同時還提升了測序的分辨率，優(yōu)化了RNA剪切修飾功能[24]。目前，在二代測序平臺中，454測序技術平臺最早實現(xiàn)商業(yè)化[25,26]。但存在的問題是，第二代測序技術需要從頭組裝并且拼接過程比較復雜，且只能對基因的局部結構進行檢測，具有一定的局限性[27],因此，第三代代表性測序技術中的單分子實時測序技術，其通量高且測序讀數(shù)長，測序過程無須進行PCR擴增和打斷，能直接獲得完整的轉錄本，但正因為在測序時沒有經(jīng)過模板擴增，其測序信號的檢測與邊合成邊測序的二代測序技術相比較弱，易在堿基識別時產(chǎn)生隨機錯誤[28],因此第三代測序準確度比前兩代低，且測序成本較高，目前更多研究還是以二代測序技術為主[29]。
現(xiàn)如今，轉錄組測序技術已發(fā)展成為重要的分子生物學分析方法，被廣泛應用于各研究領域。近年，工業(yè)大麻轉錄組學測序是比較活躍的領域，了解其基因表達、分析其功能和調控機制、挖掘功能基因以及開展次生代謝產(chǎn)物途徑等研究，有助于在其遺傳育種理論與技術途徑領域獲得新突破，為育種研究提供有益指導。
2 工業(yè)大麻轉錄組測序研究進展
2.1 工業(yè)大麻基因組及關鍵活性成分研究
從2011年工業(yè)大麻基因組草圖發(fā)表到2020年5月公安部物證鑒定中心發(fā)表了一個高質量染色體水平的野生大麻參考基因組，標志著工業(yè)大麻逐步進入了基因組時代[30]。Van等[31]利用轉錄組和基因測序技術對高含量四氫大麻酚酸(Tetrahydrocannabidiol acid THCA)的大麻品種Purple Kush (PK)及低含量THCA品種“Finola”和“USO-31”進行對比分析，得到一個534 Mb 的PK基因組草圖，同時也發(fā)現(xiàn)THCA合成酶(Tetrahydrocannabinol synthase THCAS)在大麻素合成通路顯著上調，且在PK中表達遠高于Finola品種，該研究不僅進一步明確了大麻轉錄組的特征，同時也為后續(xù)培育具有大麻素特征的品種及揭示工業(yè)大麻基因型和化學型的遺傳關系奠定了基礎。
大麻素類化合物作為工業(yè)大麻活性成分具有多種功效，目前已從大麻中分離鑒定150余種，其中大麻酚(Cannabinol, CBN)、大麻二酚(Cannabidiol, CBD)和THC在醫(yī)藥領域應用廣泛[32]。CBD具有抗菌、消炎以及抗腫瘤等多種價值。為了探究通過栽培手段合成CBD的環(huán)境影響機制，嚴江濤[33]利用RNA-Seq對室外和室內兩種培育環(huán)境下工業(yè)大麻品系C4的CBD合成分子機制進行分析，發(fā)現(xiàn)在室外培育條件下，BDAS、CYP86B1和ALDH2C4這些基因表達量比室內條件明顯增加，也發(fā)現(xiàn)苯丙酸生物合成途徑主要調控CBD的合成，該研究明確了調控CBD合成的主要代謝通路，并推測BDAS、CYP86B1和ALDH2C4這些基因參與CBD的合成，同時除了培養(yǎng)環(huán)境對工業(yè)大麻CBD合成有影響，施加外源激素對CBD合成機制也有一定作用。吳珊[34]利用20 mg/L激動素(KT)對工業(yè)大麻材料DMG227噴施處理30 d并進行轉錄組測序，與無外源激素處理比較分析，發(fā)現(xiàn)KT噴施處理可調控大麻植物體內的次生代謝途徑，從而使植株的CBD與THC含量明顯升高，同時倍半萜和三萜生物合成次生代謝途徑富集到許多萜烯合酶基因家族，且這些萜烯合酶基因顯著表達。因此猜測，CBD和THC含量增加與KT處理調控萜烯合酶的表達有關。為進一步探究大麻素生物合成途徑中基因的表達水平，Braich等[35]利用雌性工業(yè)大麻的根、莖、花等組織構建和注釋了基因表達的轉錄組圖譜，并與雄性工業(yè)大麻營養(yǎng)組織和生殖組織進行基因差異比較分析，挖掘出大量與大麻素合成相關的候選基因CsTPS5FN、CsTPS9FN和CsTPS12PK。
