摘  要：本發(fā)明提供了一種亞麻LuNAC73基因及其應(yīng)用。所述亞麻LuNAC73基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得LuNAC73基因沉默亞麻株系TRV1:TRV2?LuNAC73（SE）。在SE中，纖維素、半纖維素及木質(zhì)素合成均受到抑制。LuNAC73基因?qū)喡槔w維素、半纖維素及木質(zhì)素的合成均有調(diào)控作用，是亞麻纖維發(fā)育的重要調(diào)控基因，在纖維侵入性伸長和次生壁增厚過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用，該基因的發(fā)現(xiàn)為改良亞麻纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的分子育種提供了重要基因資源。

權(quán)利要求

1.一種調(diào)控亞麻纖維發(fā)育的LuNAC73基因，其特征在于：所述LuNAC73基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如權(quán)利要求1所述的LuNAC73基因在調(diào)控亞麻纖維發(fā)育中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述調(diào)控亞麻纖維發(fā)育包括如下一種或多種：

1）通過將亞麻中的LuNAC73基因沉默來降低亞麻纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量；

2）通過將亞麻中的LuNAC73基因沉默來改變亞麻纖維侵入性伸長生長相關(guān)基因表達(dá)水平；

3）通過將亞麻中的LuNAC73基因沉默來改變亞麻次生壁合成相關(guān)基因表達(dá)水平。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述將亞麻中的LuNAC73基因沉默的方法為：在亞麻LuNAC73基因的序列中選取一段靶序列，利用上游引物LuNAC73F(XbaI)和下游引物LuNAC73R(BamHI)克隆靶序列，通過酶切法將靶序列與pTRV2載體連接，構(gòu)建VIGS重組載體，將VIGS重組載體導(dǎo)入亞麻植株，從而將亞麻中的LuNAC73基因沉默；

其中，所述靶序列如SEQ ID NO.5所示；

所述上游引物LuNAC73F(XbaI)和下游引物LuNAC73R(BamHI)序列為：

LuNAC73F(XbaI)：5’-TCTAGAGAGAAGACCAATTGGGTG-3’，

LuNAC73R(BamHI)：5’-GGATCCCTTCAGTTCCTTTGATGAT-3’。

5.如權(quán)利要求1所述的LuNAC73基因在亞麻分子育種中的應(yīng)用。

6.一種調(diào)控亞麻纖維發(fā)育的方法，其特征在于：所述方法包括將亞麻中的LuNAC73基因沉默，所述LuNAC73基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述調(diào)控亞麻纖維發(fā)育包括如下一種或多種：

1）降低亞麻纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量；

2）改變亞麻纖維侵入性伸長生長相關(guān)基因表達(dá)水平；

3）改變亞麻次生壁合成相關(guān)基因表達(dá)水平。

說明書

亞麻LuNAC73基因及其在調(diào)控亞麻纖維發(fā)育中的應(yīng)用

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及亞麻LuNAC73基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

在高等植物發(fā)育中，細(xì)胞體積的增加可以通過三種主要方式進(jìn)行；協(xié)同生長、突出生長和侵入生長。協(xié)同生長是最常見的類型，通常表現(xiàn)在伸長區(qū)。突出生長只發(fā)生在表皮層，并導(dǎo)致毛狀體的形成，如根毛或棉花種子纖維的形成。第三種類型是侵入性生長，纖維形成屬于此類型。纖維束在植物器官內(nèi)的發(fā)育主要是單個(gè)纖維的侵入性伸長生長。在侵入性伸長生長過程中，纖維必須完成的關(guān)鍵過程包括：1.通過合成和分泌細(xì)胞壁聚合物和松弛細(xì)胞壁擴(kuò)大細(xì)胞壁；2.通過吸水、滲透物積累及膜成分合成增加液泡體積。纖維侵入性伸長生長對(duì)植物結(jié)構(gòu)的形成具有重要意義。亞麻是我國重要的纖維作物。亞麻初生韌皮部纖維起源于原形成層，靠近頂端分生組織，在發(fā)育的最初階段，它們與周圍組織協(xié)同生長。侵入性伸長生長開始于距莖尖1-2mm處，并在莖下持續(xù)數(shù)厘米，直到“snappoint”點(diǎn)，此位點(diǎn)向下纖維向細(xì)胞壁增厚轉(zhuǎn)變。纖維細(xì)胞伸長影響纖維產(chǎn)量，次生壁增厚影響纖維品質(zhì)，鑒定和利用纖維伸長、次生壁增厚相關(guān)基因?qū)τ诮馕鰜喡槔w維發(fā)育的分子機(jī)理以及提高纖維產(chǎn)量、品質(zhì)具有重要的理論和實(shí)踐意義。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種調(diào)控亞麻纖維發(fā)育的LuNAC73基因，所述LuNAC73基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

