摘  要：本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域，公開一種甘露聚糖酶及其在苧麻脫膠中的應(yīng)用。本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備具有活性的甘露聚糖酶ManB085，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，通過(guò)將甘露聚糖酶ManB085截去301～464位氨基酸殘基得到突變型甘露聚糖酶ManB085M，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明的甘露聚糖酶屬于嗜熱耐堿酶，其最適溫度為75℃，最適pH為10，并且能夠在pH 7～12范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。在70℃，pH 10熱堿條件下，本發(fā)明的甘露聚糖酶的半衰期是其對(duì)應(yīng)的野生型甘露聚糖酶的3.9倍，因此其在苧麻脫膠工藝中具有更佳的應(yīng)用價(jià)值，為苧麻脫膠復(fù)合酶制劑提供了一種新選擇。

權(quán)利要求

1.一種甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列SEQ ID NO:2所示。

2.編碼權(quán)利要求1所述甘露聚糖酶的基因。

3.如權(quán)利要求2所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列SEQ ID NO:4所示。

4.一種包含如權(quán)利要求2所述基因的重組表達(dá)載體或重組表達(dá)菌株。

5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體或重組表達(dá)菌株，其特征在于，所述重組表達(dá)載體的表達(dá)載體包括以pET28a。

6.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體或重組表達(dá)菌株，其特征在于，所述重組表達(dá)菌株的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌BL21(ED3)。

7.如權(quán)利要求1所述甘露聚糖酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：構(gòu)建權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，獲得重組表達(dá)菌株，對(duì)所述重組表達(dá)菌株進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化，得到所述甘露聚糖酶。

8.如權(quán)利要求7所述制備方法，其特征在于，所述構(gòu)建重組表達(dá)載體包括如下步驟：

(1)篩選得到氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的甘露聚糖酶，合成對(duì)應(yīng)的核苷酸序列并連接至表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(2)以所述重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)突變引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ManB085M基因和pET-28a(+)骨架，對(duì)所述骨架進(jìn)行DpnI酶切，將酶切后的骨架與ManB085M基因進(jìn)行同源重組獲得所述重組表達(dá)載體；

所述突變引物的引物序列序列如下：

ManB085M-F：5’-AGCAAATGGGTCGCGGATCCCAGACCCATAGCGGCTTTTA-3’；

ManB085M-R：5’-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATGAAAAATGCTGCTCGGAA-3’；

pET-28a(+)-F：5’-CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTA-3’；

pET-28a(+)-R：5’-GCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGG-3’。

9.如權(quán)利要求1至8任一所述甘露聚糖酶在苧麻脫膠中的應(yīng)用。

10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述甘露聚糖酶用于苧麻脫膠的溫度為60～80℃，pH為7～12。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶工程技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種甘露聚糖酶及其在苧麻脫膠中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

苧麻纖維的成分被劃分為纖維素和非纖維素，苧麻纖維是紡織行業(yè)的重要原料，苧麻中的非纖維素成分被稱為苧麻中的膠質(zhì)，苧麻纖維素在原麻中與苧麻中的膠質(zhì)粘連在一起，膠質(zhì)殘留會(huì)直接影響苧麻纖維的品質(zhì)，如纖維粘結(jié)、纖維束分離性較差、手感糙澀，因此苧麻纖維投入紡織前的重要步驟之一就是脫膠，而傳統(tǒng)的脫膠需要高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等條件，不僅使得纖維遭到損壞，也對(duì)環(huán)境造成了極大的污染。

苧麻中的非纖維素包括脂蠟質(zhì)、水溶物、果膠、半纖維素、木質(zhì)素等，其中半纖維素含量最高。并且苧麻韌皮中的半纖維素主要包括半乳葡甘露聚糖、葡甘露聚糖和木聚糖，占比分別為45.5％、23.2％、8.4％。甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是分解甘露聚糖的關(guān)鍵酶之一，通過(guò)隨機(jī)切割甘露聚糖主鏈的β-1，4糖苷鍵將甘露聚糖分解成葡萄糖、甘露寡糖等低聚糖。甘露聚糖酶與果膠酶、木聚糖酶等聯(lián)合使用可以去除苧麻中的膠質(zhì)，對(duì)苧麻纖維的損害小，有利于提高苧麻織品的品質(zhì)，減少?gòu)U水排放，降低對(duì)環(huán)境的污染。

