摘  要：本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及基于生長素調(diào)節(jié)因子組合的大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。本發(fā)明提供了包含ARF19pro啟動(dòng)子，CsWIND2和CsARR5的組合元件、表達(dá)載體、培養(yǎng)基以及其在提高大麻外植體的再生效率和/或建立大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系中的應(yīng)用。本發(fā)明通過優(yōu)化現(xiàn)有的大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系，顯著提高轉(zhuǎn)化效率，使難以轉(zhuǎn)化且具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大麻品種能進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化。

 

權(quán)利要求書

1.組合元件，其特征在于，包括：ARF19pro啟動(dòng)子，CsWIND2和CsARR5；

(I)、所述ARF19pro啟動(dòng)子具有如SEQIDNO.3所示核苷酸序列；和/或

所述具有如SEQIDNO.7所示核苷酸序列；和/或

所述CsARR5具有如SEQIDNO.8所示核苷酸序列；或(II)、在如(I)所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)取代、缺失、添加和/或替換1個(gè)或多個(gè)氨基酸的序列；或CsWIND2(III)、與如(I)或(II)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。

2.表達(dá)載體，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的組合元件。

3.宿主，其特征在于，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體。

4.培養(yǎng)基，其特征在于，包括TDZ、6-BA、NAA和IAA；

所述TDZ、6-BA、NAA和IAA的質(zhì)量比包括5:5:2:2。

5.如權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括R0培養(yǎng)基，以1L體系計(jì)，所述R0培養(yǎng)基包括：

  

6.培養(yǎng)基組合，其特征在于，包括CIM培養(yǎng)基，R1培養(yǎng)基和如權(quán)利要求4或5所述的培養(yǎng)基；

以1L體積計(jì)，所述CIM培養(yǎng)基包括：

  

和/或

以1L體積計(jì)，所述R1培養(yǎng)基包括：

  

  

7.如下任意項(xiàng)在提高大麻外植體的再生效率和/或建立大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系中的應(yīng)用：

(I)、如權(quán)利要求1所述的組合元件；和/或

(II)、如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體；和/或

(III)、如權(quán)利要求3所述的宿主；和/或

(IV)、如權(quán)利要求4或5所述的培養(yǎng)基；和/或

(V)、如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基組合。

8.提高大麻外植體的再生效率和/或建立大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，包括基于如下任意項(xiàng)獲得大麻植株：

(I)、如權(quán)利要求1所述的組合元件；和/或

(II)、如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體；和/或

(III)、如權(quán)利要求3所述的宿主。

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，包括愈傷組織的誘導(dǎo)、侵染和共培養(yǎng)、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、芽的誘導(dǎo)、芽的分化和生根；

(1)、所述愈傷組織的誘導(dǎo)包括：取大麻的外植體，暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)生成愈傷組織；

(2)、所述侵染和共培養(yǎng)包括：取所述愈傷組織于如權(quán)利要求3所述宿主的菌液中，進(jìn)行侵染，去除所述宿主的菌液，暗培養(yǎng)，獲得宿主侵染的愈傷組織；

(3)、所述胚性愈傷組織的誘導(dǎo)包括：取所述宿主侵染的愈傷組織，培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織；

(4)、所述芽的誘導(dǎo)、芽的分化和生根包括：取所述的胚性愈傷組織，切去根部，第一次繼代培養(yǎng)，第二次繼代培養(yǎng)，生根，獲得大麻植株。

10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，(3)所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括如權(quán)利要求4或5所述的培養(yǎng)基；或

所述大麻外植體包括大麻植株授粉后30天未成熟種子的胚芽；或

所述大麻包括DMG278和/或YUNMA7。

 

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及基于生長素調(diào)節(jié)因子組合的大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。

 

背景技術(shù)

大麻(Cannabis sativa L.)起源于中亞地區(qū)，作為經(jīng)濟(jì)作物在我國有近5000年的栽培和加工歷史。據(jù)考古發(fā)現(xiàn)，早在2700年前，我國西北地區(qū)已經(jīng)有使用大麻素入藥的證據(jù)。工業(yè)大麻是指四氫大麻酚THC小于0.3％的大麻品種，在我國可以合法種植。大麻花葉中的大麻二酚CBD不具有致幻成癮性，在抗抑郁、抗炎和緩解疼痛等方面具有重要的藥用價(jià)值，近年來在世界范圍內(nèi)興起了研究和利用的熱潮，其有效成分在醫(yī)療、保健、化妝品和食品領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力。根據(jù)GlobalMarketInsights報(bào)告，目前全球工業(yè)大麻的種植、加工和利用的分布總體呈現(xiàn)了歐盟、北美(加拿大和美國)、中國三大主產(chǎn)區(qū)的格局，工業(yè)大麻種植面積占全球80％以上。提高CBD含量是目前工業(yè)大麻研究領(lǐng)域的主要目標(biāo)，選育高CBD、低THC品種是育種家們急需解決的問題。

由于大麻雌雄異株，遺傳背景復(fù)雜，傳統(tǒng)育種方法進(jìn)展慢效果差。分子定向育種技術(shù)具有效率高、針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)良基因重組和聚合，實(shí)現(xiàn)新品種定向選育，是今后工業(yè)大麻育種的必然趨勢(shì)。然而工業(yè)大麻是一種再生和遺傳轉(zhuǎn)化頑拗型植物，至今未能建立成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系，且遺傳轉(zhuǎn)化體系的相關(guān)研究進(jìn)展緩慢。

現(xiàn)有技術(shù)是將大麻種子在無菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在種子萌發(fā)后將子葉切下進(jìn)行4天預(yù)培養(yǎng)，通過農(nóng)桿菌侵染完成瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。經(jīng)過1～2個(gè)月的無菌培養(yǎng)，子葉再生出的幼芽中能夠檢測(cè)到有相關(guān)基因表達(dá)，以大麻種子萌發(fā)后的子葉為侵染對(duì)象，大麻子葉脫分化后能夠再分化成幼芽的比例極低，且農(nóng)桿菌侵染過程本身會(huì)進(jìn)一步抑制外植體再分化。因此，現(xiàn)有技術(shù)獲得陽性植株的產(chǎn)率極低。

現(xiàn)有技術(shù)只能進(jìn)行大麻瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌侵染大麻子葉后，只有再生幼芽的部分器官中可以檢測(cè)到外源基因的瞬時(shí)表達(dá)，并未獲得可以穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。

 

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供基于生長素調(diào)節(jié)因子組合的大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。本發(fā)明通過優(yōu)化現(xiàn)有的大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系，顯著提高轉(zhuǎn)化效率，使難以轉(zhuǎn)化且具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大麻品種能進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了組合元件，包括：ARF19pro啟動(dòng)子，CsWIND2和CsARR5；

(I)、所述ARF19pro啟動(dòng)子具有如SEQIDNO.3所示核苷酸序列；和/或

所述CsWIND2具有如SEQIDNO.7所示核苷酸序列；和/或

所述CsARR5具有如SEQIDNO.8所示核苷酸序列；或

(II)、在如(I)所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)取代、缺失、添加和/或替換1個(gè)或多個(gè)氨基酸的序列；或

(III)、與如(I)或(II)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。

本發(fā)明還提供了表達(dá)載體，包括所述組合元件。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，包括pKSE401載體。

本發(fā)明還提供了宿主，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化所述表達(dá)載體。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述宿主包括農(nóng)桿菌菌株AGL1。

本發(fā)明還提供了培養(yǎng)基，包括TDZ、6-BA、NAA和IAA；

所述TDZ、6-BA、NAA和IAA的質(zhì)量比包括5:5:2:2。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包括R0培養(yǎng)基，以1L體系計(jì)，所述R0培養(yǎng)基包括：

  

本發(fā)明還提供了培養(yǎng)基組合，包括CIM培養(yǎng)基，R1培養(yǎng)基和所述的培養(yǎng)基；

以1L體積計(jì)，所述CIM培養(yǎng)基包括：

  

和/或

以1L體積計(jì)，所述R1培養(yǎng)基包括：

  