在繼利用轉錄組測序技術挖掘工業(yè)大麻活性成分合成酶及關鍵基因后，Varaerg等[36]基于來自不同譜系的69個大麻品種的全基因組序列，通過對數(shù)據(jù)進行組裝及從頭測序分析，發(fā)現(xiàn)大麻素合成途徑編碼CBDA/THCA合成酶基因在基因拷貝數(shù)(CN)上存在差異，并獲得多個CBDA/THCA合成酶基因家族的同源基因，該研究驗證了轉錄組研究結果，并從基因組水平上解釋了大麻素含量變化的調控機理。同時，Zager等[37]通過對9個不同品種工業(yè)大麻的腺毛進行轉錄組和代謝組分析，利用加權基因共表達網(wǎng)絡分析方法揭示了一個與大麻素和萜類化合物生物合成相關基因的共表達網(wǎng)絡，鑒定出之前未曾報道過的基因：編碼橙花醇的TPS18VF、編碼芳樟醇合成酶的TPS19BL、編碼大根香葉烯B合酶的TPS16CC和編碼四甲基環(huán)癸二烯甲醇合酶的TPS20CT(表2)[38]。這些研究為進一步利用轉錄組測序技術挖掘工業(yè)大麻活性成分關鍵基因，提取次級代謝產(chǎn)物以及聯(lián)合多組學數(shù)據(jù)闡述大麻素合成機制提供了參考。
2.2 工業(yè)大麻纖維相關轉錄組研究
2.2.1 工業(yè)大麻纖維發(fā)育轉錄組研究
“國紡源頭，萬年衣祖”,工業(yè)大麻纖維強度高，耐磨性好，具有天然抑菌和防紫外線等特性，因此以工業(yè)大麻韌皮纖維為原材料的食藥、日化、紡織、新材料等產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，其產(chǎn)品廣受人們追捧[39]。
工業(yè)大麻下胚軸韌皮纖維存在由伸長到增厚的過渡階段，因此工業(yè)大麻是研究二次生長過程的最佳模型[40]。在纖維發(fā)育方面，Guerriero等[41]對雌雄同株工業(yè)大麻的3個不同韌皮部位進行RNA-Seq分析，通過對不同纖維發(fā)育時期基因富集轉錄本的分析，發(fā)現(xiàn)每個莖區(qū)的纖維具有特定的轉錄組特征，細胞壁沉積等相關過程主要發(fā)生在莖折斷點的節(jié)間，還發(fā)現(xiàn)了調控細胞周期和光合反應的相關基因如CAB1(葉綠素結合蛋白1)、LHCB4和LHCA5(光合復合物),以及與次生代謝物即萜類化合物、類黃酮生物合成相關的基因，如CYP76C1(編碼細胞色素P450s)和C2(參與花芳樟醇代謝),這些基因對韌皮纖維發(fā)育發(fā)揮重要作用，同時在較老的莖節(jié)部發(fā)現(xiàn)植物激素生物合成的相關基因(如GA20OX2和GA3OX1編碼赤霉素合成酶)、次級細胞壁沉積和與木質素生物合成相關的基因(如PAL1、CesA8、EXPA8、EXPA10、EXPA11、EXPA12)表達量均較高。該研究應用轉錄組測序技術不僅確定了細胞壁沉積發(fā)生的部位，還挖掘出參與纖維發(fā)育和激素合成的基因，更深入地探究了工業(yè)大麻纖維發(fā)育分子機制。
植物激素作為重要的信號分子，對調節(jié)植物的生長發(fā)育和環(huán)境應答具有十分重要的作用。通過對植物進行外源激素處理，可調節(jié)植物的次生代謝物合成，不同濃度外源激素對工業(yè)大麻組織發(fā)育皆有一定程度的影響。Guerriero等[42]對播種后16、17、18、20d的幼苗噴灑茉莉酸(JA),利用RT-qPCR對其下胚軸進行基因表達分析，結果發(fā)現(xiàn)，JA對下胚軸的木質素含量具有積極作用，可通過JA對下胚軸直徑的影響程度來反映其對次生生長的影響，下胚軸直徑的增加會導致次生韌皮部纖維數(shù)量增多。同時，內源激素的積累對植物的生長發(fā)育也發(fā)揮著重要作用，Marc等[40]選擇工業(yè)大麻4個具有代表性的發(fā)育階段進行了植物激素的轉錄組學和定量分析，結果顯示，次生生長開始有植物激素(生長素、JA及細胞分裂素等)參與調控，尤其是JA,其含量在發(fā)育的15d達到峰值，而細胞分裂素則起到調節(jié)次生組織中木質素沉積的作用，這些植物激素對細胞壁生物合成都至關重要。該研究結合生理與轉錄組測序結果探究了大麻下胚軸從初級生長向次級生長過渡的分子機制，最終不僅證明了內源激素密切參與次生生長和細胞壁沉積，也證明了JA和生長素調節(jié)節(jié)間部分次級細胞壁相關基因表達。在此研究基礎上，Behr等[43]通過對工業(yè)大麻莖節(jié)點3個不同部位進行RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)工業(yè)大麻節(jié)點處存在從纖維伸長到纖維增厚的轉變，還發(fā)現(xiàn)了與細胞壁沉積相關的基因(如CesA6、FLA2和FLA6),同時在節(jié)點內、外部存在差異表達如：NST1調節(jié)纖維分化因子，MYB46-1作為參與細胞壁生物合成和木聚糖生物合成的轉錄因子在節(jié)點內部高表達，調控細胞壁沉積的FLA3和WAT1在外部組織中高表達，因此，可推測工業(yè)大麻不同部位在纖維發(fā)育過程中存在生理和分子水平上的差異。