上述一種LuNAC73基因在調(diào)控亞麻纖維發(fā)育中的應(yīng)用，所述調(diào)控亞麻纖維發(fā)育包括如下一種或多種：

1)通過將亞麻中的LuNAC73基因沉默來降低亞麻纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量；

2)通過將亞麻中的LuNAC73基因沉默來改變亞麻纖維侵入性伸長生長相關(guān)基因表達(dá)水平；3)通過將亞麻中的LuNAC73基因沉默來改變亞麻次生壁合成相關(guān)基因表達(dá)水平。

上述將亞麻中的LuNAC73基因沉默的方法為：在亞麻LuNAC73基因的序列中選取一段靶序列，利用上游引物LuNAC73F(XbaI)和下游引物LuNAC73R(BamHI)克隆靶序列，通過酶切法將靶序列與pTRV2載體連接，構(gòu)建VIGS重組載體，將VIGS重組載體導(dǎo)入亞麻植株，從而將亞麻中的LuNAC73基因沉默；

其中，所述靶序列如SEQ ID NO.5所示；

上游引物LuNAC73F(XbaI)和下游引物LuNAC73R(BamHI)序列為：

LuNAC73F(XbaI)：5’-TCTAGAGAGAAGACCAATTGGGTG-3’，

LuNAC73R(BamHI)：5’-GGATCCCTTCAGTTCCTTTGATGAT-3’。

上述一種LuNAC73基因在亞麻分子育種中的應(yīng)用。

一種調(diào)控亞麻纖維發(fā)育的方法，所述方法包括將亞麻中的LuNAC73基因沉默，所述LuNAC73基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述調(diào)控亞麻纖維發(fā)育包括如下一種或多種：

1)降低亞麻纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量；

2)改變亞麻纖維侵入性伸長生長相關(guān)基因表達(dá)水平；

3)改變亞麻次生壁合成相關(guān)基因表達(dá)水平。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：

本研究利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)技術(shù)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得LuNAC73基因沉默的亞麻株系TRV1:TRV2-LuNAC73(SE)。在SE中，纖維素、半纖維素及木質(zhì)素合成均受到抑制，與TRV1:TRV2對(duì)照植株(CK)相比纖維素含量降低了5.78％(p<0.05)，半纖維素含量降低了5.76％(p<0.05)，木質(zhì)素含量降低了7.49％(p<0.05)。結(jié)果表明，LuNAC73基因?qū)w維素、半纖維素及木質(zhì)素的合成均有調(diào)控作用。通過RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)，與CK相比，在SE中LuNAC73基因表達(dá)量下降了36.69％，多個(gè)與侵入性伸長生長相關(guān)基因的表達(dá)被顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)(|Log2Foldchange|>1，p.adj<0.05)，同時(shí)在SE中與次生壁合成相關(guān)的纖維素合酶LuCesA4、LuCesA8及LuMyb46、LuMyb83、LuNST1、LuNST3、LuSND1等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達(dá)量均顯著下調(diào)(p<0.05)。上述結(jié)果表明：LuNAC73(Lus10013967)是亞麻纖維發(fā)育的重要調(diào)控基因，在纖維侵入性伸長和次生壁增厚過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用，該基因的發(fā)現(xiàn)為改良亞麻纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的分子育種提供了重要基因資源。