本發(fā)明還提供了如下任意項(xiàng)在提高大麻外植體的再生效率和/或建立大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系中的應(yīng)用：

(I)、如所述組合元件；和/或

(II)、如所述表達(dá)載體；和/或

(III)、如所述宿主；和/或

(IV)、如所述培養(yǎng)基；和/或

(V)、如所述培養(yǎng)基組合。

本發(fā)明還提供了提高大麻外植體的再生效率和/或建立大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，包括基于如下任意項(xiàng)獲得大麻植株：

(I)、如所述組合元件；和/或

(II)、如所述表達(dá)載體；和/或

(III)、如所述宿主。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法包括愈傷組織的誘導(dǎo)、侵染和共培養(yǎng)、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、芽的誘導(dǎo)、芽的分化和生根；

(1)、所述愈傷組織的誘導(dǎo)包括：取大麻的外植體，暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)生成愈傷組織；

(2)、所述侵染和共培養(yǎng)包括：取所述愈傷組織于所述宿主的菌液中，進(jìn)行侵染，去除所述宿主的菌液，暗培養(yǎng)，獲得宿主侵染的愈傷組織；

(3)、所述胚性愈傷組織的誘導(dǎo)包括：取所述宿主侵染的愈傷組織，培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織；

(4)、所述芽的誘導(dǎo)、芽的分化和生根包括：取所述的胚性愈傷組織，切去根部，第一次繼代培養(yǎng)，第二次繼代培養(yǎng)，生根，獲得大麻植株。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，(3)所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括所述培養(yǎng)基；或所述大麻外植體包括大麻植株授粉后30天未成熟種子的胚芽；或

所述大麻包括DMG278和/或YUNMA7。

本發(fā)明還提供了經(jīng)所述方法建立的大麻植株。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，(1)所述暗培養(yǎng)包括將所述大麻的外植體置于CIM培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)5天。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，(2)所述暗培養(yǎng)包括將所述愈傷組織置于MS固體培養(yǎng)基中，23℃暗培養(yǎng)72小時(shí)。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，(3)所述培養(yǎng)包括，將所述宿主侵染的胚性愈傷組織，置于R0培養(yǎng)基中35℃,50μmol·m-2·s-1光密度，16h小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)3天，溫度調(diào)回25℃,再培養(yǎng)4天。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，(4)所述第一次繼代培養(yǎng)包括將所述胚性愈傷組織置于R1培養(yǎng)基中，25℃,50μmol·m-2·s-1光密度，16h小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，每?jī)芍芾^代一次，共繼代4次。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，(4)所述第二次繼代培養(yǎng)包括將所述胚性愈傷組織置于E1培養(yǎng)基中，25℃,50μmol·m-2·s-1光密度，16h小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，每?jī)芍芾^代一次，直到莖長至5-6cm。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，(4)所述生根的培養(yǎng)基包括E2培養(yǎng)基。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述提高大麻外植體的再生效率和/或建立大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法包括如下步驟：

(a)、愈傷組織誘導(dǎo)：在雌性大麻植株開花后30天左右，取未成熟大麻種子進(jìn)行無菌處理后切開種殼，將未成熟種子幼胚的胚芽部分約0.5-1cm放置于CIM培養(yǎng)基，28度暗培養(yǎng)5天，誘導(dǎo)愈傷組織生成；

(b)、農(nóng)桿菌侵染及共培養(yǎng)：取YEP溶液，加入凍存菌液，在28℃條件下過夜培養(yǎng)約16小時(shí)，保持200rpm轉(zhuǎn)速搖勻；將菌液離心，之后用MS培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整OD600吸光值達(dá)到0.1；

無菌條件下將所述胚芽轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌菌液中，以80rpm轉(zhuǎn)速在20℃±5℃緩慢搖40分鐘；倒掉菌液，用滅菌后的濾紙吸干殘余菌液；將所述胚芽分散于墊有濾紙的MS固體培養(yǎng)基中，保證每段胚芽均接觸到濾紙，23℃暗培養(yǎng)72小時(shí)；

(c)、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)：將所述胚芽轉(zhuǎn)移到R0培養(yǎng)基，確保根部插入培養(yǎng)基中，35℃,50μmol·m-2·s-1光密度，16h小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)3天；溫度調(diào)回25℃,再放4天；

(d)、芽的誘導(dǎo)、芽的分化和生根：切去伸長的根部，把莖的部分轉(zhuǎn)移到R1培養(yǎng)基，保證每段胚芽均接觸到培養(yǎng)基；每?jī)芍芾^代一次；愈傷組織經(jīng)繼代后，愈傷組織轉(zhuǎn)成米粒狀顆粒，將其轉(zhuǎn)入E1培養(yǎng)基上，每?jī)芍芾^代一次，直到莖長至5～6cm，切掉下端黑死部分，移到E2培養(yǎng)基生根；生根后的幼苗移至溫室，25℃,50μmol·m-2·s-1光密度，20h小時(shí)光照/4小時(shí)黑暗。

本發(fā)明包括但不限于取得了如下有益效果：

1.現(xiàn)有技術(shù)是以大麻種子萌發(fā)后的子葉為侵染對(duì)象，大麻子葉脫分化后能夠再分化成幼芽的比例極低，且農(nóng)桿菌侵染過程本身會(huì)進(jìn)一步抑制外植體再分化。因此，現(xiàn)有技術(shù)獲得陽性植株的產(chǎn)率極低。通過對(duì)10種較為常見的大麻品種進(jìn)行試驗(yàn)后，現(xiàn)有技術(shù)的平均陽性率為0.1％，本發(fā)明涉及的技術(shù)以在雌性大麻植株開花后30天左右，未成熟種子的胚芽作為外植體材料，且在農(nóng)桿菌侵染前進(jìn)行特殊預(yù)培養(yǎng)處理，極大增加陽性率，通過對(duì)10種較為常見的大麻品種進(jìn)行試驗(yàn)后，現(xiàn)有技術(shù)的平均陽性率為10％。

2.現(xiàn)有技術(shù)只能進(jìn)行大麻瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌侵染大麻子葉后，只有再生幼芽的部分器官中可以檢測(cè)到外源基因的瞬時(shí)表達(dá)，并未獲得可以穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明涉及的技術(shù)提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效且穩(wěn)定的大麻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建方法。通過使用ARF19pro驅(qū)動(dòng)生長調(diào)節(jié)基因CsWIND2和CsARR5的編碼核酸序列的基因編輯表達(dá)構(gòu)建載體，對(duì)類胡蘿卜素脫飽和酶基因(CsPDS1)進(jìn)行堿基敲除，獲得基因編輯植株以及穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株?，F(xiàn)有技術(shù)并不能夠進(jìn)行基因編輯以及產(chǎn)生穩(wěn)定可遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。[0062]3.受遺傳背景影響，不同品種大麻幼胚胚芽的芽再生效率差異很大。為了提高轉(zhuǎn)化成功率，申請(qǐng)人對(duì)國家麻類種質(zhì)資源中期庫中45個(gè)大麻品種的幼胚胚芽的平均芽再生效率進(jìn)行評(píng)估，篩選出最適合進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染的品種2個(gè)：DMG278(芽誘導(dǎo)率18.26％)和YUNMA7(芽誘導(dǎo)率14.71％)。這兩個(gè)品種均可以作為本申請(qǐng)中涉及的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的模式品種。

4.愈傷組織能否正常生長是決定農(nóng)桿菌侵染后芽誘導(dǎo)率的關(guān)鍵因素。大麻侵染后的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植物激素的組成和濃度對(duì)于愈傷組織誘導(dǎo)效率影響很大。為了促進(jìn)大麻幼胚胚芽愈傷組織生長，申請(qǐng)人對(duì)于植物外植體組培過程中常用的4種植物激素噻重氮苯基脲(TDZ)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)和引哚乙酸(IAA)的誘導(dǎo)效率進(jìn)行研究，摸索出最適合大麻的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，解決了愈傷組織生長較慢影響轉(zhuǎn)基因效率的問題。

 