紡織工藝流程大都是在高溫強(qiáng)堿的環(huán)境下進(jìn)行，因此需要嗜熱耐堿的甘露聚糖酶，但目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)售賣甘露聚糖酶多為飼料用甘露聚糖酶，而紡織用甘露聚糖酶種類少且紡織用工業(yè)甘露聚糖酶有效pH大多在酸性范圍內(nèi)，例如夏盛工業(yè)級(jí)甘露聚糖酶的有效溫度范圍為30～70℃、有效pH為3.0～6.5，滿足不了苧麻脫膠高溫強(qiáng)堿的環(huán)境。嗜熱耐堿的甘露聚糖酶因其在極端堿性和高溫條件下具有優(yōu)良的性質(zhì)和重要的工業(yè)應(yīng)用備受關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明通過(guò)酶挖掘與改造技術(shù)獲得一種嗜熱耐堿的甘露聚糖酶，并將其用于苧麻脫膠工業(yè)降解苧麻的甘露聚糖，為苧麻脫膠工業(yè)復(fù)配酶制劑需求提供一種新選擇。

本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發(fā)明提供的嗜熱耐堿的甘露聚糖酶，其最適溫度為75℃，最適pH為10，并且能夠在pH 7～12范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。在70℃，pH 10熱堿條件下，本發(fā)明的甘露聚糖酶的半衰期是其對(duì)應(yīng)的野生型甘露聚糖酶的3.9倍，其在苧麻脫膠工藝中具有更佳的應(yīng)用價(jià)值，為苧麻脫膠復(fù)合酶制劑提供了一種新的優(yōu)良的選擇。

進(jìn)一步，編碼所述甘露聚糖酶的基因。

進(jìn)一步，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

進(jìn)一步，包含所述基因的重組載體或重組菌株。

進(jìn)一步，所述重組載體的表達(dá)載體包括以pET28a。

進(jìn)一步，所述重組菌株的宿主包括大腸桿菌BL21(ED3)。

進(jìn)一步，所述甘露聚糖酶的制備方法包括如下步驟：構(gòu)建權(quán)利所述重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，獲得重組表達(dá)菌株，對(duì)所述重組表達(dá)菌株進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化，得到所述甘露聚糖酶。

進(jìn)一步，所述構(gòu)建重組表達(dá)載體包括如下步驟：

(1)篩選得到氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的甘露聚糖酶，合成對(duì)應(yīng)的核苷酸序列并連接至表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(2)以所述重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)突變引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ManB085M基因和pET-28a(+)骨架，對(duì)所述骨架進(jìn)行DpnI酶切，將酶切后的骨架與ManB085M基因進(jìn)行同源重組獲得所述重組表達(dá)載體；

所述突變引物的引物序列序列如下：

ManB085M-F：5’-AGCAAATGGGTCGCGGATCCCAGACCCATAGCGGCTTTTA-3’；

ManB085M-R：5’-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATGAAAAATGCTGCTCGGAA-3’；

pET-28a(+)-F：5’-CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTA-3’；

pET-28a(+)-R：5’-GCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGG-3’。

本發(fā)明還提供所述甘露聚糖酶在苧麻脫膠中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述甘露聚糖酶用于苧麻脫膠的溫度為60～80℃，pH為7～12。

說(shuō)明書附圖

圖1為本發(fā)明野生型甘露聚糖酶及突變型甘露聚糖酶的SDS-PAGE蛋白電泳圖，其中孔道1是蛋白Marker，孔道2是野生型甘露聚糖酶ManB085，孔道3是突變型甘露聚糖酶ManB085M。

  

圖2為本發(fā)明野生型及突變型甘露聚糖酶的最適pH曲線。

  

圖3為本發(fā)明野生型及突變型甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度曲線。

  

圖4為本發(fā)明野生型及突變型甘露聚糖酶的pH穩(wěn)定性曲線。

  

圖5為本發(fā)明野生型及突變型甘露聚糖酶在70℃下的半衰期曲線。

  

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。

為了獲得一種新的嗜熱耐堿的甘露聚糖酶，使其用于苧麻脫膠工業(yè)以降解苧麻中膠質(zhì)，為苧麻脫膠工業(yè)復(fù)合酶制劑需求提供一種選擇，發(fā)明人進(jìn)行了以下酶挖掘過(guò)程：

(1)通過(guò)文獻(xiàn)檢索篩選符合苧麻脫膠環(huán)境條件要求的酶，篩選出來(lái)源于Bacillussp.N16-5的β-甘露聚糖酶(ManA)，該酶的最適反應(yīng)溫度為70℃，最適pH為9.5，比酶活為5065U/mg。