附圖說明

圖1：亞麻LuNAC73基因沉默植株表型分析。A，WT(未侵染)；B：pTRV1:pTRV2-PDS漂白表型；C：pTRV1:pTRV2；D：pTRV1:pTRV2-NAC73。

  

圖2：亞麻LuNAC73基因沉默植株化學(xué)組分分析。

  

圖3：亞麻LuNAC73基因沉默植株基因表達(dá)分析。

  

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。

本發(fā)明中所述亞麻LuNAC73(Lu10013967)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述亞麻八氫番茄紅素脫氫酶LuPDS(Lus10021967)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

本發(fā)明中所用農(nóng)桿菌為GV3101。

實(shí)施例1：

根據(jù)Phytozome公共數(shù)據(jù)庫中亞麻LuNAC73(Lu10013967)基因序列設(shè)計(jì)上下游引物LuNAC73F(XbaI)和LuNAC73R(BamHI)，以亞麻cDNA為模板克隆亞麻LuNAC73基因的靶序列(390bp，如SEQ ID NO.5所示)，將該靶序列片段插入pTRV2載體的多克隆位點(diǎn)5’-XbaI-BamHI-3’之間，構(gòu)建VIGS沉默載體pTRV2-NAC73。根據(jù)亞麻八氫番茄紅素脫氫酶LuPDS(Lus10021967)基因序列設(shè)計(jì)上下游引物LuPDSF和LuPDSR，以亞麻cDNA為模板克隆亞麻LuPDS基因的靶序列(437bp，如SEQ ID NO.6所示)，將該靶序列片段插入pTRV2載體的多克隆位點(diǎn)5’-XbaI-BamHI-3’之間，構(gòu)建VIGS沉默載體pTRV2-PDS。

將“大紫花”亞麻種子均勻種于營養(yǎng)土中，放置于光照培養(yǎng)箱中，23℃、16h光照，18℃、8h黑暗培養(yǎng)。正常培養(yǎng)10天左右，幼苗長出2片子葉，且子葉展開時(shí)進(jìn)行VIGS試驗(yàn)。VIGS試驗(yàn)方法參照參考文獻(xiàn)Chantreau M,Chabbert B,Billiard S,Hawkins S,NeutelingsG.Functional analyses of cellulose synthase genes in flax(Linumusitatissimum)by virus-induced gene silencing[J].Plant Biotechnol J,2015,13(9):1312-1324進(jìn)行。侵染前提前2天準(zhǔn)備菌液。將保存在-80℃農(nóng)桿菌菌株pTRV1(檢測(cè)引物pTRV1F/pTRV1R)、pTRV2(檢測(cè)引物pTRV2F/pTRV2R)、pTRV2-PDS、pTRV2-NAC73菌液PCR檢測(cè)，檢測(cè)載體序列正確的菌株在YEB固定培養(yǎng)基(10mg/LKan+50mg/LRif)28℃劃線培養(yǎng)2d，然后挑單菌落加1ml YEB液體培養(yǎng)基28℃、200rpm過夜培養(yǎng)，將菌液加入25ml無抗生素YEB液體培養(yǎng)基中28℃、200rpm擴(kuò)大培養(yǎng)16h，將菌液收集于50ml離心管中，7000rpm離心5min，棄上清液，用新鮮YEB液體培養(yǎng)基(10mM MgCl2+10mM MES+150uM AS)重懸菌體使OD值達(dá)到0.6～1.2之間。菌液室溫靜置3h或者28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1h；然后將pTRV1菌液分別與pTRV2菌液、pTRV2-PDS菌液、pTRV2-NAC73菌液等體積混合；選擇子葉背面用1ml注射器針頭扎三個(gè)針眼，注意不要扎透子葉，然后用去掉針頭的注射器向葉片背面的針眼里推菌液，注意不要過于用力，菌液不易過多，否則苗后期會(huì)死亡。侵染后黑暗培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行正常光照培養(yǎng)(光照16h，黑暗8h)。

表1引物序列

 

 