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1示YUNMA7不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)和芽再生；其中，各發(fā)育階段的描述如下：A示開花后30天未成熟種子的胚；B示授粉后30天從未成熟種子中分離的胚芽；C示在體外培養(yǎng)29天后形成的愈傷組織；D示在體外培養(yǎng)78天后的芽；A比例尺：0.5厘米；B?D比例尺：2厘米；

  

圖2示CsPDS1被編輯后產(chǎn)生的白色芽和其他嵌合體芽，以及突變所在位置的測(cè)序結(jié)果；其中，A示從愈傷組織中發(fā)育出的表現(xiàn)為全部或部分白色的基因編輯芽；B和C分別示上部芽為綠色和下部芽為白色的嵌合組織(白色圈)，以及發(fā)育異常的白色芽(白色箭頭)；D和E示突變所在位置的測(cè)序結(jié)果及其色譜圖，黑色箭頭指示突變，黑線表示基因編輯的靶向序列和Cas9編輯蛋白識(shí)別序列(PAM)；

  

圖3示轉(zhuǎn)基因大麻幼苗和轉(zhuǎn)基因篩選結(jié)果；其中，A示從轉(zhuǎn)基因幼苗的莖中再生的芽；在農(nóng)桿菌侵染后獲得一株攜帶CsWIND2–CsARR5共表達(dá)組合的基因編輯空載體的轉(zhuǎn)基因幼苗W25?1；將W25?1莖切成塊，并在含卡那霉素的再生培養(yǎng)基中孵育6周；從莖外植體分離出多個(gè)芽；B示從W25?1莖再生的轉(zhuǎn)基因幼苗；經(jīng)過5周在R1培養(yǎng)基中孵育后，所有幼苗都轉(zhuǎn)移到土壤中；在溫室中生長時(shí)，每3周對(duì)頂端第1片完全展開的葉子采樣；C和D示從W25?1再生的5個(gè)幼苗的轉(zhuǎn)基因特異性PCR結(jié)果；在第2輪篩選中，使用引物AtU6?F1/R1和CsCAS9F2/R2進(jìn)行轉(zhuǎn)基因特異性PCR，這些植物(Cas9?1到Cas9?5)被鑒定為轉(zhuǎn)基因植物；P：陽性對(duì)照的DNA樣本，N：陰性對(duì)照的DNA樣本；白色箭頭：特異PCR產(chǎn)物；

  

圖4示大麻品種對(duì)未成熟胚胎胚芽芽再生率的影響；對(duì)于每個(gè)品種，從未成熟胚胎中分離90?130個(gè)胚芽，在CIM培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，后轉(zhuǎn)移到R0培養(yǎng)基；芽再生率計(jì)算為每個(gè)品種的再生芽/總愈傷組織的百分比，對(duì)于DMG278為18.26％，對(duì)于YUNMA7為14.71％。

  

 

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了提供基于生長素調(diào)節(jié)因子組合的大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明以大麻幼胚為侵染對(duì)象，通過特異表達(dá)啟動(dòng)子共表達(dá)生長調(diào)節(jié)基因CsWIND2和CsARR5，顯著提高了陽性植株產(chǎn)率。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種大麻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，該遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)包含生長調(diào)節(jié)基因CsWIND2和CsARR5表達(dá)的基因編輯載體，能夠在愈傷組織中強(qiáng)表達(dá)。生長素響應(yīng)因子ARF19在大麻愈傷組織中表達(dá)量最高，因此采用生長素響應(yīng)因子auxinresponsefactor19(ARF19)的啟動(dòng)子ARF19pro驅(qū)動(dòng)生長調(diào)節(jié)基因CsWIND2和CsARR5的高水平表達(dá)。

基因序列(ARF7pro?CsWIND2)如SEQIDNO.1所示：

  

  

  

1-2001bp：ARF19pro啟動(dòng)子2002-3123bp：CsWIND2

3124-3377bp：NOS終止子。

基因序列(ARF7pro-CsARR5)如SEQIDNO.2所示：

  

  

  

  

1-2001bp：ARF19pro啟動(dòng)子

2002-2703bp：CsARR5

2704-2957bp：NOS終止子

ARF19pro啟動(dòng)子：

SEQIDNO.3：CCATTGTTATTTTGAAGCTAGATCCTTCGCCATTTCACTCTGTTCAGTAAATCAAAATTTGAAGACCTTTTTTTTTTGTATATTATCCTAACGTGACAACCTTAAACATTAGTGGCCTGTTTTTTTTTTTCCTTTTGATTTGTAACACGAGGTCTTCAATCCAACTGCAATGCTGACTTATTATTTTGAATACAGAGTCTATAACCGCCTGAAGGAATAAGTAAATTAACATGGAATAACGATGGAAGATTGATAAATATATTAACATCTCAAATATTGCATTAGGAAGACTACATTATAGGAACACAACCTCCTGCAAAATTATAGCAAAACAAGGAAGACTACATTATTTAATTGCTGATCTATAAATGTGAGAAACTTTAAGTATGGGACAAAGCTCTAAGCACTTGCTTTGGACTGAAATAACTTCAAAGTCAACTATTGCATGCAGCAAAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATTTCTCGAAGTGCATTAGTTTAACTGAGTTATGTATTGATCATATATAGTGAAGTGTTATAACGTTAGAAAGGTTAACAATTAATTGCATGTCAGTCTTATTCGAAGGACAGTAATCCTATCATCGTGTGTAAACCACTTGCTATTAGTGTTTCACTATTAGTCCACCTTATGAATCGTGTAGATATATACTTGATAATTCCAATTCTTAATTTCGCTTTATTCATCCATTTTTCTAAAACAAAGGTTTCAACGGCACAAAAACTCTACCATTATATTGGAAATGTGCTATAATTTGTGCTACATAAAAAATTAACGTTCCTTTAGAAGAAAAATCTCAACTCCGCCACAAAATTCAGACAATACAAGGTGTGCAGCAAATCCTATTAAGAGACATCTGAGACAAACTACGAAAGCACAGCCATAACATCCGACGCCCTCAAAGCTATGTAGTCACCATCTTTGCCCTTGAAGTCATTCCCTGCATATTTAGAGTACATGACAGTGTTCCCAGGTGCGACGGACAGTGGTTTCCTGTTCCCTTCCTCATCCAAAGGACCAGGTCCAACTGCAATTACCTGTTAAACAAATAGCAACCATCATCAACAATCTCATTTCCAAGAGTGAACTATTACAAGTAGTAAAGAATATCCAAATCCAATAACGAATACTCACCGTGCCAATAGAGGGCTTCTCCTTACTTGCTTCAGTCAGCAACAGCCCCCTGCTGTCTTCTCCTCAGCCTCTGCAATCTGAAAGCACATATTTTAAATGTGTCATTACCATTGTACACCAACAACAGTACATTTTTCCAATGCAACTTCATTTAATAAAAGATGGCTCTTCAGAGGATTAAATAATCATATGAAAAGAGATTACAATAGGTCAAGTTGCCAGGTAACAAACCTTGATTAAGACTCTATCATTCAAGGGCTTGAGATCTTTGACATCATCAGTTTCAAGAATACCAACAATGTCATCATCCTTCAATATAAGATGCTTTGAACCATTGAATTCCAGCTCTGTCCCAGCATACTTGGAGTAAACAACTTGGCTGCCAGCCTACTTGAAAAAAGCAATCGAGGGTCACAAATGAAAGTCTTTTATTACTCAAAAAAGAAAGCATTTATCAAAATTTTATAAGCAAATCTATTACCTTCACACTGACTTCCACTTTTGCCTTCCCAACTGCCCTGCCTTCTCCAACAGCAACAACCTCTCCACCTTGAGGCTTCGATTGAGCTGTGGTTGGAAGCAATATTCCACCTTGAGTTTTCTCATCTGCGGTCTTGAGCTTCACGAGAACTCTGTCACCCAAAGGTTTAATTGATGTGTACTGAAATTTCAAATCACATTTTACATGTAAGATAATATACAAAAGGAAAAAAAAAAACAATTTTAGCATATTTCAGATCGTGCACAACGTATTCACTATTGAATTTATGACATGAGACCCTCAAAGTTGTAGACCTATGGCACTGAAAAATAAATACAATTTCATAAACCA

