摘 要：本發(fā)明提供了一種利用油菜生物合成大麻二酚(cannabidiol，CBD)的方法及應用，屬于植物育種技術(shù)和生物合成技術(shù)領(lǐng)域；在本發(fā)明中，首先將4個基因TKS、OAC、PT4和CBDAS按照油菜對遺傳密碼子優(yōu)化，并將這些基因克隆到pCAMBIA1300?35S?NOS過表達載體中，然后遺傳轉(zhuǎn)化油菜，對獲得的陽性植株進行雜交從而獲得4個基因共過表達的油菜植株，并用于生物合成CBD。本發(fā)明成功利用油菜生物合成具有生物活性的CBD，而且不產(chǎn)生四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)，安全性極高，本發(fā)明的方法具有生產(chǎn)成本較低，可實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點。
權(quán)利要求書
1.一組用于油菜生物合成大麻二酚CBD的序列元件，所述序列元件包括基因TKS、OAC、PT4、CBDAS；其中所述TKS的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示；
所述OAC的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示；
所述PT4的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示；
所述CBDAS的核苷酸序列如SEQIDNo:4所示。
2.一種合成大麻二酚CBD的過表達載體，所述過表達載體包含權(quán)利要求1所述序列元件中的基因TKS、OAC、PT4和/或CBDAS。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的過表達載體，所述載體包括pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS或pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS。
4.包含權(quán)利要求2或3所述過表達載體的重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，所述重組菌的宿主菌包括農(nóng)桿菌GV3101。
6.權(quán)利要求1所述序列元件、權(quán)利要求2或3所述過表達載體、權(quán)利要求4或5所述重組菌的應用，所述應用包括生物合成CBD中的應用、和/或在生物合成CBD的甘藍型油菜育種中的應用。
7.一種利用油菜生物合成CBD的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)構(gòu)建過表達載體Ⅰ和過表達載體Ⅱ；
(2)將過表達載體Ⅰ和過表達載體Ⅱ分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，得到分別含有過表達載體Ⅰ和過表達載體Ⅱ的農(nóng)桿菌；
(3)農(nóng)桿菌菌液分別介導油菜下胚軸轉(zhuǎn)化，得到分別含有過表達載體Ⅰ和過表達載體Ⅱ的轉(zhuǎn)基因植株；
(4)將含有過表達載體Ⅰ的轉(zhuǎn)基因植株和過表達載體Ⅱ的轉(zhuǎn)基因植株進行雜交，獲得多個基因共過表達的植株，即表達CBD的植株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述過表達載體Ⅰ為pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS，所述過表達載體Ⅱ為pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述過表達載體Ⅰ和Ⅱ的構(gòu)建方法包括：
構(gòu)建過表達載體pCAMBIA1300?35S?TKS?NOS、pCAMBIA1300?35S?OAC?NOS、pCAMBIA1300?35S?PT4?NOS和pCAMBIA1300?35S?CBDAS?NOS；
擴增載體pCAMBIA1300?35S?OAC?NOS和pCAMBIA1300?35S?PT4?NOS中的35S?OAC?NOS和35S?PT4?NOS序列片段；
將35S?OAC?NOS和35S?PT4?NOS序列片段分別連接到pCAMBIA1300?35S?TKS?NOS和pCAMBIA1300?35S?CBDAS?NOS載體上，得到過表達載體Ⅰ：pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS和過表達載體Ⅱ：pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌GV3101。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物育種技術(shù)和生物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用油菜生物合成大麻二酚(cannabidiol，CBD)的方法及應用。
背景技術(shù)