(2)以β-甘露聚糖酶(ManA)為探針，通過(guò)序列同源性在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，篩選相似性在40％～80％的氨基酸序列，通過(guò)分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析對(duì)上述序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

(3)對(duì)探針酶所在分支及其附近分支進(jìn)行家族結(jié)構(gòu)域劃分，在與探針酶同一家族結(jié)構(gòu)域的酶中篩選候選氨基酸序列。

(4)選擇距離探針酶最近的氨基酸序列，制備所述氨基酸序列對(duì)應(yīng)的酶并分析其酶學(xué)性質(zhì)，從中篩選能夠分解甘露聚糖的嗜熱耐堿的酶，獲得了氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型甘露聚糖酶(ManB085)，目前還未有將其應(yīng)用于苧麻脫膠或降解甘露聚糖的研究報(bào)道。

其中，所述氨基酸序列對(duì)應(yīng)的酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì)分析過(guò)程如下：

(1)根據(jù)所述氨基酸序列，合成對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，將所述核苷酸序列連接至表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，獲得重組菌株；

(2)對(duì)步驟(1)獲得的重組菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；

(3)離心收集步驟(2)的菌體沉淀，并進(jìn)行洗滌、超聲破碎，離心收集上清液，利用Ni-NTA親和層析柱獲得純度較高的重組蛋白。

(4)檢測(cè)步驟(3)獲得的重組蛋白分解甘露聚糖酶的酶活、最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定性和半衰期，篩選嗜熱耐堿的重組蛋白。

然后，發(fā)明人基于半理性設(shè)計(jì)對(duì)上述野生型甘露聚糖酶進(jìn)行改造，提升該酶的酶學(xué)性質(zhì)使改造后的酶能夠在高溫強(qiáng)堿的環(huán)境下除去苧麻韌皮中的膠質(zhì)，改造的具體步驟如下：

(1)通過(guò)alphafold2對(duì)野生型甘露聚糖酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并在UCLA-DOE LAB網(wǎng)站對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)，得到可靠的結(jié)構(gòu)模型。

(2)在300K和350K的耦合溫度下對(duì)野生型甘露聚糖酶進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)甘露聚糖酶的均方根波動(dòng)值(RMSF)較高，且波動(dòng)最大的區(qū)域集中在甘露聚糖酶的非催化功能結(jié)構(gòu)(即ManB085的第301～464位氨基酸殘基)，RMSF值越高的區(qū)域柔性越大，而越高的柔性預(yù)示著越低的穩(wěn)定性。

(3)將野生型甘露聚糖酶RMSF值較高的非催化功能結(jié)構(gòu)截去，僅剩下具有催化功能的結(jié)構(gòu)域并對(duì)其重新建模，截短后的蛋白的結(jié)構(gòu)與野生型甘露聚糖酶的功能結(jié)構(gòu)域一致。

(4)在300K和350K的耦合溫度下，對(duì)截短后的蛋白進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)其RMSF比野生型甘露聚糖酶平緩，預(yù)示著截短后的蛋白可能有更強(qiáng)的剛性，代表著該蛋白的穩(wěn)定性可能會(huì)更高，合成所述截短后的蛋白獲得突變型甘露聚糖酶(ManB085M)。

基于上述理論分析，發(fā)明人根據(jù)探針酶篩選獲得了氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型甘露聚糖酶(ManB085)，然后以該野生型甘露聚糖酶為模板，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬獲得了可能提高該野生型甘露聚糖酶穩(wěn)定性的突變方式，即截去ManB085的第301～464位氨基酸殘基，突變后甘露聚糖酶(ManB085M)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其制備方法包括如下步驟：

(1)篩選得到氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型甘露聚糖酶ManB085，合成對(duì)應(yīng)的核苷酸序列并連接至表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(2)以步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)突變引物ManB085M-F、ManB085M-R、pET-28a(+)-F和pET-28a(+)-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ManB085M基因和pET-28a(+)骨架，對(duì)所述骨架進(jìn)行DpnI酶切，將酶切后的骨架與ManB085M基因進(jìn)行同源重組獲得所述重組表達(dá)載體；

(3)將步驟(2)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，獲得重組表達(dá)菌株；

(4)對(duì)步驟(3)獲得的重組菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，然后離心收集的菌體沉淀，并進(jìn)行洗滌、超聲破碎，離心收集上清液，利用Ni-NTA親和層析柱獲得純度較高的重組蛋白，即甘露聚糖酶ManB085M。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

本發(fā)明實(shí)施例中的全基因合成皆由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

本發(fā)明實(shí)施例所用試劑如下：

LB種子培養(yǎng)基：5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl。

TB發(fā)酵培養(yǎng)基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨，4mL/L甘油、125.4g/L K2HPO4、23.1g/L KH2PO4。

結(jié)合緩沖液(Buffer A)：100mM Hepes、50mM NaCl。

洗脫緩沖液(Buffer B)：100mM Hepes、50mM NaCl、300mM咪唑。

本發(fā)明實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特別說(shuō)明，為從商業(yè)途徑得到的材料和試劑。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法通常按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1：野生型甘露聚糖酶的制備

(1)重組表達(dá)載體pET28a-ManB085的構(gòu)建

通過(guò)NCBI獲得嗜熱耐堿的野生型甘露聚糖酶ManB085，其氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示。將ManB085進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列，全基因合成優(yōu)化后的核苷酸序列并亞克隆到大腸桿菌基因表達(dá)載體pET-28a(+)，得到重組表達(dá)載體pET28a-ManB085。

(2)菌落PCR鑒定和測(cè)序

將重組表達(dá)載體pET28a-ManB085轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布到含硫酸卡那霉素的平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)抗性篩選平板上的單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定確保外源DNA成功整合到表達(dá)宿主中。

(3)酶的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

挑選陽(yáng)性單菌落接種到LB種子培養(yǎng)基中，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液。將種子液接種到TB發(fā)酵培養(yǎng)基中并控制TB發(fā)酵培養(yǎng)基起始OD600為0.1，培養(yǎng)1.5h～2h(即OD600達(dá)到0.6～0.8)，加入終濃度為0.5mM的誘導(dǎo)劑IPTG，然后將培養(yǎng)基置于16℃，180rpm振蕩培養(yǎng)16h。發(fā)酵完成后，常溫6000rpm離心3min收集菌體，水洗滌后加入Buffer A進(jìn)行超聲破碎，破碎之后4℃、10000rpm離心30min收集上清。

收集到的上清用ATKA蛋白純化儀進(jìn)行鎳柱親和層析純化。利用10％的Buffer B將親和力較差的雜蛋白除去，用100％的Buffer B將獲得的野生型甘露聚糖酶ManB085洗脫，通過(guò)SDS-PAGE電泳分析洗脫液中目的蛋白的純度。

實(shí)施例2：突變型甘露聚糖酶的制備

(1)重組表達(dá)載體pET28a-ManB085M的構(gòu)建

以實(shí)施例1制得的pET28a-ManB085為模板，設(shè)計(jì)如表1所示引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增ManB085M基因和pET-28a(+)骨架，回收擴(kuò)增產(chǎn)物得到目的基因片段與pET-28a(+)骨架；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如表2所示，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：(1)94℃預(yù)變性2min；(2)98℃變性10s，55℃退火30s，68℃延伸；共進(jìn)行30次循環(huán)；(3)68℃復(fù)性7min，于16℃保溫。

表1引入突變的引物及其序列

  

將pET-28a(+)骨架用DpnI酶切，再使用同源重組酶將經(jīng)過(guò)酶切的骨架與目的基因片段進(jìn)行同源重組，獲得重組表達(dá)載體pET28a-ManB085M。所述酶切體系如表3所示，所述同源重組體系為：4μL目的基因、1μL pET-28a(+)骨架和5μL同源重組酶。

表2PCR反應(yīng)體系

 

表3酶切體系

  

(2)菌落PCR鑒定和測(cè)序

將重組表達(dá)載體pET28a-ManB085M轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布到含硫酸卡那霉素的平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)抗性篩選平板上的單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定確保外源DNA成功整合到表達(dá)宿主中。

(3)酶的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

挑選陽(yáng)性單菌落接種到LB種子培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液。將種子液接種到TB發(fā)酵培養(yǎng)基中并控制TB發(fā)酵培養(yǎng)基起始OD600為0.1，培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG并于16℃，180rpm振蕩培養(yǎng)16h。發(fā)酵完成后，常溫離心收集菌體，水洗滌后加入Buffer A進(jìn)行超聲破碎，破碎之后4℃離心收集上清。

收集的上清用ATKA蛋白純化儀進(jìn)行鎳柱親和層析純化。利用10％的Buffer B將親和力較差的雜蛋白除去，再用100％的Buffer B洗脫獲得目的蛋白并通過(guò)SDS-PAGE電泳分析洗脫液中目的蛋白的純度，目的蛋白即為突變型甘露聚糖酶ManB085M，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2，編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:4。