本發(fā)明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麻幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的具體操作步驟如下：

(1)愈傷組織誘導(dǎo)。取開花后30天的未成熟大麻種子用75％乙醇清洗5分鐘，20%次氯酸鈉清洗25分鐘，再蒸餾水漂洗干凈。用鑷子和手術(shù)刀切開種殼，將未成熟種子幼胚的胚芽部分放置于CIM培養(yǎng)基，28度暗培養(yǎng)5天，誘導(dǎo)愈傷組織生成。

(2)農(nóng)桿菌培養(yǎng)。包含ARF19pro-CsWIND2和ARF19pro-CsARR5的編碼核酸序列的表達(dá)建體導(dǎo)入AGL1根癌農(nóng)桿菌。在剝種子當(dāng)天，在三角瓶中加YEP溶液10mL(加抗生素)，加入凍存菌液50μL，在28℃條件下過夜培養(yǎng)約16小時(shí)，保持200rpm轉(zhuǎn)速搖勻；將菌液倒入2mL離心管離心，之后用MS培養(yǎng)液懸浮，每次吸取200μL懸浮菌液加入30～40mL新的懸構(gòu)浮液中，最終OD600吸光值達(dá)到0.1(溶液比較清亮，但比未加菌液的懸浮液渾濁)。

(3)農(nóng)桿菌侵染及共培養(yǎng)：無菌條件下將胚芽約100～150個(gè)，轉(zhuǎn)入到30mL農(nóng)桿菌菌液中，以80rpm轉(zhuǎn)速在20℃±5℃緩慢搖40分鐘。倒掉菌液，用滅菌后的濾紙吸干殘余菌液，吹10分鐘使表面稍為干燥。將胚芽分散布于墊有濾紙的MS固體培養(yǎng)基中，保證每段胚芽均接觸到濾紙，進(jìn)行暗培養(yǎng)(23℃)72小時(shí)。

(4)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。胚芽轉(zhuǎn)移到R0培養(yǎng)基，確保根部插入培養(yǎng)基中，每盤50個(gè)，35℃,50μmol·m-2·s-1光密度，16h小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)3天。溫度調(diào)回25℃,再放4天。

(5)芽的誘導(dǎo)。切去伸長的根部，把莖的部分轉(zhuǎn)移到R1培養(yǎng)基，保證每段胚芽均接觸到培養(yǎng)基。25℃,50μmol·m-2·s-1光密度，16h小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，每?jī)芍芾^代一次，共繼代4次。愈傷組織經(jīng)繼代后，有的愈傷組織轉(zhuǎn)成米粒狀顆粒，將其轉(zhuǎn)入E1培養(yǎng)基上，進(jìn)一步分化，第一次將胚性愈傷從皿中挑取到分化培養(yǎng)基的時(shí)候，盡量分布緊密，分布密度為4個(gè)/cm2,植物細(xì)胞的生長具有群體效應(yīng)，分布太散，容易死亡。

(6)芽的分化及生根。外植體放置于E1培養(yǎng)基，25℃,50μmol·m-2·s-1光密度，16h小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，每?jī)芍芾^代一次，直到莖長至5-6cm，切掉下端黑死部分，移到E2培養(yǎng)基生根。生根后的幼苗移至溫室，25℃,50μmol·m-2·s-1光密度，20h小時(shí)光照/4小時(shí)黑暗。[0093]本發(fā)明提供了一種提高大麻基因再生效率的方法：向大麻植物細(xì)胞導(dǎo)入由生長素響應(yīng)因子ARF19的啟動(dòng)子ARF19pro驅(qū)動(dòng)生長調(diào)節(jié)基因CsWIND2和CsARR5的編碼核酸序列的表達(dá)構(gòu)建載體，從大麻植物細(xì)胞再生完整植株。

本發(fā)明還提供了一種在大麻中進(jìn)行基因編輯的方法，向大麻植物細(xì)胞導(dǎo)入由生長素響應(yīng)因子ARF19的啟動(dòng)子ARF19pro驅(qū)動(dòng)生長調(diào)節(jié)基因CsWIND2和CsARR5的編碼核酸序列的表達(dá)構(gòu)建載體。向大麻植物細(xì)胞導(dǎo)入至少一個(gè)包含至少一種外源核酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，其中至少一種外源核酸序列編碼基因編輯系統(tǒng)的組分，并從大麻植物細(xì)胞再生完整植株。

本發(fā)明還提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麻轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟：

a.愈傷組織誘導(dǎo)。在雌性大麻植株開花后30天左右，取未成熟大麻種子進(jìn)行無菌處理后切開種殼。將未成熟種子幼胚的胚芽部分(約0.5-1cm)放置于CIM培養(yǎng)基，28度暗培養(yǎng)5天，誘導(dǎo)愈傷組織生成。

b.農(nóng)桿菌培養(yǎng)。在剝種子當(dāng)天，在三角瓶中加YEP溶液10mL(加抗生素)，加入凍存菌液50μL，在28℃條件下過夜培養(yǎng)約16小時(shí)，保持200rpm轉(zhuǎn)速搖勻；將菌液倒入2mL離心管離心，之后用MS培養(yǎng)液懸浮，每次吸取200μL懸浮菌液加入30-40mL新的懸浮液中，最終OD600吸光值達(dá)到0.1。

c.農(nóng)桿菌侵染及共培養(yǎng)。無菌條件下將胚芽轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌菌液中，以80rpm轉(zhuǎn)速在20℃±5℃緩慢搖40分鐘。倒掉菌液，用滅菌后的濾紙吸干殘余菌液，吹10分鐘使表面稍為干燥。將胚芽分散布于墊有濾紙的MS固體培養(yǎng)基中，保證每段胚芽均接觸到濾紙，進(jìn)行暗培養(yǎng)(23℃)72小時(shí)。

d.胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。胚芽轉(zhuǎn)移到R0培養(yǎng)基，確保根部插入培養(yǎng)基中，每盤50個(gè)，35℃,

e.芽的誘導(dǎo)。切去伸長的根部，把莖的部分轉(zhuǎn)移到R1培養(yǎng)基，保證每段胚芽均接觸到培養(yǎng)基。每?jī)芍芾^代一次。愈傷組織經(jīng)繼代后，有的愈傷組織轉(zhuǎn)成米粒狀顆粒，將其轉(zhuǎn)入E1培養(yǎng)基上，進(jìn)一步分化，第一次將胚性愈傷從皿中挑取到分化培養(yǎng)基的時(shí)候，盡量分布緊密，植物細(xì)胞的生長具有群體效應(yīng)，分布太散，容易死亡。

f.芽的分化及生根。外植體放置于E1培養(yǎng)基，每?jī)芍芾^代一次，直到莖長至5-6cm，切掉下端黑死部分，移到E2培養(yǎng)基生根。生根后的幼苗移至溫室，25℃,50μmol·m-2·s-1光密度，20h小時(shí)光照/4小時(shí)黑暗。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟a中，以在雌性大麻植株開花后30天左右，未成熟種子的胚芽作為外植體材料。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟a中，以胚芽作為外植體材料需要在含有特定植物激素組合的CIM培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)5天，才能進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，以1L體系計(jì)，該激素組合為：1mg2,4-D、0.25mgKinetin和100mgCaseinHydrolysate。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟e中，以胚芽作為外植體材料需要在含有特定植物激素組合的R0培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，才能誘導(dǎo)產(chǎn)生胚芽，以1L體系計(jì)，該激素組合為：0.5mgTDZ，0.5mg6-BA，0.2mgNAA，0.2mgIAA。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟f中，以胚芽作為外植體材料需要在含有特定植物激素組合的E1培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，才能誘導(dǎo)根系產(chǎn)生，以1L體系計(jì)，該激素組合為：0.2mgNAA，0.5mgIBA，0.01mgZeaRIB。