大麻的標志性成分大麻素及其類似物因其潛在的醫(yī)療用途而被廣泛研究，其中，非精神活性成分大麻二酚(cannabidiol，CBD)是大麻素的主要成分，CBD在抗腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)保護(抗抑郁、抗焦慮等)、免疫調(diào)節(jié)和抗炎抗氧化等方面具有藥用價值，并對心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)具有保護作用，且CBD不具有精神活性，因此被廣泛地運用在保健、護膚、醫(yī)療、食品等多個領(lǐng)域。
雖然大麻應用廣泛，但其主活性成分大麻素類化學成分復雜，分析方法多樣，給研究者造成了一定的不便；而且，大麻中含有精神致幻成分四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)，依其含量的高低決定大麻品種種類的劃分，根據(jù)THC的含量將大麻分為醫(yī)用大麻(THC＞0.3％)、工業(yè)大麻(THC＜0.3％，CBD低含量)兩類；其中，THC具有精神活性，會使人產(chǎn)生幻覺和依賴性，對公共衛(wèi)生安全造成威脅，在我國嚴禁種植和使用醫(yī)用大麻。目前CBD可以通過提取或化學合成來獲得，通過化學合成的方法，會使得CBD的化學結(jié)構(gòu)受到一定影響，應用較少；另外是從工業(yè)大麻中直接提取，而工業(yè)大麻種植范圍有限。因此，如果能通過生物合成CBD，尤其是利用植物的光合作用合成，而無需高耗能、高耗氧等復雜過程，是最可行也是本領(lǐng)域期待的優(yōu)勢方法。
油菜(BrassicanapusL.)是我國種植最廣泛的油料作物之一，是我國重要的經(jīng)濟作物之一，油菜的生物育種和種子工程技術(shù)發(fā)展迅速，對農(nóng)業(yè)生物種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新利用是當前發(fā)展之重，若能利用油菜生物合成CBD，將極大擴展油菜在生物種質(zhì)資源方面的應用。
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的一些缺點與不足，本發(fā)明提供一種利用油菜生物合成大麻二酚(CBD)的方法及應用。并且在本發(fā)明中，利用在甘藍油菜中共過表達4個基因，獲得了一種生物合成大麻二酚CBD的轉(zhuǎn)基因植株。
為達到上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
本發(fā)明中，首先提供了一組用于油菜生物合成大麻二酚CBD的序列元件，所述序列元件包括基因TKS、OAC、PT4、CBDAS；其中
TKS的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示，氨基酸序列如SEQIDNo:5所示；
OAC的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示，氨基酸序列如SEQIDNo:6所示；
PT4的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示，氨基酸序列如SEQIDNo:7所示；
CBDAS的核苷酸序列如SEQIDNo:4所示，氨基酸序列如SEQIDNo:8所示。
本發(fā)明還提供一種合成大麻二酚CBD的過表達載體，所述過表達載體包含所述合成CBD的序列元件，所述過表達載體包括pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS或pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS。
本發(fā)明還提供包含所述過表達載體的重組菌，所述重組菌的宿主菌包括農(nóng)桿菌GV3101。
本發(fā)明還提供所述序列元件、所述過表達載體、所述重組菌的應用，所述應用包括：生物合成CBD中的應用；和/或在生物合成CBD的甘藍型油菜育種中的應用。
本發(fā)明中，還提供了一種利用油菜生物合成CBD的方法，所述方法包括：
(1)構(gòu)建過表達載體Ⅰ(pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS)和過表達載體Ⅱ(pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS)；
(2)將過表達載體Ⅰ和過表達載體Ⅱ轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，得到分別含有過表達載體Ⅰ和過表達載體Ⅱ的農(nóng)桿菌；
(3)農(nóng)桿菌菌液分別介導油菜下胚軸轉(zhuǎn)化，得到分別含有過表達載體Ⅰ和過表達載體Ⅱ的轉(zhuǎn)基因植株；
(4)將含有過表達載體Ⅰ和過表達載體Ⅱ的轉(zhuǎn)基因植株進行雜交，獲得4個基因共過表達的植株，即表達CBD的植株。
進一步的，所述過表達載體Ⅰ為pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS，過表達載體Ⅱ為pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS。
進一步的，所述過表達載體Ⅰ和Ⅱ的構(gòu)建方法包括：
構(gòu)建過表達載體pCAMBIA1300?35S?TKS?NOS、pCAMBIA1300?35S?OAC?NOS、pCAMBIA1300?35S?PT4?NOS和pCAMBIA1300?35S?CBDAS?NOS；
擴增pCAMBIA1300?35S?OAC?NOS和pCAMBIA1300?35S?PT4?NOS中的35S?OAC?NOS和35S?PT4?NOS序列片段；