同時，Van等[44]利用轉錄組測序技術對兩個不同品種的工業(yè)大麻Chameleon和Felina 34在不同發(fā)育階段的不同組織進行比較研究，發(fā)現(xiàn)其差異基因木質素生物合成基因(THF)和甲基化循環(huán)編碼酶(CCoAOMT、COMT)在稈芯組織中高表達，并調控木質素的合成，同時在工業(yè)大麻伸長期的莖韌皮組織中，也發(fā)現(xiàn)了與苯丙素生物合成和次級細胞壁纖維素合成酶相關的基因顯著表達[39]。這些研究為逐步揭示工業(yè)大麻纖維發(fā)育的轉錄組學機理、挖掘功能性基因以及生物合成代謝途徑提供了重要信息。
2.2.2 工業(yè)大麻纖維產(chǎn)量品質轉錄組研究
工業(yè)大麻纖維產(chǎn)量的差異是內因(基因型、生理)和外因(環(huán)境、農(nóng)藝措施)共同作用的結果。品種的產(chǎn)量和品質差異是不同環(huán)境和栽培手段的最終體現(xiàn)[45,46]。關于不同品種纖維產(chǎn)量和品質差異，Musio等[47]將傳統(tǒng)的綠莖品種與黃莖品種在兩個收獲時期(花期和工藝成熟期)進行比較，發(fā)現(xiàn)黃莖品種的纖維提取效率均比綠莖品種的高，該研究為挑選高纖維工業(yè)大麻品種提供了思路。即使在相同生長環(huán)境下，品種間的產(chǎn)量也被證實存在明顯差異[48,49]。因此提高纖維產(chǎn)量，選育高產(chǎn)、優(yōu)質的品種，并探索和規(guī)范高效配套種植技術至關重要。
工業(yè)大麻纖維發(fā)育可分為3個階段：發(fā)育起始階段、伸長階段、細胞壁增厚階段，經(jīng)過這3個階段逐步過渡可實現(xiàn)工業(yè)大麻從產(chǎn)量到品質的轉變[39]。Koziel等[50]利用RNA-Seq對工業(yè)大麻韌皮纖維木質化及次生壁發(fā)育進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)大麻纖維轉變的最佳靶基因是咖啡酸甲基轉移酶Ⅱ(COMT2)、阿魏酸5羥基化酶(F5H)和β-D半乳糖苷酶(BGAL)。也有研究者利用RNA-Seq和全基因組關聯(lián)分析協(xié)同對123份大麻材料的纖維品質相關性狀進行遺傳分析，對不同纖維品質性狀的16個QTL進行定位(葡萄糖、木質素、韌皮纖維含量等),推測這些物質對纖維品質起著重要作用[51]。上述研究挖掘出纖維產(chǎn)量及品質相關基因及生物代謝途徑，除遺傳因素外，有研究表明，工業(yè)大麻性別可影響其纖維產(chǎn)量和品質[52],工業(yè)大麻多為雌雄異株，而雄麻纖維品質優(yōu)于雌麻，因此，Prentout等[53]采用概率性方法SEX-DETector 對工業(yè)大麻所有基因進行分離和分析，鑒定出約500多個與性別連鎖的基因，再通過RNA-Seq技術將這些基因映射，組裝獲得了大麻性染色體，從而了解了工業(yè)大麻性染色體系統(tǒng)。作為迄今為止記載最為久遠的植物性染色體系統(tǒng)，推測其具有很大及高度分散的非重組區(qū)域，該研究通過了解工業(yè)大麻性染色體系統(tǒng)，相當于了解了其基因組信息。
通過上述轉錄組測序對工業(yè)大麻纖維發(fā)育及產(chǎn)量品質進行研究，挖掘出許多相關基因(表1)。在工業(yè)大麻下胚軸次生生長過程中，也有研究者利用轉錄組測序技術陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了與韌皮纖維伸長相關的XTH基因(如XTH5和XTH8)[54,55,56,57,58]和轉錄因子NST1、MYB46和WLIM1,參與纖維素生物合成的COBRA家族[7](COB和COBL4基因),以及次生細胞壁纖維素合成酶基因(CesA4、CesA7和CesA8)[42,43,44,45]。
表1 轉錄組測序篩選出的部分已知工業(yè)大麻基因 導出到EXCEL