本申請(qǐng)中涉及的生長調(diào)節(jié)基因CsWIND3、CsBBM、CsAGL15、CsWIND2、CsARR5、CsGRF3和CsGIF1的cDNA序列(起始密碼子和終止密碼子以下劃線標(biāo)注)。50μmol·m-2·s-1光密度，16h小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)3天。溫度調(diào)回25℃,再放4天。

>CsWIND3(LOC115722430)cDNA(SEQIDNO.4)：ATGGATGATCATGATCATAATCAATATCCCAAAATGGAAACTTTCTTACCAAAAGGATTAATGCCCTCTTATTTTCAAGGCATATCCTCAAATGGGTCAAATTTTTTCAAAGATCCAAACTTGTTAAGTTCTTTAACACCAACTTATTATCTTGATCATGAAGATCATGATAATGATGAAAAAAATGTTATGGTATCTACTTATAATAACACTTATGCTACTACTTATCATAACACTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTCTTCCTTTTGTTCCTCTAAATCTCTCTGATCATCACAATCAACAACAATCAAAAGGGTTCAATGGTTATAATTGGCTTAGCCCAACAAAGACTCAACCAATGAAAAACACTGGATTATCATCATCGCTACAAAGTCAAAGTCAAAGTCAAAATCAAAGACAGAAGTCAACATTTTCATCGGTTAAGTTATTTAGAGGTGTGAGGCAGAGACATTGGGGAAAATGGGTAGCTGAGATTAGATTACCAAGAAACAGAACAAGGGTATGGCTTGGAACATTCGAGACGGCGGATGAAGCCGCCATGGCTTATGACACTGCAGCTTACATGTTGAGAGGGGATTTTGCTCATTTGAATTTTCCTCACATGAAAAATCAACTCAAGGCTAATTCTCTTAATGGAGCAATTGTTGCTCTTCTTGAAGCTAAACTTCAAGCCATTTCAAATGCTAGTGTTATTTCTAATAATACCAATAATGAATTATCATCATCATCATCACCAAAGAAGATTAAGAAGAATGTGTCATTGAAAAGTTCAAAAGATTATTATGATCATGATCATAAGGAAGTGATTATGGATTCTTCTTCTTCTTCTAATAATAATAATAATAATCATAATGAATTAGTCATTGGTGATGTTGAAGCTGTTCAACTAAGTAGAATGCCTTCTTTGGATATGGATATTATTTGGGATGCTCTTTTGGTTTCTGATTAA

>CsBBM(LOC115718863)cDNA(SEQIDNO.5)：ATGCATGGACTAATACTCATCTACATACCCTCCATTGAAACCATATTAACTCTCACTTCTCTTAATAAGGTCTCTCTCTTTTCAATCTACATATATAATATGGGTTCTATGAACTGGTTAGGTTTCTCTCTTTCACCTCAAGAACCTCATCATCATCAAGATCACTCTCAGTCAACAGTCTCTCATCACGATCACCGCCTTGATGGCTTCAACTCTGATGAAATCTCCGGAAACGATGTCTCCGGCGAGTGCTTCGATCTCACTTCCGATCATCACTCCACTCATGCTCCTTTTGGCATACTCGAAGCTTTCAACAGATCAAACAATAATAATCACTCTCAAGATTGGAACAATATGAACTCGACCAACTCATCGGACTTTTCTATGCTAATGGGAAGTAATAATAACCAAAACCAACAACAACACGAGCAACCGAAGCTGGAAAACTTTCTCGGCCGACACTCTTTCGCCGATCATCACAATACATACAACACTAGCACTACTACAGCCGACTACATGTTCCAAGCCTCATGCGCCGCTTCCTTGAACATCTCATCCGAAGCCGCAGTCGCAGCCGCCGCGCCTACCGGTGTAAGTGCCGGAGTTGGAGGAGCTGGAAGCTCCATTGGGCTGTCTATGATCAAGACGTGGCTTAGGAACCAACCTGCCCAGACTCAGCCGGCTGAGACTACTACCAATAATAAGAATGACTGCAGCGGCGGTGGAGGAGGTGGAGCCGGTGCAACTACTGCGGCAGCGAGTACAACTACTCATCAGACTCTTTCTCTGTCTATGAGTACTGGATCGCAGTCTAGCTCAGCTTTGCCTCTTCTTACGACTGGGAGTGGTGGGGAGAGTTCTTCTATATCGGATAATAATAAGCACCCTAGAACGGTAACGACAGTGGCGGTGGCTACGGCCGCTGGGGTTGATAGTCCGACAACCGCCGCAATAGAGGCTGTGCCTAGAAAATCCATTGATACTTTTGGACAAAGAACATCTATATACCGTGGTGTAACCAGACATAGATGGACAGGTAGATATGAGGCTCATCTATGGGATAATAGTTGCAGAAGAGAAGGACAAACTCGCAAGGGAAGACAAGTTTACTTGGGTGGTTATGACAAGGAAGAAAAGGCAGCTAGAGCTTATGATCTTGCAGCATTGAAATATTGGGGTACCACAACCACTACCAATTTTCCTATCAGCAATTACGAAAAAGAAGTGGAAGAAATGAAGCACATGACAAGGCAGGAATATGTAGCATCTTTGCGAAGGAAGAGTAGTGGGTTCTCTCGTGGTGCGTCCATTTATCGAGGGGTAACAAGACACCATCAGCACGGGAGATGGCAAGCAAGAATTGGACGAGTTGCGGGAAACAAAGACCTGTATTTGGGCACATTCAGTACACAAGAGGAAGCAGCAGAAGCATACGACATCGCAGCTATAAAATTCCGAGGACTAAACGCAGTAACCAACTTCGACATGAGCAGATACGACGTCAAATCCATATTAGAGAGCAGCACACTCCCCATAGGAGGAGCAGCCAAGAGACTAAAAGACGCCGAACAAGCCGAGATAATGACAGCTGTCGAGTGCCAGCAAAGAACCAGTAACAATATTATTGTCGAACCAGACAACATGACCTCACCGCTCACAGACGCAATCACCAATTACAATGCAGCCGCAGTGGCTGCGGCTGCTGCTGCCGTTGCTCATGGCCACCATGGCGGTGGCTGGCCAGCCTTGGCAGCTTTCCAACAACCATTCACTATGCATAACTACCCTTATGGTAATGGACAGAGCCGAGGACTTTGGTGCAAGCAAGAAGTTGAAGATTCTGATCATAGCAATACTCATGCCTTTCATGATCAGATTCAGCTGAGCAACACTCACAATTTCTTTCAGCCAAACAACAATTCTAACTCAGTTTTGCATAATCTAATGGGGATGGACTCTTCTTCAATGGAACACAGCTCAGGTTCGAACTCTGTTATGTACAGTAGTAGTAATAACAATAATAATGGAGGTGATCATCATAACGGGTACGGAAACGGCAGTGGATATAATGTCGTTCCTATGGCTACCGTCATAACAAACGACAACAGTAGTAATAATAACGGTTTTGGTGATCATCATCATCAGCAGCAGCAGCAGCATGAAAATAATAATAATGTGTTTGGTAATTCTAGTAACGATCCTTATAGCCATGCTAGGAGCTTGTACTACATGTCAACACAGCAGTCCCCTGTGACGGTGGGCGTTGTTAAAGGTACAGGGTATGATCACCAACAGGGCTCGGCTTGCAGCAATAATTGGGTTCCTACTGCTGTTCCATCTCTTGGACCAAGGTCATCCAGTATTAACATGGCTCCATTCACTGTGTGGAACGACTCCTAG