將35S?OAC?NOS和35S?PT4?NOS序列片段分別連接到pCAMBIA1300?35S?TKS?NOS和pCAMBIA1300?35S?CBDAS?NOS載體上，得到過表達載體Ⅰ：pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS和過表達載體Ⅱ：pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS。
進一步的，所述農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌GV3101。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
油菜作為生物合成CBD的材料具有其他植株所沒有的優(yōu)勢：油菜是一種越冬作物，可以充分利用冬閑田作為生產(chǎn)基地；油菜適應性強，可以在中國從南到北都可以生長；油菜生物量大，每畝可達4?5噸；油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟。
本發(fā)明利用油菜生物合成CBD的方法，避免了CBD在酵母中合成的生產(chǎn)成本高、效率不高等缺點。
本發(fā)明利用油菜來進行CBD的合成，實現(xiàn)了CBD的特異性表達，且合成生物量大、可利用冬閑田等優(yōu)勢；另外得到的可生物合成的轉(zhuǎn)基因植株油菜葉片中的CBD含量高。
本發(fā)明成功利用油菜生物合成CBD，極大的擴展了油菜在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應用。有助于推動醫(yī)療健康領(lǐng)域的發(fā)展。
圖1為過表達載體Ⅰ和過表達載體Ⅱ的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖1
圖2為遺傳轉(zhuǎn)化獲得的14株過表達植株中提取葉片基因組PCR鑒定膠圖；圖中2?8為過表達載體Ⅰ轉(zhuǎn)化植株；10?16為過表達載體Ⅱ轉(zhuǎn)化植株。
圖2
圖3為過表達載體Ⅰ和過表達載體Ⅱ轉(zhuǎn)化植株雜交后代植株中提取葉片基因組PCR鑒定膠圖；WT：中雙11；1?8為雜交后代植株。
圖3
圖4為不同油菜株系的葉片中CBD的HPLC?UV圖。
圖4
具體實施方式
下面結(jié)合附圖以及具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法均是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時表明，其后所用相同試劑無特殊說明，均以首次表明的內(nèi)容相同；所涉及到的是試劑、材料等如無特殊說明，均為商業(yè)途徑獲得。
本發(fā)明中所采用的培養(yǎng)基及其配方如下所示：
LB(Luria?Bertani)液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g溶于80mL雙蒸水中，定容至1L，然后分裝至10個錐形瓶用封口膜封口，121℃高溫高壓滅菌15min，冷卻后放入4℃冰箱保存。
LB固體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂粉15g溶于800mL雙蒸水中，然后定容至1L，然后分裝至10個錐形瓶用封口膜封口，121℃高溫高壓滅菌15min，冷卻后放入4℃冰箱保存。使用時放入微波爐中加熱至融化，待液體冷卻到50℃左右加入抗生素，搖勻后立刻倒至無菌平皿中，每皿約10mL。
M0培養(yǎng)基：MS(Murashige Skoog Medium)粉4.4g/L，蔗糖30g/L，雙蒸水定容，調(diào)節(jié)pH值為5.84?5.88，凝固劑Agar10g/L，滅菌后分裝。
DM(Dilutionmedium)培養(yǎng)基：MS粉4.4g/L，蔗糖30g/L，雙蒸水定容，調(diào)節(jié)pH值為5.84?5.88，滅菌，等培養(yǎng)基冷卻后加入AS，1L中加入1mLAS(母液100μmol/mL)，放于4℃冰箱待用，也可以在用時再加入AS(乙酰丁香酮)。
M1培養(yǎng)基：MS粉4.4g/L，蔗糖30g/L，甘露醇18g/L，2,4?D(二氯苯氧乙酸)1mg/L，KT(激動素)0.3mg/L，雙蒸水定容，調(diào)節(jié)pH值為5.84?5.88，凝固劑Agar10g/L，滅菌后等培養(yǎng)基冷卻后加入AS，1L中加入1mLAS(母液100μmol/mL)，放于4℃冰箱待用，也可以在用時再加AS。
M2培養(yǎng)基：MS粉4.4g/L，蔗糖30g/L，甘露醇18g/L，2,4?D1mg/L，KT0.3mg/L，雙蒸水定容，調(diào)節(jié)pH值為5.84?5.88，凝固劑Agar10g/L，滅菌后等培養(yǎng)基冷卻后加入：TMT(特美汀)300mg/L，STS(M3培養(yǎng)基：MS粉4.4g/L，葡萄糖10g/L，木糖0.25g/L，MES(嗎啉乙磺酸)0.6g/L，雙蒸水定容，調(diào)節(jié)pH值為5.84?5.88，凝固劑Agar10g/L，滅菌后等培養(yǎng)基冷卻后加入：ZT(反式玉米素)2mg/L，IAA(吲哚乙酸)0.1mg/L，TMT300mg/L，STS150μmol/L，卡那霉素25mg/L，然后分裝到無菌平皿中。