效果例1：野生型和突變型甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

(1)酶活力的測(cè)定

一個(gè)單位的甘露聚糖酶酶活(U)定義為：每分鐘水解甘露聚糖底物產(chǎn)生1μmol甘露糖所需要的甘露聚糖酶的量。

采用DNS法測(cè)定甘露聚糖酶的酶活，混合40μL適當(dāng)稀釋的酶液和160uL 0.2％底物(pH為10的50mM Gly-NaOH配制的魔芋甘露聚糖溶液)，在70℃反應(yīng)10min后，加入200μL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5min后將反應(yīng)液冷卻至室溫，并于540nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度?？瞻讓?duì)照組則加入40μL緩沖液，160μL 0.2％底物，70℃水浴反應(yīng)10min后，加入200μL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5min后將反應(yīng)液冷卻至室溫，于540nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用蒸餾水配制濃度為0、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取400uL不同濃度的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，最后加入400μL DNS溶液，混勻后煮沸5min，將反應(yīng)液冷卻至室溫測(cè)定其在540nm處的吸光度。

甘露聚糖酶酶活的計(jì)算公式如下：酶活(U/mg)＝(W*Df*1000)/(180.16*10*V*C)，其中，C(mg/mL)表示酶的濃度，W(mg)表示酶解產(chǎn)生的甘露糖質(zhì)量，Df表示稀釋倍數(shù)，180.16表示甘露糖的分子量，1000表示單位mmol轉(zhuǎn)變?yōu)?mu;mol的系數(shù)，10(min)表示酶解反應(yīng)的時(shí)間；V(mL)表示反應(yīng)時(shí)加入的酶液體積。

(2)最適pΗ的測(cè)定

分別用pH 8～12的緩沖液(Gly-NaOH緩沖液)配制0.2％底物，取160μL底物，加入40μL適當(dāng)稀釋的酶液于70℃反應(yīng)10min，測(cè)定甘露聚糖酶活性。以最適pH下的酶活為100％，計(jì)算各pH條件下甘露聚糖酶的相對(duì)酶活。

(3)最適溫度的測(cè)定

在最適pH條件下，將甘露聚糖酶與其底物混合，按步驟(1)所述反應(yīng)體系測(cè)定60℃～85℃范圍內(nèi)反應(yīng)10min后野生型和突變型甘露聚糖酶的酶活性，以最適溫度下的酶活為100％，計(jì)算不同溫度下甘露聚糖酶的相對(duì)酶活。

(4)pH穩(wěn)定性的測(cè)定

分別用pH 7～12的緩沖液配制酶液，并將酶液置于4℃下孵育過(guò)夜，按步驟(1)所述反應(yīng)體系，在最適反應(yīng)條件下測(cè)定甘露聚糖酶活性。以計(jì)算得到的最高酶活為100％，計(jì)算各pH條件下甘露聚糖酶的相對(duì)酶活。

(5)半衰期的測(cè)定

將適當(dāng)稀釋的酶液置于70℃的環(huán)境中，每隔15min檢測(cè)其相對(duì)酶活，以加熱前的酶活為100％，計(jì)算甘露聚糖酶孵育不同時(shí)間后的相對(duì)活性。

參與圖2～圖3，實(shí)施例1所制備的野生型甘露聚糖酶ManB085及突變型甘露聚糖酶ManB085M的最適pH為10，最適溫度為75℃。參閱圖4，野生型及突變型甘露聚糖酶在最適條件下測(cè)得的酶活分別為983U/mg、1176U/mg，且其在pH 7～12的緩沖液中過(guò)夜處理后酶活基本沒(méi)有下降，具有較強(qiáng)的pH穩(wěn)定性。參閱圖5，野生型甘露聚糖酶在70℃下孵育的半衰期為15min，而突變型甘露聚糖酶的半衰期為58min，因此，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的改造，突變型甘露聚糖酶在野生型甘露聚糖酶的基礎(chǔ)上顯著提升了酶在堿性條件下的熱穩(wěn)定性。

效果例2：野生型和突變型甘露聚糖酶的苧麻脫膠分析

參考GB 5889—88《苧麻化學(xué)成分定量分析方法》對(duì)原麻進(jìn)行成分定量分析，參考GB/T 18147.1—2008《大麻纖維試驗(yàn)方法第1部分：含油率測(cè)試方法》計(jì)算苧麻含油率后，按照以下方法進(jìn)行苧麻脫膠：