3 工業(yè)大麻非生物脅迫轉錄組研究
3.1 鹽脅迫
鹽害是一種常見的非生物脅迫，土壤鹽分過多會破壞土壤溶液滲透壓平衡，抑制植株細胞呼吸等生命活動，從而影響植物的生長發(fā)育，嚴重時可導致植株死亡。我國鹽堿地逐年增長且分布范圍逐漸擴大，隨著我國人口增加和耕地不足矛盾日益凸顯，篩選抗性品種、加強鹽堿地利用以及開展邊際土壤改良是今后農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要方向，開展工業(yè)大麻耐鹽堿性研究、培育耐鹽品種具有重要應用價值。工業(yè)大麻不同品種和不同生育期對鹽的敏感程度不同，在重度鹽環(huán)境下不能生長[59]。蘇文君等[60]首次利用7個工業(yè)大麻品種通過水培法對其萌發(fā)期和幼苗期進行NaCl脅迫研究，篩選不同條件下大麻幼苗期耐鹽性評價指標，綜合比較品種的耐鹽性發(fā)現(xiàn)：皖麻1號耐鹽性最強，巴馬火麻耐鹽性最弱，并且篩選出株高、莖粗、鮮重和干重等6個衡量耐鹽性指標。在此基礎上，另有研究者[61]以不同濃度NaCl水溶液模擬鹽脅迫，對上述7個工業(yè)大麻品種在萌發(fā)期和苗期的耐鹽性進行對比研究：140 mmol/L NaCl是大麻品種進行耐鹽性鑒定的適宜濃度，且不同大麻品種在不同發(fā)育時期的耐鹽性存在較大差異，如在萌發(fā)期，晉麻1號是耐鹽品種，巴馬火麻是不耐鹽品種，而在苗期，晉麻1號是不耐鹽品種，巴馬火麻是耐鹽品種，研究者推測可能是大麻品種在不同時期具有不同耐鹽機理，萌發(fā)階段更多是通過抵抗?jié)B透脅迫來維持生長發(fā)育，而苗期則是啟動抵抗離子毒害程序。為了解工業(yè)大麻不同品種耐鹽性相關基因，劉家佳等[62]利用500mmol/L NaCl對2個工業(yè)大麻品種植株葉片分別處理0、2、4、6d，結合生理指標測定及轉錄組測序結果，發(fā)現(xiàn)2種大麻生理反應在脅迫2d時最激烈，并在2個大麻品種中鑒定出都顯著上調的與耐鹽相關的轉錄因子(MYB、NAC、GATA和HSF)。目前，NAC轉錄因子已被大量證實響應植物鹽脅迫，胡華冉等[63]基于劉家佳的研究基礎，篩選出4個鹽脅迫應答基因(CsNAC1、CsNAC2、CsGDH2和CsNAC3)。植株根部會采取不同的耐鹽策略響應鹽堿脅迫，Cao等[64]以耐受型品種火麻一號根部組織為材料，利用RNA-Seq開展了NaHCO3脅迫下根部基因表達機制研究，發(fā)現(xiàn)在NaHCO3脅迫下植物可能通過調控激素信號轉導與合成、苯丙素生物合成、淀粉、蔗糖、氮、氨基酸等代謝途徑響應脅迫，并發(fā)現(xiàn)關鍵通路的樞紐基因與GTP結合蛋白、谷氨酸合成酶、海藻糖磷酸、糖基轉移酶和木質素合成相關。該研究利用轉錄組測序技術與共表達網(wǎng)絡分析聯(lián)合闡明了工業(yè)大麻對NaHCO3脅迫的分子響應機制。此外也有研究者從蛋白質組學角度，利用相對和絕對定量同位素標記技術(iTRAO)開展耐鹽性品種的鹽脅迫蛋白應激機制研究，結果表明，耐鹽型工業(yè)大麻能夠通過提高能量代謝、調節(jié)光合代謝來促進有機物的滲透及合成，并通過調節(jié)細胞物質的進出穩(wěn)定細胞內外物質平衡來適應脅迫[58,65]。上述研究，轉錄組學與蛋白質組學結果相互呼應，為下一步綜合解析組學數(shù)據(jù)進行工業(yè)大麻鹽堿適應機制研究提供了基礎參考。
3.2 干旱脅迫
水分作為植物的生命之源，也會對植物造成脅迫，可分為兩種情況，第一種是干旱脅迫，是指植物在缺水的環(huán)境中生長，本質是因缺水抑制植物光合作用等生長發(fā)育活動；第二種是淹水脅迫，則是由于水分過多從而抑制植物根部的細胞呼吸，降低光合速率，進而干擾植物正常生長。工業(yè)大麻干旱脅迫的研究更多采用不同生理指標參數(shù)進行抗旱性評價，從而篩選抗旱能力強的品種[66,67,68,69]。另外也有研究者通過轉錄組測序技術研究外源物質對干旱脅迫下工業(yè)大麻脅迫的應答機制，如楊志晶等[70]采用盆栽稱重控水法模擬干旱脅迫(50%基質含水量)對“云麻1號”進行不同濃度的維生素C、甜菜堿、CaCl2和赤霉素處理，結合轉錄組測序結果分析其抗旱生理響應結果，發(fā)現(xiàn)外源物質可通過調節(jié)大麻的葉綠素、脯氨酸和可溶性糖的含量來緩解干旱損傷。