選擇SEQ ID NO.5所示的序列作為靶標(biāo)序列，采用VIGS技術(shù)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得LuNAC73(Lu10013967)基因沉默亞麻植株。植株的表型如圖1所示，侵染的植株與未侵染的植株相比葉片較多。以pTRV1:pTRV2-PDS侵染植株作為指示植株，白化現(xiàn)象表明重組質(zhì)粒在植物體內(nèi)表達(dá)，莖部白化表型主要出現(xiàn)在子葉以上的第一對(duì)真葉與第二對(duì)真葉之間；pTRV1:pTRV2對(duì)照與pTRV1:pTRV2-NAC73沉默植株(SE)相比表型上無明顯差異。

實(shí)施例2：

pTRV1:pTRV2、pTRV1:pTRV2-NAC73沉默植株分別取30株，每10株混合做為1次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。選擇長勢(shì)一致的植株，取材部位為子葉以上第1對(duì)與第2對(duì)真葉之間的莖段。采用ELISA含量檢測(cè)試劑盒(齊一，上海)檢測(cè)樣品中的纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量。

細(xì)胞壁化學(xué)組分檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，在LuNAC73基因沉默植株SE中纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的合成均受到抑制。在SE中，纖維素含量為293.2mg/g(DW)，與對(duì)照相比降低了5.78％(p<0.05)；半纖維素含量為209.85mg/g(DW)，與對(duì)照相比降低了5.76％(p<0.05)；木質(zhì)素含量為136.89mg/g(DW)，與對(duì)照相比降低了7.49％(p<0.05)。結(jié)果表明，LuNAC73基因?qū)w維素、半纖維素及木質(zhì)素的合成都有調(diào)控作用。

實(shí)施例3：

pTRV1:pTRV2、pTRV1:pTRV2-NAC73沉默的植株分別取3株，做為3次生物學(xué)重復(fù)。選擇長勢(shì)一致的植株取材，取材部位為子葉以上第1對(duì)與第2對(duì)真葉之間的莖段。將植物樣本放入研缽中，加入液氮，迅速研磨成粉末。采用CTAB法提取植物總RNA，使用DNase I去除基因組DNA污染。通過1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析由華大基因科技有限公司完成。

利用RNA-Seq技術(shù)檢測(cè)pTRV1:pTRV2對(duì)照植株(CK)與pTRV1:pTRV2-NAC73沉默植株(SE)的差異表達(dá)基因。在SE沉默株中，靶基因LuNAC73基因(lus10013967)的表達(dá)量與對(duì)照相比下降了36.69％(p<0.05)(圖3)，多個(gè)與侵入性伸長生長相關(guān)基因的表達(dá)被顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)(|Log2Foldchange|>1，p.adj<0.05)，這些基因涉及激素、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞壁修飾、次生代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等(表2)，同時(shí)，參與次生壁合成的纖維素合酶LuCesA4、LuCesA8、LuMyb46、LuMyb83、LuNST1、LuNST3、LuSND1等基因在SE中也被顯著下調(diào)表達(dá)(表3)。

表2LuNAC73(lus10013967)調(diào)控亞麻纖維侵入性伸長生長相關(guān)基因

 

 

表3LuNAC73(lus10013967)調(diào)控亞麻次生壁合成相關(guān)基因

  

綜上，本研究利用病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)的方法證明LuNAC73(lus10013967)基因是亞麻纖維發(fā)育中的重要調(diào)控基因，能夠調(diào)控纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的合成。轉(zhuǎn)錄組差異基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該基因參與纖維侵入性伸長生長的調(diào)控，同時(shí)也參與纖維次生壁合成的調(diào)控。該基因的發(fā)現(xiàn)為提高亞麻纖維產(chǎn)量和改良亞麻纖維品質(zhì)的分子育種提供了重要的基因資源。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

 

摘自國家發(fā)明專利，發(fā)明人：袁紅梅 郭文棟 劉丹丹 唐立酈 姚玉波 程莉莉 楊洌 吳廣文 康慶華 宋喜霞，申請(qǐng)?zhí)枺?/font>CN202311771569.3，申請(qǐng)日：2023.12.21