①將苧麻進(jìn)行機(jī)械碾壓直至苧麻柔軟松散。

②預(yù)處理：將5g苧麻浸漬在含5g/L尿素、3g/L滲透劑JFC-6的溶液中24h，固浴比為1：10。

③用水將麻清洗干凈之后，保持苧麻處于濕潤(rùn)狀態(tài)下進(jìn)行200次敲打。

④酶處理：固浴比1：10(50mM Gly-NaOH、1g/L JFC-6)，添加800U甘露聚糖酶與商品酶進(jìn)行復(fù)配，在60℃水浴16h進(jìn)行酶脫膠處理。酶脫膠中使用的商品酶為夏盛紡織用木聚糖酶和諾維信復(fù)合精煉酶(主要成分為果膠酶)，添加量分別為800U、3800U。

⑤堿氧處理：將苧麻浸漬在含6mL/L 30％ H2O2，4g/L NaOH溶液中于40℃水??；將溫度升至60℃，保溫10min后加入6mL/L 30％H2O2；將溫度升至98℃，保溫30min；然后使用80～85℃熱水洗麻，然后將麻置于2g/L乙酸浸漬10min后水洗；在含2g/L脫氧酶JMN-6的溶液中，50℃浸泡10min，水洗。

⑥上油：在含5g/L乳化油JM-D1、5g/L乳化油JM-D2的溶液中，40℃浸泡45min。

⑦在60℃烘箱中烘干。

將原麻烘至恒重，冷卻后稱重(記為m0)，經(jīng)過(guò)脫膠處理后將其再次烘干，記錄脫膠后苧麻的干重(記為m1)，計(jì)算失重率，失重率＝(m0-m1)/m0×100％。

分別參考GB/T 18147.2-2008《大麻纖維試驗(yàn)方法第2部分：殘膠率試驗(yàn)方法》、GB/T 5885-1986《苧麻纖維白度試驗(yàn)方法》、GB/T 5882-1986《苧麻束纖維斷裂強(qiáng)度試驗(yàn)方法》測(cè)定酶法脫膠后的苧麻進(jìn)行殘膠率、藍(lán)光白度、束纖維強(qiáng)度。

參閱表4，在商品酶復(fù)配的基礎(chǔ)上額外添加甘露聚糖酶處理后，苧麻樣品的失重率、殘膠率、藍(lán)光白度都有所提升，添加野生型甘露聚糖酶ManB085或突變型甘露聚糖酶ManB085M處理后的苧麻樣品的失重率分別上升了1.71％、2.71％，殘膠率分別下降了2.59％、2.65％，藍(lán)光白度分別上升了21.34％、9.76％，說(shuō)明添加甘露聚糖酶有助于苧麻中膠質(zhì)的去除。

表4不同酶復(fù)配處理對(duì)苧麻纖維性能的影響

  

綜上，本發(fā)明提供的野生型及突變型甘露聚糖酶屬于嗜熱耐堿酶，其最適溫度為75℃，最適pH為10，能夠在較寬的pH范圍內(nèi)(即pH 7～12)保持穩(wěn)定，其中，突變型甘露聚糖酶在熱堿條件下的熱穩(wěn)定性在野生型甘露聚糖酶的基礎(chǔ)上得以顯著提升。因此本發(fā)明的野生型及突變型甘露聚糖酶可以用于高溫高堿的苧麻脫膠等工藝，且當(dāng)其與木聚糖酶、果膠裂解酶等商品酶復(fù)配時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)降低苧麻殘膠率、提升苧麻白度，具有輔助苧麻脫膠的作用。

綜上，本發(fā)明通過(guò)基因挖掘的手段篩選到了嗜熱耐堿的甘露聚糖酶，通過(guò)將篩選到的甘露聚糖酶進(jìn)行突變，提高了該酶的熱穩(wěn)定性，增強(qiáng)了該酶在苧麻脫膠工藝中的應(yīng)用價(jià)值。目前國(guó)外內(nèi)售賣的紡織用甘露聚糖酶品種少，因此本發(fā)明為苧麻脫膠復(fù)合酶制劑提供了性質(zhì)優(yōu)良的甘露聚糖酶。

以上所述實(shí)施例僅是為充分說(shuō)明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。

 

摘自國(guó)家發(fā)明專利，發(fā)明人：鄭穗平 陳愫萍，申請(qǐng)?zhí)枺?/font>CN202311686999.5，申請(qǐng)日：2023.12.08