M4培養(yǎng)基：MS粉4.4g/L，蔗糖10g/L，雙蒸水定容，調(diào)節(jié)pH值為5.84?5.88，凝固劑Agar8g/L，滅菌后等培養(yǎng)基冷卻后加入：TMT300mg/L，然后分裝。
實施例1：TKS、OAC、PT4和CBDAS基因獲得及載體構(gòu)建
根據(jù)大麻基因組網(wǎng)站(http://genome.ccbr.utoronto.ca/cgi?bin/hgGateway)獲得大麻TKS(SequenceID:AB164375.1)、OAC(SequenceID:JN679224.1)、PT4(SequenceID:BK010648.1)和CBDAS(SequenceID:KP970866.1)基因的cDNA序列。然后，這些序列使用在線密碼子優(yōu)化工具(https://www.novopro.cn/tools/codon?optimization.html)進行優(yōu)化，獲得TKS、OAC、PT4和CBDAS優(yōu)化后cDNA，優(yōu)化后的核苷酸序列分別如SEQIDNo:1、SEQIDNo:2、SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示，氨基酸序列如SEQIDNo:5、SEQIDNo:6、SEQIDNo:7和SEQIDNo:8所示。
35S序列如SEQIDNo:9所示，NOS序列如SEQIDNo:10所示。
4個序列由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成，并分別構(gòu)建到pCAMBIA1300?35S?NOS載體(常規(guī)購買)上，將得到的表達載體命名為pCAMBIA1300?35S?TKS?NOS、pCAMBIA1300?35S?OAC?NOS、pCAMBIA1300?35S?PT4?NOS和pCAMBIA1300?35S?CBDAS?NOS。
根據(jù)pCAMBIA1300?35S?NOS載體序列，設計同源重組引物，引物序列為：
FMF(SEQIDNo:11)：
TTTGTTGAAAAGTCTCAATTGTCTCAGAAGACCAAAGGGCA
FMR(SEQIDNo:12)：
CAGAAGACCAAAGGGCAATTGTCCCAGTCACGACGTTGTAA
根據(jù)pCAMBIA1300?35S?OAC?NOS和pCAMBIA1300?35S?PT4?NOS的合成序列分別為模板，使用高保真酶2*PhantaMAXMasterMix(購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司)擴增35S?OAC?NOS和35S?PT4?NOS序列片段，PCR反應體系如表1所示。
表1 高保真酶PCR擴增反應體系
PCR反應程序為：95℃預變性3min；95℃變性15s、52℃退火15s、72℃延伸30s，共進行35個循環(huán)；72℃終延伸5min。
PCR反應結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠(質(zhì)量體積分數(shù))中120V進行凝膠電泳30min，然后在紫外凝膠成像儀下照相，記錄結(jié)果。
結(jié)果顯示，引物FMF和FMR成功擴增出目的片段，即35S?OAC?NOS和35S?PT4?NOS序列片段，片段的大小分別為1015bp和1906bp。
參照UNIQ?10柱式DNA膠回收試劑盒(購自生工生物工程(上海)股份有限公司)中說明書操作說明，從瓊脂糖凝膠中回收PCR擴增產(chǎn)物35S?OAC?NOS和35S?PT4?NOS序列片段，然后將回收的PCR擴增產(chǎn)物35S?OAC?NOS和35S?PT4?NOS序列片段分別連接到pCAMBIA1300?35S?TKS?NOS和pCAMBIA1300?35S?CBDAS?NOS載體上，連接體系為：4.5μL膠回收產(chǎn)物、0.5μLpCAMBIA1300?35S?TKS?NOS載體/pCAMBIA1300?35S?CBDAS?NOS載體、5μLSolutionⅠ(購自寶生物工程(大連)有限公司)，在16℃下連接過夜，得到連接產(chǎn)物。
向30μL大腸桿菌感受態(tài)細胞(購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司)中加入10μL的連接產(chǎn)物，通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ɑ中，然后利用含終濃度為30mg/mL的Kan的LB培養(yǎng)基篩選陽性菌落，并挑取10個單菌落震蕩培養(yǎng)12?16h，取2μL菌液作為模板PCR擴增進行鑒定，PCR反應的引物為：
FMJF(SEQIDNo:13):ACGCACAATCCCACTATCCTTC
FMJR(SEQIDNo:14):ATTGCCAAATGTTTGAACGATC
PCR擴增反應體系如表2所示，PCR反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s、50℃退火30s、72℃延伸1min，共進行28個循環(huán)；72℃終延伸10min。
表2 菌液PCR擴增反應體系
將PCR擴增的結(jié)果在1％的瓊脂糖凝膠上進行檢測，檢測發(fā)現(xiàn)得到的DNA片段為445bp和1336bp，證明轉(zhuǎn)化成功，各選3份轉(zhuǎn)化成功的菌液分別吸取100μL送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序正確的表明載體構(gòu)建成功。