>CsAGL15(LOC115710309)cDNA(SEQIDNO.6)：ATGGGTAGGGGTAAGATTGAGATTAAGAGGATTGAAAATGCTAATAGCAGACAAGTTACTTTCTCTAAAAGAAGGGCTGGTTTGCTTAAAAAGGCTCAAGAACTTGCTATTCTTTGTGATGCTGAGGTTGCTGTTATAATCTTTTCTAATACAGGGAAGCTTTTTGAGTATTCGAGTTCTGGTATGAAAAGAACACTGGCAAGGTATAATAAATGTGTAGATTATCCTGAAGGTGCTATTGTAGACAAAACAGAGAAGCAAGATTCTAAGGAGGTTGATGATTTGAAAGATGAAATTGCAAAGCTACAACGAAAACAATCTCGTTTGTTAGGCGAAGACTTAAGTGGAATGAGCTCGAAAGAATTGCAGCACCTTGAACACCAACTAAATGATGGATTAATTTCGGTGAAGGAAAGAAAGGAGAAATTACTGAAGGAGCAACTAGAACAATCAAGACTACAGGAACAGCGTGCTGTACTTGAAAACGAAACATTGCGCAGACAAATTGAAGAGCTTCGATGTTTATTTCCTCGAGCTGATTGCACGGTTCCATCTTACCTTGAGTACTACCCCATTGAAAAGAAGAATTCTAGTGCTAATCATAGTGACATTGGACCAGACCAGAACTCCAATTTTGCAGCCGAGAAAGGAGACTCTGACACCACATTGCATTTAGGGTTGGCTAGTGATGTTTACAGAAAGAGGAAATCTCCTGAGCAAGAAATGCACTCCACAGACTCAGGAAGCAACATGGGCCTACTTTGA

>CsWIND2(LOC115713946)cDNA4(SEQIDNO.7)：ATGGCAGCAGCTATAGATTTTTACAGTAGTAGCAGCAGCAGCAGCAGCCAAGCACCAGTTTTCTCAGATCCTTTTAGAGAAGAGCTCATGATAGCACTTGTGCCTTTTATGAAAAGTGCTTCACCAGCAGCTTCTCCCTCTACTTCTTATACTTCTTCTTCTTCTCCTCCTTCATCTTCTTTTTCTTCTTACCCTTCTTGCTCTTATTCTCCACTCTCCTCAACCCAATCAAACTATTTCCCTGAAACCCAAGACTTCTCCAACCAGGTGTGCTTTCAGCCACAGACCGGATCATTAGGCCTTAACCAGCTCACTCAATCTCAGATTCTCCAAATCCAAGCCCAAATTTATTTCCAACAACAACAACAACAAAAACAAAAACAACAAATGGCAGCCATGGCTAAGGCCTCAATCAATAGCCAGTGGCAGAGCCAAAACCCCCAAACCCTTAGCTATCTCAGCCCAAAAGCCATCCCCATGAAACACGTTGGTACTCCCCCAAAAGCTAACAAGCTCTACAGGGGAGTTAGACAGAGGCATTGGGGGAAATGGGTTGCCGAGATAAGACTCCCTAAGAACCGAACTCGCCTCTGGCTTGGTACCTTTGACACAGCCGAGGAAGCTGCTTTGGCTTATGATAAAGCAGCTTATAAGCTCAGGGGAGAGTTTGCTCGTCTCAATTTCCCTCATCTCCGCCATGAAGGAGCCCATGTTACCGGCGCTTTTGGCGAGTACAAGCCTCTGCATTCTTCCGTTGATGCGAAGCTTCAAGCCATTTGCCAAAGCTTGGCTAATAATAATAATAACAATTCGCAGAAACAAGTGAGTTCTGGCGAGTCCTGTTCGGAGGCAGAGGAGAAACCGACAATAATAGTACCAGTAGCTCCAATGGAGTCGAATTTGGTCTCTGATAATTCATCGACAGGTGAACCGAAAGCCGAGTTAGAAGGCTCTTCGTCATCGTTGTCTTCGCCTTTGTCTGATGAGTCTTCAGCAGGGTCATCTTCACCGGAGTCTGATATAACATTCTTGGATTTTACCTCCGATTCTCAATGGGATGACACACAGAATTTTGATCTGGGCAAGTACCCTTCTGTGGAGATTGATTGGGATTCTATTTAA

>CsARR5(LOC115711466)cDNA(SEQIDNO.8)：ATGGCGGCGATGGCTAGTGAAATTCTCAGACGCAGTTTAGCGGAAAGTGTTAAGATTTCTAATGGGTCTGGCTCAGGGGAGCTTCATGTTCTTGCTGTTGATGATAGCCTTGTGGACCGTAAAGTCATTGAACGACTGCTGAAGATCTCTTCCTGTAAAGTGACTGCTGTGGAAAGTGGAACTAGAGCTCTGCAATATCTGGGATTGGATGGCGAGAAGAGCTCAGTTGGATTTGATGCTCTTAAGGTGAATCTGATAATGACAGACTATTCAATGCCAGGGATGACAGGATATGAGCTTCTTAAAAAGATCAAGGAATCATCTGCTTTCAGAGAGGTTCCAGTAGTGATAATGTCTTCAGAGAACATCATGACTCGTATTGATAGATGTTTAGAGGAAGGAGCTGAAGAGTTTATAGTGAAGCCAGTAAAACTCTCTGATGTGAAACGCTTGACCAGTTTCGTAATGAAAGGGGAAGGAAAAGAGAATGGAGATGGAGAAAGAGTGAACAAGCGAAAGCTTGAAGATGATGATGACAGCAGCAGCCCCGTGTTGTCGTCACAATCGTCGTCGCCACCACTTTCGCCTAAGTCCTCTTTGGATTCATGTAATCAACCAACCGACGAACAACTGTCTTCTTCCCCGTCTTCACCCGAGTGCTCACCAAAGAGGCCTAGATTGCAGAGCACTGATTCACTGTAA

>CsGRF3(LOC115702269)cDNA(SEQIDNO.9)：ATGGACTTCCATCTGAAGCAATGGAGAAATCAGCAACATGAGTCAGAACATCACCAACAACATTCTGCAAAGATACCAAAACTTGTTATCGAAACCCATCACATGAAACAAGACCTCTCTTCTACTTGTTCTGAACCTCTTCCTCTGTTTGTACCTGAGCCACCAAACATCACTAAAATGATCACAACTGGTACTCTGTCTACTGATTCAACTACTTCTCCCACTACTAGAATCCCAAGAGGAGGAATGGGTAGTTACTTTAGTTTGGCCCAATGGCAAGAACTAGAGTTACAAGCTTTGATATTTAGGTACATGTTAGCTGGTGCTACTGTTCCTTCTGAGCTTCTTCAACATATTAAGAAAAGCTTTAATCTTCTTCATACGACACCGTATTTCTTGCATCATTCTCTTCAACCTTATCCCCATTTTCAACCTTCCCCTACTTTGTTACAGTCGGGTTATTGGGGAAAAGCATCCATGGATCCGGAACCTGGTCGGTGCCGGAGAACAGACGGGAAGAAATGGCGGTGTTCAAGAGATGTGGTGGTTGGTCAAAAGTACTGTGAGCGCCACATGCACCGTGGAAGAAATCGTTCAAGAAAGCCTGTGGAAATCCCCACACCCACCACCACCACCACCGGCGGCGGAAGACTCGCCGGGGACGGCGTCGGAAGAGGGACTCTTGCTTCTAACAATGGTCCATCTCCTTTGTCAACGTCATCTAATGCAGCCCATTTCTCACTTTCAATGCCAACATCCTCCATAGATCTCCTCCATCTCAACAACCGGAGTAACGCTTCAGATGTTAAAAATGAAAATAAGGACTTGTTTAAACCCCATAATGAGGTCTCCGGCGACGGCAAATCGGACGGTCACATACTCCGGCACTTCTTTGATGACTGGCCGAGATCACTTCAAGAATCAGGAAATGTAGAAATTAATAATAATAATAATAATAATAATAACAATAACAATAATAGGATGAGGAAGAGTCCAATGAGCTCAGCTTCAAGCTTATCAATTTCCATAACGGGAAACAACTCATCATCAACTTCTGATATTTCGTTGAAGTTGTCAACTGGTGGAAACGGAGAGGAAATGGGCCACCCAGAAGCCCATTCTGATCGTCAGCAGCAGTCTCAGTTGGGCTGGGCCTCGAGTGGATGGGCTTCAAACCCAATGGCCTCAATGGGTGGGCCGCTGGCTGAGGCCCTGCGATCCTCCAACTCCAATTCATCATCTCCTACTAGTGTTCTCCATCAGTTGCCTCCTCGTTCTTCTGCCTCTGACACTTGCATTGTCAGCACTTAA