烯效唑(S3307)作為一種高效低毒的三唑類植物生長延緩劑，在植物抗逆和增產(chǎn)方面效果顯著，通過外源噴施S3307及干旱脅迫協(xié)同處理，姜穎等[67]通過對工業(yè)大麻品種漢麻2號進行RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)，S3307通過調控植物激素信號轉導、光合作用、卟啉與葉綠素代謝等代謝通路中DEGs的表達來緩解干旱脅迫對工業(yè)大麻生長發(fā)育的損害，同時鑒定出S3307誘導調控干旱脅迫的差異基因IINV、TREH、PYG(3)、GBE1(2)、TPS(7)和β-淀粉酶。此外，Gao等[71]通過RNA-Seq分析篩選出與工業(yè)大麻抗旱性有關的過氧化物酶、擴展蛋白、肌醇加氧酶、NAC和B3的轉錄因子。上述研究通過轉錄組測序技術，發(fā)現(xiàn)工業(yè)大麻外施S3307等外源生長調節(jié)劑可調控光合作用、葉綠素等代謝途徑，以此來提高工業(yè)大麻的干旱適應能力。
3.3 重金屬脅迫
重金屬主要指汞、鎘、鉛、鉻、銅和鋅類金屬砷等，重金屬對作物的影響從種子萌發(fā)階段開始，而種子能否萌發(fā)和是否正常萌發(fā)是決定作物產(chǎn)量和品質的關鍵[72]。李增強等[73]研究發(fā)現(xiàn)，紅麻幼苗通過調節(jié)自身生命活動過程及代謝物來應對鉛脅迫，該結果為研究分析麻類作物應對重金屬脅迫提供了重要參考信息。為了明確工業(yè)大麻在重金屬脅迫下的研究機理，黃玉敏[74]對鎘脅迫處理12h下的工業(yè)大麻“Yuma 1”(Ym)和“Neimengguxiaoli”(Nx)的根部組織進行RNA-Seq分析，發(fā)現(xiàn)在鎘脅迫處理下，Ym品種比Nx品種耐鎘能力強，還發(fā)現(xiàn)在鎘脅迫時，工業(yè)大麻會啟動光合作用系統(tǒng)，并通過加快谷胱甘肽代謝等生物合成途徑來抵抗鎘毒害。在該研究基礎上，研究者在鎘處理條件下對兩個鎘耐受性不同的工業(yè)大麻進行差異基因表達分析，發(fā)現(xiàn)Ym耐受品種比Nx敏感品種具有更強的運輸和累積能力，Ym顯示了更強的解毒能力，同時通過RNA-Seq分析也在兩個品種間鑒定出調控重金屬運輸和氧化還原過程的且與鎘耐受相關的基因(WRKY、Myb和NAC轉錄因子)[75]。通過上述兩個研究可知，Ym品種抗鎘性強，從基因水平揭示分子機制，挖掘抗鎘相關基因。同時，在探討緩解鎘脅迫對工業(yè)大麻影響技術方法方面，尹明[76]在有無原花青素的不同處理下協(xié)同鎘脅迫進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)外源原花青素與鎘離子會同時作用于EDS1基因。因此推測該基因具有降低大部分植物激素相關基因表達量的功能，從而使植株利用原花青素與水楊酸，并通過光合作用、次級代謝物合成和抗氧化物質合成等相關途徑來緩解鎘脅迫帶來的影響。
4 問題與展望
工業(yè)大麻用途廣泛，而國內工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)主要圍繞纖維和籽實開展相關產(chǎn)品開發(fā)，且采用的原料幾乎不含有THC,醫(yī)藥用途目前也僅利用CBD成分[77]。隨著轉錄組測序技術的發(fā)展，研究者通過工業(yè)大麻的基因組序列和表達信息開展調控關鍵性狀基因位點及代謝物合成途徑挖掘研究，將為解析調控優(yōu)異性狀分子機理奠定重要基礎[7]。然而相對其他麻類作物，工業(yè)大麻轉錄組研究大多集中于纖維發(fā)育基因表達調控及活性成分合成途徑，對于影響纖維和籽實等產(chǎn)量性狀關鍵調控因子、抗逆作用機制的研究還有很大的空間，同時，隨著工業(yè)大麻藥用價值日益提升，圍繞CBN和大麻萜酚(Cannabigerol, CBG)等稀有成分的生物合成途徑研究也將成為重點。近兩年，單細胞轉錄組測序技術和空間轉錄組技術發(fā)展快速[78],并已開始應用到不同作物的研究中，接下來可以結合上述技術，彌補常規(guī)轉錄組技術方法研究的不足，并通過多組學聯(lián)合、生物工程等不同分子生物學方法共同闡明工業(yè)大麻重要性狀的表達調控策略，挖掘功能基因及揭示其遺傳多樣性。
參考文獻
[1] 劉文科.工業(yè)大麻植物工廠栽培優(yōu)勢與技術需求分析[J].農(nóng)業(yè)工程技術，2021,13(41):19-22.