結(jié)果表明，該實施例成功構(gòu)建2個過表達載體：
過表達載體Ⅰ：pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS和過表達載體Ⅱ：pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS，兩個過表達載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。
提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，得到2種轉(zhuǎn)化株(包含過表達載體Ⅰ的農(nóng)桿菌和包含過表達載體Ⅱ的農(nóng)桿菌)，挑取陽性單克隆，用于遺傳轉(zhuǎn)化。
所涉及序列信息如下：
SEQ ID No:1：
ATGAACCATCTACGTGCCGAAGGCCCAGCTAGCGTTCTAGCTATCGGTACTGCAAACCCTGAGAACATCCTCCTCCAGGACGAGTTTCCAGATTACTACTTCCGTGTTACTAAGTCGGAGCATATGACCCAACTTAAAGAAAAATTCAGGAAGATTTGCGACAAATCCATGATCAGAAAGCGTAACTGTTTTCTGAATGAGGAACATCTGAAGCAGAACCCAAGACTTGTTGAACATGAAATGCAGACTTTGGACGCCAGACAAGACATGCTCGTCGTTGAAGTGCCCAAATTGGGAAAAGATGCATGCGCTAAAGCAATCAAAGAATGGGGACAACCGAAATCAAAGATTACACATCTCATCTTCACATCGGCATCTACCACGGACATGCCAGGTGCTGACTACCACTGTGCCAAGTTGCTTGGACTGTCCCCCTCTGTGAAGCGTGTGATGATGTATCAGCTTGGTTGCTACGGTGGAGGAACCGTTCTGAGGATTGCAAAGGATATCGCCGAGAACAACAAAGGCGCGAGAGTTTTGGCTGTGTGTTGCGACATTATGGCATGTTTGTTTCGTGGCCCTTCCGAGAGTGATTTGGAACTCCTCGTTGGACAAGCTATTTTCGGTGACGGCGCCGCTGCTGTCATTGTCGGGGCTGAGCCAGATGAATCTGTGGGTGAAAGGCCCATCTTCGAGTTGGTCTCCACCGGGCAGACAATCTTGCCAAATTCCGAGGGTACAATCGGTGGACACATTAGAGAGGCTGGACTCATTTTCGATCTGCACAAAGATGTTCCGATGTTGATCAGCAATAACATAGAGAAGTGTTTGATCGAGGCTTTCACTCCCATCGGTATCAGTGATTGGAATTCTATCTTCTGGATAACGCATCCAGGAGGTAAGGCCATTCTTGATAAAGTTGAAGAAAAACTGCATTTGAAGAGCGACAAGTTCGTTGACTCCAGACATGTTTTGTCTGAGCACGGTAACATGTCTTCCAGTACTGTTCTCTTTGTTATGGATGAGCTAAGGAAGAGAAGTTTGGAAGAAGGTAAGAGCACCACCGGAGATGGATTCGAGTGGGGAGTGCTCTTCGGATTTGGCCCAGGACTAACTGTGGAGAGGGTGGTTGTTAGGTCAGTCCCGATTAAGTACTAA
SEQIDNo:2:
ATGGCTGTCAAACATCTGATAGTCCTTAAGTTCAAGGATGAAATTACAGAAGCTCAGAAGGAAGAATTTTTTAAAACGTACGTAAACTTGGTTAACATTATACCTGCTATGAAGGATGTGTACTGGGGTAAGGATGTGACCCAGAAGAATAAGGAGGAAGGATACACCCACATAGTTGAGGTGACATTCGAAAGCGTGGAAACTATACAGGATTACATCATCCATCCTGCCCACGTGGGATTTGGAGATGTTTACCGTAGTTTCTGGGAAAAACTGCTCATTTTTGATTACACCCCCAGGAAATAG
SEQIDNo:3:
ATGGGACTCAGCCTCGTCTGTACATTTAGCTTTCAGACCAACTACCACACACTTCTTAACCCGCACAACAAGAACCCAAAAAACTCACTCCTTTCGTACCAACACCCTAAGACGCCTATTATAAAGTCTTCGTACGATAATTTTCCCTCTAAATATTGTCTGACGAAGAACTTCCATTTGCTTGGTCTCAACAGCCATAACAGAATTTCGTCGCAGTCTCGTTCAATCAGGGCAGGGAGCGATCAAATCGAGGGATCACCACATCATGAGAGCGATAATTCTATAGCCACGAAAATCTTGAACTTTGGTCATACCTGTTGGAAGTTGCAACGTCCCTATGTTGTGAAGGGAATGATCTCGATAGCATGTGGACTTTTTGGTAGGGAACTTTTTAACAACAGGCACCTCTTCAGTTGGGGGCTTATGTGGAAAGCCTTTTTCGCTTTGGTGCCTATCCTTTCTTTCAACTTTTTTGCAGCTATTATGAACCAGATCTATGATGTGGACATCGATAGGATTAACAAGCCTGATCTGCCACTCGTGTCAGGTGAGATGTCTATTGAGACAGCGTGGATTTTGAGCATAATTGTGGCGCTCACTGGATTGATTGTAACGATTAAGCTCAAGTCAGCACCATTGTTCGTTTTTATTTACATATTCGGTATTTTCGCTGGTTTCGCTTACTCCGTGCCTCCAATCCGTTGGAAACAGTATCCATTCACTAACTTCCTGATCACGATTTCTAGCCATGTGGGACTCGCATTCACGAGCTATTCCGCAACAACTTCAGCTCTAGGACTCCCTTTCGTTTGGAGGCCTGCTTTTAGTTTTATCATCGCTTTCATGACCGTTATGGGAATGACAATCGCTTTTGCAAAGGACATCTCCGATATCGAGGGAGATGCTAAGTATGGTGTGAGTACTGTTGCTACAAAACTCGGGGCCAGGAACATGACTTTCGTGGTGTCTGGTGTGCTTCTCTTGAACTACCTTGTCTCAATCTCTATAGGAATCATTTGGCCTCAAGTTTTCAAAAGCAACATAATGATCCTCTCACATGCAATACTAGCTTTCTGCCTCATTTTCCAAACAAGGGAGTTGGCTTTGGCGAATTATGCAAGTGCTCCTAGCAGACAATTCTTCGAGTTTATTTGGCTCCTCTATTATGCGGAGTACTTTGTTTATGTCTTCATATAA
SEQIDNo:4:
ATGAAGTGCAGCACATTTTCTTTCTGGTTCGTCTGTAAAATTATTTTTTTTTTCTTCTCGTTCAATATCCAGACTAGTATTGCCAACCCGAGAGAGAATTTTCTGAAATGTTTCAGTCAATACATCCCTAACAATGCAACTAATTTGAAGCTCGTTTATACTCAAAACAATCCGCTCTACATGTCCGTGCTTAATAGCACTATTCATAACCTTAGGTTTACCTCCGATACTACCCCGAAACCGCTCGTCATTGTCACACCTAGCCACGTGTCTCACATTCAGGGGACCATCCTTTGTAGTAAGAAAGTTGGACTTCAAATAAGGACTAGAAGCGGGGGACACGATTCTGAGGGCATGTCATATATTTCACAGGTCCCGTTTGTCATAGTGGATTTGAGAAACATGAGGAGCATCAAGATTGATGTGCATAGCCAGACCGCTTGGGTTGAAGCTGGTGCTACTCTCGGGGAGGTGTATTATTGGGTTAATGAAAAGAACGAGAACCTTTCACTCGCCGCAGGATATTGTCCGACTGTCTGTGCAGGTGGGCACTTCGGAGGAGGTGGTTATGGTCCCTTGATGAGAAATTACGGACTCGCTGCGGACAA
SEQ.ID.No:5:
MNHLRAEGPASVLAIGTANPENILLQDEFPDYYFRVTKSEHMTQLKEKFRKICDKSMIRKRNCFLNEEHLKQNPRLVEHEMQTLDARQDMLVVEVPKLGKDACAKAIKEWGQPKSKITHLIFTSASTTDMPGADYHCAKLLGLSPSVKRVMMYQLGCYGGGTVLRIAKDIAENNKGARVLAVCCDIMACLFRGPSESDLELLVGQAIFGDGAAAVIVGAEPDESVGERPIFELVSTGQTILPNSEGTIGGHIREAGLIFDLHKDVPMLISNNIEKCLIEAFTPIGISDWNSIFWITHPGGKAILDKVEEKLHLKSDKFVDSRHVLSEHGNMSSSTVLFVMDELRKRSLEEGKSTTGDGFEWGVLFGFGPGLTVERVVVRSVPIKY
SEQ.ID.No:6:
MAVKHLIVLKFKDEITEAQKEEFFKTYVNLVNIIPAMKDVYWGKDVTQKNKEEGYTHIVEVTFESVETIQDYIIHPAHVGFGDVYRSFWEKLLIFDYTPRK
SEQ.ID.No:7:
MGLSLVCTFSFQTNYHTLLNPHNKNPKNSLLSYQHPKTPIIKSSYDNFPSKYCLTKNFHLLGLNSHNRISSQSRSIRAGSDQIEGSPHHESDNSIATKILNFGHTCWKLQRPYVVKGMISIACGLFGRELFNNRHLFSWGLMWKAFFALVPILSFNFFAAIMNQIYDVDIDRINKPDLPLVSGEMSIETAWILSIIVALTGLIVTIKLKSAPLFVFIYIFGIFAGFAYSVPPIRWKQYPFTNFLITISSHVGLAFTSYSATTSALGLPFVWRPAFSFIIAFMTVMGMTIAFAKDISDIEGDAKYGVSTVATKLGARNMTFVVSGVLLLNYLVSISIGIIWPQVFKSNIMILSHAILAFCLIFQTRELALANYASAPSRQFFEFIWLLYYAEYFVYVFI
SEQIDNo:8:
MKCSTFSFWFVCKIIFFFFSFNIQTSIANPRENFLKCFSQYIPNNATNLKLVYTQNNPLYMSVLNSTIHNLRFTSDTTPKPLVIVTPSHVSHIQGTILCSKKVGLQIRTRSGGHDSEGMSYISQVPFVIVDLRNMRSIKIDVHSQTAWVEAGATLGEVYYWVNEKNENLSLAAGYCPTVCAGGHFGGGGYGPLMRNYGLAADNIIDAHLVNVHGKVLDRKSMGEDLFWALRGGGAESFGIIVAWKIRLVAVPKSTMFSVKKIMEIHELVKLVNKWQNIAYKYDKDLLLMTHFITRNITDNQGKNKTAIHTYFSSVFLGGVDSLVDLMNKSFPELGIKKTDCRQLSWIDTIIFYSGVVNYDTDNFNKEILLDRSAGQNGAFKIKLDYVKKPIPESVFVQILEKLYEEDIGAGMYALYPYGGIMDEISESAIPFPHRAGILYELWYICSWEKQEDNEKHLNWIRNIYNFMTPYVSKNPRLAYLNYRDLDIGINDPKNPNNYTQARIWGEKYFGKNFDRLVKVKTLVDPNNFFRNEQSIPPLPRHRH
SEQIDNo:9:
TGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTTCATTTGGAGAGAACA
SEQIDNo:10：
GATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATC
實施例2：重組載體轉(zhuǎn)化甘藍型油菜(Brassicanapus)
(1)播種：
選取甘藍型油菜ZS11種子(本申請人實驗室保存，為公知公用材料)，放在10mL離心管中，加入體積分數(shù)為75％的酒精，上下翻轉(zhuǎn)，浸泡1min，用移液器吸取酒精，加入適量無菌水沖洗3?5遍；再加入15％bleach溶液(配制為8.115mL無菌水+1.875mL次氯酸鈉+10μL曲拉通)，將離心管上下翻轉(zhuǎn)，浸泡種子6min，污染較重的種子酒精消毒和滅菌的時間可以適當延長，但時間過長會影響種子發(fā)芽。隨后吸掉消毒液，加入適量無菌水沖洗3?5遍，每次均上下翻轉(zhuǎn)，保持離心管內(nèi)為無菌環(huán)境。最后吸掉無菌水，用燒好的無菌鑷子將滅菌種子播到M0培養(yǎng)基上，每瓶25粒左右，置于暗光24℃下培養(yǎng)6天，即可獲得所需長度的油菜下胚軸。
(2)菌液準備：
播種5?7天后用LB液體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)實施例1中得到的分別含有pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS、pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，具體培養(yǎng)方式如下：在5mL抗性LB液體培養(yǎng)基(加入50mg/L卡那霉素Kan+50mg/L慶大霉素Gen+50mg/L利福平Rif)中分別加入20μL含有pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS、pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，于28℃、180?220rpm搖床中培養(yǎng)約14?16h。
(3)侵染及共培養(yǎng)：
準備好共培養(yǎng)培養(yǎng)基M1和DM培養(yǎng)基，M1培養(yǎng)基經(jīng)過121℃15min滅菌后快冷卻時(約50℃)加入乙酰丁香酮AS(終濃度100μM)，DM培養(yǎng)基也加入AS(終濃度100μM)，記為DM(AS+)，備用。
采用分光光度計測步驟(2)中所述的LB培養(yǎng)基中菌的OD值，選取OD值為0.4左右時的菌液較好，一般搖菌14?16小時即可。吸取2mL培養(yǎng)好的菌液到無菌離心管中，3000rpm3min離心，棄上清；然后加入2mLDM(AS+)培養(yǎng)基懸浮，3000rpm3min離心，棄上清；再加入2mL的DM(AS+)培養(yǎng)基懸浮，放4℃冰箱備用。
用無菌解剖剪刀剪取步驟(1)播種后生長出來的油菜下胚軸，切成0.8cm?1.0cm的小段，放在含有18mL的DM培養(yǎng)基液體的培養(yǎng)皿中，等下胚軸全部切成小段后，再倒入2mL上述用DM(AS+)培養(yǎng)基重懸后的菌液，這時皿里液體體積為20mL，浸染10?15min(時間不能長，不然外植體易死亡)，隔段時間搖晃1次，4～5次即可。當侵染8min時開始用移液器吸掉DM(AS+)培養(yǎng)基菌液，用無菌鑷子夾取外植體到無菌濾紙上放置片刻，吸走外植體上多余的菌液，然后將外植體再轉(zhuǎn)到M1固體培養(yǎng)基中，外植體暗光下24℃放置或放在光照培養(yǎng)室避光處。
(4)選擇培養(yǎng)及愈傷誘導：
將在M1培養(yǎng)基中培養(yǎng)36?48h的外植體轉(zhuǎn)入到M2培養(yǎng)基中，光下正常培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24℃條件下，采用白天16h、晚上8h的方式交替培養(yǎng)，2?3周誘導愈傷。
(5)再分化：
將步驟(4)中的外植體轉(zhuǎn)到M3培養(yǎng)基中，每2?3星期繼代一次，直至出現(xiàn)綠芽。
(6)生根培養(yǎng)