>CsGIF1(LOC115720645)cDNA(SEQIDNO.10)：ATGCAGCAGCACCTGATGCAGATGCAGCCCATGATGGCAGCCTATTATCCCAACAACGTCACCACTGATCACATTCAACAGTATTTGGATGAAAACAAGTCACTGATCCTGAAGATTGTTGAGAGCCAGAATTCAGGAAAATTGGGTGAATGTGCAGAGAACCAAGCTAGGCTGCAGCGAAACCTCATGTACCTGGCTGCTATTGCTGATTCTCAGCCCCAGCCTCCTACAATGCATTCTCAGTATCCTTCAAGTAGTATTATGCAGCCTGGAGCACATTACATGCAACAGCACCAACAAGCTCAGCAGATAACTCAACAATCACTCATGGCGGGAGGCTCGTCCATGCTGTACAACCAGCAGCCATTTACAGCTTTGCAACAGCAAGCACTGCACAACCAGCTCGGCATGAGCTCTGGTGGAAACTCGGGACTTCACATGCTGCAAAGTGACATGGGTAGCGCTGGAGGCAGTGGGCAGCAGCTTGGAGGTGGAGGATTTCCTGATTTCAGCCGTGGCTCTGGAGGAGAAGGGATGCATAGAGGAATGGCTGGCGGTAGTAAGCAAGATATGGGAAGTTCTGGATCGGCTGAAGGCCGAGGAGGGAGCTCTGGAGGTGACGGGGGTGAGACCCTTTACTTAAAATCTGCCGATGATGGGAATTAA

本申請(qǐng)中涉及的CsPDS1的cDNA序列以及陽性鑒定所需引物序列(起始密碼子和終止密碼子以下劃線標(biāo)注，編輯位點(diǎn)加粗顯示)。

>CsPDS1(XM_030651587.1)cDNA(SEQIDNO.11)：AIGTCTCAGTGGGGTT

  

  

陽性鑒定引物序列如下：

AtU6-F1(SEQIDNO.12):CATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGA

AtU6-R1(SEQIDNO.13):CCGACTCGGTGCCACTTTTTC

CsCAS9F2(SEQIDNO.14)：ACAGAGATCACTCTGGCCAATG

CsCAS9R2(SEQIDNO.15)：AGCTGAGACAGGTCGATGCG

本發(fā)明取得了如下有益效果：

1.現(xiàn)有技術(shù)是以大麻種子萌發(fā)后的子葉為侵染對(duì)象，大麻子葉脫分化后能夠再分化成幼芽的比例極低，且農(nóng)桿菌侵染過程本身會(huì)進(jìn)一步抑制外植體再分化。因此，現(xiàn)有技術(shù)獲得陽性植株的產(chǎn)率極低。本發(fā)明涉及的技術(shù)以在雌性大麻植株開花后30天左右，未成熟種子的胚芽作為外植體材料，且在農(nóng)桿菌侵染前進(jìn)行特殊預(yù)培養(yǎng)處理，極大增加陽性率，通過對(duì)大麻品種DMG278進(jìn)行試驗(yàn)后，現(xiàn)有技術(shù)的陽性率為14.85％。

2.現(xiàn)有技術(shù)只能進(jìn)行大麻瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌侵染大麻子葉后，只有再生幼芽的部分器官中可以檢測(cè)到外源基因的瞬時(shí)表達(dá)，并未獲得可以穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明涉及的技術(shù)提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效且穩(wěn)定的大麻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建方法。

通過使用ARF19pro驅(qū)動(dòng)生長調(diào)節(jié)基因CsWIND2和CsARR5的編碼核酸序列的基因編輯表達(dá)構(gòu)建載體，對(duì)類胡蘿卜素脫飽和酶基因(CsPDS1)進(jìn)行堿基敲除，獲得基因編輯植株以及穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株?，F(xiàn)有技術(shù)并不能夠進(jìn)行基因編輯以及產(chǎn)生穩(wěn)定可遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。[0124]3.受遺傳背景影響，不同品種大麻幼胚胚芽的芽再生效率差異很大。為了提高轉(zhuǎn)化成功率，申請(qǐng)人對(duì)國家麻類種質(zhì)資源中期庫中45個(gè)大麻品種的幼胚胚芽的平均芽再生效率進(jìn)行評(píng)估，篩選出最適合進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染的品種2個(gè)：DMG278(芽誘導(dǎo)率18.26％)和YUNMA7(芽誘導(dǎo)率14.71％)。這兩個(gè)品種均可以作為本申請(qǐng)中涉及的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的模式品種。

4.愈傷組織能否正常生長是決定農(nóng)桿菌侵染后芽誘導(dǎo)率的關(guān)鍵因素。大麻侵染后的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植物激素的組成和濃度對(duì)于愈傷組織誘導(dǎo)效率影響很大。為了促進(jìn)大麻幼胚胚芽愈傷組織生長，申請(qǐng)人對(duì)于植物外植體組培過程中常用的4種植物激素噻重氮苯基脲(TDZ)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)和引哚乙酸(IAA)的誘導(dǎo)效率進(jìn)行研究，摸索出最適合大麻的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，解決了愈傷組織生長較慢影響轉(zhuǎn)基因效率的問題。

如無特殊說明，本發(fā)明提供的提供基于生長素調(diào)節(jié)因子組合的大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1大麻外植體選擇對(duì)芽再生發(fā)生的影響

為了評(píng)估不同外植體類型的再生效率，申請(qǐng)人對(duì)工業(yè)大麻品種YUNMA7的種子進(jìn)行了表面消毒處理，并在Murashige&Skoog(MS)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。大約17天后，從這些幼苗上收集了真葉、子葉和胚芽。此外，從YUNMA7植株授粉后的10天、15天、30天和35天收集了未成熟種子胚的胚芽。所有外植體都在CIM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。與早期或晚期收集的愈傷組織相比，在開花后30天(D30)胚芽產(chǎn)生的愈傷組織最多(平均為25.71％)(表1)。在為期4周的愈傷組織誘導(dǎo)過程中，申請(qǐng)人觀察到真葉誘導(dǎo)率只有10.18％，子葉中為12.62％，胚芽中為11.81%(表1)。再經(jīng)過額外的2周，增殖組織被轉(zhuǎn)移到連續(xù)光照下的26℃再生培養(yǎng)基中(50μMm^-2s^-1)，為期5周。D30胚胚芽的約14.71％形成了芽(圖1)，而其他三種外植體的愈傷組織中芽再生率最高的真葉為5.31％，遠(yuǎn)低于未成熟種子中胚芽的再生效率(表1)。

表1YUNMA7不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率及芽再生率

  

注：愈傷組織誘導(dǎo)率及芽再生率以百分比的形式表示；不同字母(a，b或c)用來標(biāo)明差異顯著(p<0.05)。

實(shí)施例2生長調(diào)節(jié)基因CsWIND3、CsBBM、CsAGL15、CsWIND2、CsARR5及其組合對(duì)大麻遺傳轉(zhuǎn)化效率的提高