[2] 韓承偉，孫延波.黑龍江省發(fā)展工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)前景廣闊[J].黑龍江科技信息，2012(34):1.
[3] 解國慶，董清山，范書華，等.八個不同基因型工業(yè)大麻(藥用)在黑龍江省東南部的適應性評價[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2021(6):4.
[4] 張曉艷，孫宇峰，韓承偉，等.我國工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及策略分析[J].特種經(jīng)濟動植物，2019,8:26-28
[5] White N M,Cabanski C R,Silva-Fisher J M,et al.Transcriptome sequencing reveals altered long intergenic non-coding RNAs in lung cancer[J].Genome Biology,2014,15(8):429.
[6] Bräutigam A,Gowik U.What can next generation sequencing do for you?[J].Plant Biology,2010,12(6):831-841.
[7] 徐益，張力嵐，祁建民，等.主要麻類作物基因組學與遺傳改良：現(xiàn)狀與展望[J].作物學報，2021,47(6):997-1019.
[8] 韋秀葉，趙信林，郭媛，等.麻類作物轉錄組測序分析研究進展[J].中國麻業(yè)科學，2020,42(3):128-134.
[9] 粟建光，戴志剛，楊澤茂，等.麻類作物特色資源的創(chuàng)新與利用[J].植物遺傳資源學報，2019,20(1):11-19.
[10] 紀嶺，李小金.轉錄組測序(RNA-seq)技術及其應用[J].農(nóng)技服務，2015,32(7):2.
[11] Lai K,Duran C,Berkman P J,et al.Single nucleotide polymorphism discovery from wheat next generation sequence data[J].Plant Biotechnology Journal,2012,10(6):743-749.
[12] ZHOU Y,YANG P,XIE S,et al.Comparative transcriptome analysis reveals sex-based differences during the development of the adult parasitic wasp cotesia vestalis (hymenoptera:braconidae)[J].Genes,2021,12(6):896.
[13] Grit H,Thomas S,Michael S,et al.From RNA-seq to large-scale genotyping-genomics resources for rye (Secale cereale L.) [J].BMC Plant Biology,2011,11(1):131-143.
[14] Massa A N,Childs K L,Lin H,et al.The transcriptome of the reference potato genome Solanum tuberosum group Phureja clone DM1-3 516R44[J].Plos One,2011,6(10):e26801.
[15] LI X,WU J,XIAO X,et al.Characterization and complexity of transcriptome in gymnocypris przewalskii using single-molecule long-read sequencing and RNA-seq[J].DNA Research,2021,28(3):25.
[16] YAN H F,ZHOU H W,LUO H M,et al.Characterization of full-length transcriptome in Saccharum officinarum and molecular insights into tiller development[J].BMC plant biology,2021,21(1):228.
[17] WANG Y,ZENG X,Iyer N J,et al.Exploring the switchgrass transcriptome using second-generation sequencing technology[J].Plos One,2012,7(3):e34225.
[18] 慧芳，劉秀巖，李宗諭，等.轉錄組測序技術在藥用植物研究中的應用[J].中草藥，2019,50(24):6149-6155.
[19] MIAO H,WANG Y,WEN P H,et al.De novo,sequencing of Hypericum perforatum,transcriptome to identify potential genes involved in the biosynthesis of active metabolites[J].Plos One,2012,7(7):e42081.
[20] PENG Z,HE Y H,Parajuli S,et al.Integration of early disease-resistance phenotyping,histological characterization,and transcriptome sequencing reveals insights into downy mildew resistance in impatiens[J].Horticulture Research,2021,8(1):108.
[21] FAN J,Slowikowski K,ZHANG F,et al.Single-cell transcriptomics in cancer:computational challenges and opportunities.[J].Experimental &molecular medicine,2020,52(9):1452.
[22] LU J,DU Z X,KONG J,et al.Transcriptome analysis of Nicotiana tabacum infected by cucumber mosaic virus during systemic symptom development[J].Plos One,2012,7(8):e43447.
[23] 郭海燕，程國虎，李擁軍，等.高通量測序技術及其在生物學中的應用[J].當代畜牧，2016,12:61-65.
[24] 張丁予，章婷曦，王國祥.第二代測序技術的發(fā)展及應用[J].環(huán)境科學與技術，2016,39(9):96-102.
[25] 徐疏梅.新一代DNA測序技術的應用與研究進展[J].徐州工程學院學報(自然科學版),2018,33(4):60-64.