將有完整生長點的綠芽轉(zhuǎn)入M4培養(yǎng)基中長大生根，約需要20天。生根后，可以直接放置培養(yǎng)間進行煉苗，待苗狀態(tài)穩(wěn)定后，從培養(yǎng)基中取出，取苗過程中不要破壞植物的根系，然后將苗移到土壤中培養(yǎng)，培養(yǎng)時需要用保鮮膜保濕1?2周，即可獲得等待鑒定的轉(zhuǎn)基因油菜，本實施例中得到轉(zhuǎn)化pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS的轉(zhuǎn)基因油菜植株和轉(zhuǎn)化pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS的轉(zhuǎn)基因油菜植株。
實施例3：轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜的鑒定及4個基因共過表達的構(gòu)建
待實施例2中的轉(zhuǎn)基因油菜植株生長穩(wěn)定后，采取CTAB法提取轉(zhuǎn)基因油菜葉片中的DNA，具體步驟如下：
A.取少量葉片放入1.5mL離心管中，使用液氮進行研磨，研磨成干粉后，加入600μLCTAB，然后將樣品放入65℃水浴鍋中孵育60min。
B.等待孵育完成后，在管中加入600μL氯仿/異戊醇(體積比為24:1)溶液，劇烈震蕩，充分除去蛋白質(zhì)，然后放入離心機中12000g離心10min。
C.離心后輕輕取出離心管，此時溶液分為三層，依次是水相、葉片碎片雜質(zhì)層、有機相，吸取400?500μL上清水相，轉(zhuǎn)移到新的離心管中，然后向上清中加入400?500μL異丙醇，輕輕顛倒混勻，接著將樣品放入?20℃冰箱中冷卻至少10min，以使異丙醇更加有效沉淀DNA。
D.將離心管放入離心機中，室溫下12000g離心10min。
E.離心后棄上清，加入700μL預冷的體積分數(shù)為70％乙醇洗滌，彈起沉淀，輕輕顛倒洗滌，12000g瞬旋。
F.離心后棄上清，用移液器吸去乙醇溶液，然后在超凈臺風干沉淀，去除揮發(fā)性有機溶液。
G.向離心管中加入50?100μLddH2O溶解沉淀，放入37℃水浴鍋中30min，得到基因組樣品。
H.取1μL基因組樣品測定濃度，檢測合格后，將基因組樣品放入?20℃冰箱中備用。
將上述步驟中得到的基因組樣品為模板，過表達載體Ⅰ：pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS和過表達載體Ⅱ：pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS質(zhì)粒為正對照，進行PCR鑒定。PCR擴增反應程序以及條件與表2中的菌液PCR反應相同。
待PCR完成后，將擴增產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中進行電泳，使用紫外凝膠成像儀照相，記錄結(jié)果。圖2為經(jīng)過轉(zhuǎn)化得到的14株陽性株中提取葉片基因組的PCR鑒定膠圖；圖中，+1：正對照，pCAMBIA1300?NOS?OAC?35S?35S?TKS?NOS質(zhì)粒；2?8：過表達載體Ⅰ轉(zhuǎn)基因植株；+9：正對照，pCAMBIA1300?NOS?PT4?35S?35S?CBDAS?NOS質(zhì)粒；10?16：過表達載體Ⅱ轉(zhuǎn)基因植株；M：TakaraDL2000DNAMarker。從圖2中可以看出，本實施例中獲得了7株過表達載體Ⅰ轉(zhuǎn)基因植株和6株過表達載體Ⅱ轉(zhuǎn)基因植株，都是陽性植株。
圖2中可以證實實施例2中所構(gòu)建的基因過表達載體成功轉(zhuǎn)入到油菜中，確定通過植物組織培養(yǎng)的過程，獲得了鑒定成功的陽性株。
為了進一步獲得4個基因共過表達的植株。將轉(zhuǎn)基因鑒定正確的兩種過表達轉(zhuǎn)基因植株采取人工去雄的方法，進行雜交。取8株雜交F1代的葉片提取DNA并進行PCR檢測。PCR擴增反應程序以及條件與表2中的菌液PCR反應相同。圖3為雜交F1代植株中提取葉片基因組的PCR鑒定膠圖；圖中，WT：中雙11(ZS11)；1?8為雜交后代植株(F1代植株)。由于SEQIDNo:1所示的基因TKS的序列長度是1158bp，而SEQIDNo:3所示的基因PT4的序列長度是1197bp，兩者序列長度差異只有39bp，因而在1％的瓊脂糖膠是區(qū)分不開這兩個基因的，所以四個基因聚合的植株能通過1％的瓊脂糖膠顯示出3個條帶。從圖3中可見，本實施例得到3株四個基因聚合的植株，分別是記為M2，M5和M7。
實施例4：HPLC?UV測定CBD含量檢測
為了測定四個基因聚合的植株中的CBD含量，分別準確稱取0.1g磨碎后的葉片樣品(M2和M5)，平行6份，加入10mL95％甲醇，充分混勻后在4℃放置2小時，超聲提取30min，12000r/min離心5min取上清，過0.22μm的微孔濾膜，用95％甲醇稀釋200倍用于上樣。
HPLC?UV法：色譜柱C18柱(3.9mm×300mm，10μm，柱溫35℃)；流動相甲醇?0.1％甲酸水溶液(80：20)；檢測波長210nm；流速1mL/min；進樣量20μL。
從圖4中可以看出，CBD標樣在8.281分鐘達到峰值，M2植株提取樣在8.262分鐘達到峰值，而M5植株提取樣在8.223分鐘達到峰值，這兩株植株葉片中的CBD含量分別達到760.66μg/g和448.93μg/g，同時對野生型中雙11的葉片中DNA做了平行實驗，發(fā)現(xiàn)其峰高不明顯，CBD含量甚微。
這個結(jié)果表明本發(fā)明成功通過在油菜生物合成了CBD，并獲得了較高的表達量。
摘自國家發(fā)明專利，發(fā)明人：朱克明，趙文達，宋悅，譚小力，申請?zhí)枺?/font>202311501633.6，申請日：2023.11.13