為了增強(qiáng)和加速芽形成，我們通過表達(dá)對(duì)誘導(dǎo)芽器官具有積極影響的生長調(diào)節(jié)基因來重新編程植物分生組織的分化過程。為了比較它們對(duì)再生效率的影響，申請(qǐng)人從YUNMA7品種中擴(kuò)增了CsWIND3、CsBBM、CsAGL15、CsWIND2和CsARR5的編碼區(qū)域。我們?cè)O(shè)計(jì)了8種組合，將它們的cDNA片段克隆到pKSE401載體中，使用生長素響應(yīng)因子ARF19的啟動(dòng)子ARF19pro驅(qū)動(dòng)其表達(dá)，并分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株AGL1中。從DMG278的未成熟顆粒中分離的D30胚芽被農(nóng)桿菌AGL1(北京華越洋生物技術(shù)有限公司，GX9131?100)接種40分鐘，倒掉菌液，用滅菌后的濾紙吸干殘余菌液，吹10分鐘使表面稍為干燥。將胚芽分散布于墊有濾紙的MS固體培養(yǎng)基中，保證每段胚芽均接觸到濾紙，進(jìn)行暗培養(yǎng)(23℃)72小時(shí)。然后轉(zhuǎn)移到含有100mg/L卡那霉素的R0培養(yǎng)基中。確保根部插入培養(yǎng)基中，每盤50個(gè)，35℃,50μmol·m?2·s?1光密度，16h小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)3天。溫度調(diào)回25℃,再放4天。CsWIND2–CsARR5共表達(dá)組合和四種攜帶CsWIND3的共表達(dá)組合的平均再生效率比空載體對(duì)照高1.7倍(表2)。與對(duì)照相比，單獨(dú)的CsBBM、CsAGL15及其共表達(dá)組合的平均再生效率并未顯著促進(jìn)芽再生。在所有生長調(diào)節(jié)基因組合中，CsWIND2–CsARR5共表達(dá)組合的表現(xiàn)最佳，再生效率為18％，高于對(duì)照的9％。

表2生長調(diào)節(jié)基因?qū)ε哐吭偕l率的影響

  

注：箱形圖顯示含有不同生長調(diào)節(jié)基因共表達(dá)組合的pKSE401載體以及對(duì)照(空pKSE401載體)的芽再生頻率，不同字母(a，b或c)用來標(biāo)明差異顯著(p<0.05)。

實(shí)施例3攜帶CsWIND2?CsARR5共表達(dá)組合的基因編輯載體對(duì)大麻基因成功編輯并獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株

在所有生長調(diào)節(jié)基因組合中，CsWIND2–CsARR5共表達(dá)組合誘導(dǎo)愈傷組織芽再生的表現(xiàn)最佳，再生效率為18％，高于對(duì)照的9％。因此，將它們的cDNA片段克隆到pKSE401載體中，使用生長素響應(yīng)因子ARF19的啟動(dòng)子ARF19pro驅(qū)動(dòng)其表達(dá)，并分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株AGL1中，用于靶向類胡蘿卜素脫飽和酶基因(CsPDS1)基因編碼區(qū)的gRNA(SEQIDNO.16：GCGAAATACTTGGCAGATGC)構(gòu)建裝配，對(duì)進(jìn)行該基因進(jìn)行堿基敲除，獲得基因編輯植株以及穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。申請(qǐng)人分離了大約560個(gè)胚芽。在R0培養(yǎng)基中孵育4周后，總共有144個(gè)未成熟胚芽發(fā)育出胚性愈傷組織。然后將這些愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有50mg/L卡那霉素的R0培養(yǎng)基中。在連續(xù)光下孵育5周后，總共有101個(gè)愈傷組織發(fā)育出芽，胚性愈傷組織再生效率為18％。在這些芽中，86個(gè)具有帶有綠葉的嵌合組織芽顯示出白色和發(fā)育異常。只有15個(gè)愈傷組織產(chǎn)生了白色苗，占生成的芽的約14.85％。由于CsPDS1失活，所有這些芽都沒有形成完整的植物，且表現(xiàn)為葉綠素不足，生長受到抑制(圖2A、B和C)。從這4個(gè)白色芽和其他嵌合體芽中提取了DNA后，通過測(cè)序以識(shí)別在靶向區(qū)域內(nèi)的任何插入或缺失。在樣本中觀察到5種缺失突變的產(chǎn)生(長度從3bp到6bp)，這些缺失突變導(dǎo)致了CsPDS1的移碼突變(圖2D和E)。

申請(qǐng)人將攜帶CsWIND2–CsARR5共表達(dá)組合的基因編輯空載體通過農(nóng)桿菌侵染的方法獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。在孵育6周后，從每個(gè)再生的芽中取樣第一片完全展開的葉子，并使用特定于引物(AtU6-F1/R1)進(jìn)行鑒定。最終，我們獲得了一個(gè)攜帶基因編輯載體片段(T-DNA)的轉(zhuǎn)基因幼苗，并將其命名為W25-1。為了繁殖更多幼苗并確認(rèn)pW25sgT-DNA是否已經(jīng)穩(wěn)定地插入W25-1的基因組中，將W25-1莖切成塊并在含有卡那霉素的再生培養(yǎng)基中孵育6周。從W25-1的莖外植體中出了5個(gè)芽(圖3A)，這些芽被轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)根生的培養(yǎng)基，然后被種植在土壤條件下。每隔三周對(duì)第一片完全展開的葉子進(jìn)行取樣并鑒定T-DNA是否存在(圖3B)。根據(jù)PCR結(jié)果鑒定得出，從W25-1中繁殖的5個(gè)植株內(nèi)的T-DNA片段已經(jīng)穩(wěn)定插入基因組，可被確認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植株(圖3C和D)。陽性對(duì)照為攜帶CsWIND2–CsARR5共表達(dá)組合的基因編輯空載體，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因DMG278植株葉片提取DNA。

實(shí)施例4從不同大麻品種的幼胚胚芽中篩選出最適合進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染的品種

受遺傳背景影響，不同品種大麻幼胚胚芽的芽再生效率差異很大。為了提高轉(zhuǎn)化成功率，申請(qǐng)人對(duì)國家麻類種質(zhì)資源中期庫中45個(gè)大麻品種的幼胚胚芽的平均芽再生效率進(jìn)行評(píng)估，篩選出最適合進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染的品種。經(jīng)消毒后，這45個(gè)大麻品種的幼胚胚芽被切下后進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染處理，在R0培養(yǎng)基中培養(yǎng)以估算其再生能力。在本研究中，DMG278可達(dá)到18.26％；YUNMA7平均芽誘導(dǎo)率可達(dá)14.71％。兩個(gè)品種的誘導(dǎo)率差異并不顯著，因此這兩個(gè)品種均可以作為本申請(qǐng)中涉及的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的模式品種(圖4)。DMG278是由RedCherryBerry和YUNMA7雜交培育的F2代品系。RedCherryBerry是一種以Skunk#1和CaliforniaIndica產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)雜交品種。YUNMA7是中國的商業(yè)大麻品種。所有品種均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所國家麻類種質(zhì)資源中期庫。

實(shí)施例5大麻侵染后的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植物激素的組成和濃度的篩選

大麻侵染后的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植物激素的組成和濃度對(duì)于愈傷組織誘導(dǎo)效率影響很大。為了促進(jìn)大麻幼胚胚芽愈傷組織生長，申請(qǐng)人對(duì)于植物外植體組培過程中常用的4種植物激素噻重氮苯基脲(TDZ)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)和引哚乙酸(IAA)的誘導(dǎo)效率進(jìn)行研究，摸索出最適合大麻的R0培養(yǎng)基配方，解決了愈傷組織生長較慢影響轉(zhuǎn)基因效率的問題(表3)。

表3不同植物激素組合對(duì)于大麻幼胚胚芽愈傷組織誘導(dǎo)效率

  

  

注：*代表該組合促進(jìn)愈傷組織生長效果最明顯(P＜0.05)。

實(shí)施例6培養(yǎng)基的制備

本申請(qǐng)中涉及的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麻轉(zhuǎn)基因方法的培養(yǎng)基配方及其方法。

(1)CIMmedium(1L)

  

pH調(diào)制5.6,121℃滅菌30分鐘。

(2)R0(1L)

  

pH調(diào)制5.6,121℃滅菌30分鐘。

(3)R1(1L)

  

pH調(diào)制5.6，121℃滅菌30分鐘。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

 

 

文章摘自國家發(fā)明專利：基于生長素調(diào)節(jié)因子組合的大麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，發(fā)明人：張小雨，劉永蓓，程超華，粟建光，唐蜻，戴志剛，楊澤茂，陳基權(quán)，鄧燦輝，申請(qǐng)號(hào)：202311769311.X，申請(qǐng)日：2023.12.21