[26] 崔凱，吳偉偉，刁其玉.轉錄組測序技術的研究和應用進展[J].生物技術通，2019,5(7):1-9.
[27] 王瑞嫻，李川.全長轉錄組測序技術在非模式植物轉錄組學研究中的應用[J].分子植物育種，2019,17(2):502-508.
[28] 楊春，吳文雪，于小淇，等.單分子測序技術法醫(yī)學應用研究進展[J].中國法醫(yī)學雜志，2021,36(3):302-305.
[29] 王楚彪，盧萬鴻，林彥，等.轉錄組測序的發(fā)展和應用[J].桉樹科技，2018,35(4):20-26.
[30] 張立武.專題導讀：加強麻類作物基因組學研究，推動優(yōu)異等位基因發(fā)掘及種質創(chuàng)新[J].作物學報，2021,47(6):993-996.
[31] Van Bakel H,Stout J M,Cote A G,et al.The draft genome and transcriptome of Cannabis sativa[J].Genome biology,2011,12(10):1-18.
[32] 隋新，楊帆，付東，等.影響大麻素含量的主要因素[J].黑龍江科學，2023,14(6):11-13.
[33] 嚴江濤.大麻二酚抗氧化活性研究及不同環(huán)境差異下轉錄組分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2020.
[34] 吳姍.外源激素對大麻中大麻素含量的影響及轉錄組分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2020.
[35] Braich S,Baillie R C,Jewell L S,et al.Generation of a comprehensive transcriptome atlas and transcriptome dynamics in medicinal cannabis[J].Scientific Reports,2019,9(1):1-12.
[36] Varaerg D,Huscher E L,Keepers K G,et al.Gene copy number is associated with phytochemistry in Cannabis sativa[J].Aob Plants,2019,11(6):plz074.
[37] Zager J J,Lange I,Srividya N,et al.Gene net works underlying cannabinoid and terpenoid accumulation in Cannabis[J].Plant Physiology,2019,180:1877-1897.
[38] 劉晶晶，王富民，劉國峰，等.茶樹萜類香氣物質代謝譜與相關基因表達譜時空變化的關系[J].園藝學報，2014,41(10):2094-2106.
[39] 趙越，王曉楠，孫宇峰，等.工業(yè)大麻纖維產(chǎn)量，品質影響因素及纖維發(fā)育相關基因研究進展[J].中國麻業(yè)科學，2021,43(3):155-160.
[40] Marc B,Sylvain L,Eva ΖΖ,et al.Studying secondary growth and bast fiber development:the hemp hypocotyl peeks behind the wall[J].Frontiers in Plant Science,2016,7(19):1733.
[41] Guerriero G,Behr M,Legay S,et al.Transcriptomic profiling of hemp bast fibres at different developmental stages[J].Scientific Reports,2017,7(1):1-11.
[42] Guerriero H G.Jasmonic acid to boost secondary growth in hemp hypocotyl[J].Journal of Plant Biology,2018,248(4):1029-1036.
[43] Behr M,Legay S,Hausman J F,et al.Molecular investigation of the stem snap point in textile hemp[J].Genes,2017,8(12):363.
[44] Van den Broeck H C,Maliepaard C,Ebskamp M J M,et a1.Differential expression of genes involved in C1 metabolism and lignin bio-synthesis in wooden core and bast tissues of fibre hemp(Cannabis sativa L.)[J].Plant Science,2008,174(2):205-220.
[45] 劉浩.影響工業(yè)大麻產(chǎn)量因素的研究[D].昆明：云南大學，2015.
[46] 孔佳茜，趙銘森，孟曉康，等.不同工業(yè)大麻品種在山西地區(qū)的適應性分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2019,47(10):1803-1805.
[47] Musio S,Müssig J,Amaducci S.Optimizing hemp fiber production for high performance composite applications[J].Frontiers in Plant Science,2018,9:1702.
[48] 潘冬梅，孫宇峰，韓承偉，等.3個烏克蘭工業(yè)大麻品種在黑龍江省大慶地區(qū)引種試種試驗總結[J].中國麻業(yè)科學，2018,40(6):270-276.
[49] 董曉慧，單大鵬，姜輝，等.24個纖用工業(yè)大麻品種(系)比較試驗及主要性狀與產(chǎn)量關系分析[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2022(3):108-112.
[50] Koziel S P.Genetic analysis of lignification and secondary wall development in bast fibers of industrial hemp(Cannabis sativa)[D].Edmonton:Inno Tech Alberta,2010.
[51] Petit J,Salentijn E M J,Paulo M J,et al.Genetic architecture of flowering time and sex determination in hemp (Cannabis sativa L.):a genome-wide association study[J].Front Plant Science,2020,11:569958.
[52] 崔丹丹，楊瑞芳，佘瑋，等.工業(yè)大麻性別鑒定研究進展[J].中國麻業(yè)科學，2018,40(5):244-248.
[53] Prentout D,Razumova O,Rhoné B,et al.An efficient RNA-seq-based segregation analysis identifies the sex chromosomes of Cannabis sativa[J].Genome research,2020,30(2):164-172.
[54] ZHONG R,LEE C,ZHOU J,et al.A battery of transcription factors involved in the regulation of secondary cell wall biosynthesis in Arabidopsis[J].The Plant Cell,2008,20(10):2763-2782.
[55] HAN L B,LI Y B,WANG H Y,et al.The dual functions of WLIM1a in cell elongation and secondary wall formation in developing cotton fibers[J].The Plant Cell,2013,25(11):4421-4438.
[56] ZHANG L W,XU Y,ZHANG X T,et al.The genome of kenaf (Hibiscus cannabinus L.) provides insights into bast fibre and leaf shape biogenesis[J].Plant Biotechnology Journal,2020,18:1796-1809.
[57] 劉昱翔，陳建榮，彭彥，等.苧麻纖維素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列的克隆與表達分析[J].作物研究，2014,28:472-478.
[58] Chakraborty A,Sarkar D,Satya P,et al.Pathways associated with lignin biosynthesis in lignomaniac jute fibres[J].Molecular Genetics and Genomics,2015,290:1523-1542.
[59] 趙越，張曉艷，曹焜，等.工業(yè)大麻抗逆生理及分子機制研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2022,38(6):102-106.
[60] 蘇文君.不同大麻品種萌發(fā)期和幼苗期耐鹽性的比較研究[D].昆明：云南大學，2013.
[61] 楊陽，蘇文君，杜光輝，等.大麻萌發(fā)期和苗期耐鹽性評價及耐鹽指標篩選[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學),2016,31(3):392-397.
[62] 劉家佳.工業(yè)大麻鹽脅迫轉錄組學研究[D].昆明：云南大學，2016.
[63] 胡華冉.工業(yè)大麻耐鹽候選基因GDH2和NACs的克隆及功能分析[D].昆明：云南大學，2019.
[64] CAO K,SUN Y F,HAN C W,et al.The transcriptome of saline-alkaline resistant industrial hemp (Cannabis sativa L.) exposed to NaHCO3 stress[J].Industrial Crops and Products,2021,170 (2):113766.
[65] 程霞.工業(yè)大麻響應鹽脅迫的蛋白應激機制研究[D].昆明：云南大學，2016.
[66] 郭媛，王玉富，邱財生，等.干旱脅迫對不同大麻品種生理特性和生長的影響研究初報[J].中國麻業(yè)科學，2011,33(5):235-239.
[67] 姜穎.烯效唑緩解工業(yè)大麻苗期干旱損傷效應與機制[D].大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學，2021.
[68] 杜光輝，周波，楊陽，等.PEG 模擬干旱脅迫下不同大麻品種萌發(fā)期抗旱性評價[J].中國農(nóng)學通報，2015,31(33):147-153.
[69] 杜光輝，周波，李熠，等.云南大麻品種抗旱性研究初報[J].中國麻業(yè)科學，2014,36(6):289-298.
[70] 楊志晶，李光菊，李璇，等.不同外源物質噴施對干旱脅迫下‘云麻1號’苗期生理的影響[J].云南大學學報(自然科學版),2020,42(2):374-381.
[71] GAO C,CHENG C,ZHAO L,et al.Genome-wide expression profiles of hemp (Cannabis sativa L.) in response to drought stress[J].International Journal of Genomics,2018,2018(5):1-13.
[72] 吳耀坤，田中艷，李澤宇，等.土壤重金屬對工業(yè)大麻影響研究進展[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學，2018,38(3):6.
[73] 李增強，丁鑫超，盧海，等.鉛脅迫下紅麻生理特性及DNA 甲基化分析[J].作物學報，2021,47:1031-1042.
[74] HUANG Y M,LI D F,ZHAO L N,et al.Comparative transcriptome combined with physiological analyses revealed key factors for differential cadmium tolerance in two contrasting hemp (Cannabis sativa L.) cultivars[J].Industrial crops and products,2019,140(15):111638.
[75] 黃玉敏.不同工業(yè)大麻品種耐鎘性及原花青素緩解鎘脅迫功能分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2019.
[76] 尹明.原花青素緩解工業(yè)大麻鎘脅迫機理分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2021.
[77] 蘇芳芳，楊光，鄭玉光.工業(yè)大麻種植及育種現(xiàn)狀研究[J].中國中藥雜志，2022,47(5):1190-1195.
[78] WANG F,LONG J,LI L,et al.Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer[J].Science Advances,2023,9(24):eadf5464.
文章摘自：李紫薇,李洪超,王曉楠等. 工業(yè)大麻轉錄組學研究進展 [J]. 中國麻業(yè)科學, 2023, 45 (06): 295-303.
