摘 要：本發(fā)明提供了一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，包括：將HcNI R基因片段連接在過表達(dá)載體上，將獲得的HcNI R基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，后制備發(fā)根農(nóng)桿菌菌液；紅麻種子萌發(fā)后，將其子葉進(jìn)行切割，獲得外植體；將所述外植體傷口朝下置于培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體浸泡在所述發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，后取出，傷口朝上置于恢復(fù)培養(yǎng)基中，進(jìn)行黑暗培養(yǎng)；黑暗培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體傷口朝下置于根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得帶根系的外植體。該方法能夠有效將紅麻根結(jié)線蟲抗性基因?qū)爰t麻，獲得抗根結(jié)線蟲的紅麻植株，該方法能夠節(jié)省大量的時間、人力和物力，提高工作效率。
權(quán)利要求書
1.一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，其特征在于，所述培育方法包括：
將HcNIR基因片段連接在過表達(dá)載體上，獲得HcNIR基因過表達(dá)載體；
將所述HcNIR基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，后制備發(fā)根農(nóng)桿菌菌液；
紅麻種子萌發(fā)后，將其子葉進(jìn)行切割，獲得外植體；
將所述外植體傷口朝下置于培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；
預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體浸泡在所述發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，后取出，傷口朝上置于恢復(fù)培養(yǎng)基中，進(jìn)行黑暗培養(yǎng)；
黑暗培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體傷口朝下置于根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得帶根系的外植體；
其中，所述HcNIR基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，其特征在于，所述將HcNIR基因片段連接在過表達(dá)載體上，獲得HcNIR基因過表達(dá)載體，具體包括：
將HcNIR基因片段連接在過表達(dá)載體PHG上，獲得HcNIR基因過表達(dá)載體PHG?HcNiR。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，其特征在于，所述將所述HcNIR基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，后制備發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，具體包括：
采用凍融法將所述HcNIR基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌A4感受態(tài)細(xì)胞，獲得含有HcNIR基因的發(fā)根農(nóng)桿菌；
將所述含有HcNIR基因的發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，獲得發(fā)根農(nóng)桿菌菌液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，其特征在于，所述紅麻種子萌發(fā)后，將其子葉進(jìn)行切割，獲得外植體，具體包括：
將滅菌后的紅麻種子置于萌發(fā)培養(yǎng)基中，放在環(huán)境溫度為25℃，光周期為16/8h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7?10d后，去掉種皮，將子葉切割成大小均一的矩形，獲得外植體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，其特征在于，所述將所述外植體傷口朝下置于培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，具體包括：
將所述外植體傷口朝下置于恢復(fù)培養(yǎng)基中，在環(huán)境溫度25℃，16h光照條件下，將外植預(yù)培養(yǎng)1d。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，其特征在于，所述預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體浸泡在所述發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，后取出，傷口朝上置于恢復(fù)培養(yǎng)基中，進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，具體包括：
預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體置于所述發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡15min，后取出吸干多余菌液，傷口朝上置于恢復(fù)培養(yǎng)基中，25℃黑暗條件下黑暗培養(yǎng)2～3d。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，其特征在于，所述黑暗培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體傷口朝下置于根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得帶根系的外植體，具體包括：
黑暗培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體傷口朝下置于根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7?10d，獲得帶根系的外植體。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種紅麻快速發(fā)根的培育方法。
背景技術(shù)
紅麻(Hibiscus cannabinus)又名洋麻或槿麻，為錦葵科(Malvaceae)木槿屬(Hibiscus)一年生草本韌皮纖維作物，是麻紡和造紙工業(yè)的重要原料，其纖維強(qiáng)力大、吸濕性好、散水快，耐腐蝕磨損，應(yīng)用領(lǐng)域十分廣闊。紅麻根結(jié)線蟲病(Meloidogyne spp .)是一種世界性病害，據(jù)報道，20世紀(jì)七八十年代，紅麻和玫瑰麻在美國作為商品生產(chǎn)的主要障礙是易感染根結(jié)線蟲，在美國東南部，紅麻栽培品種普遍高度感染數(shù)種根結(jié)線蟲。據(jù)調(diào)查，在我國各紅麻主產(chǎn)區(qū)，紅麻根結(jié)線蟲病也普遍發(fā)生，一般造成減產(chǎn)20％～30％，嚴(yán)重者達(dá)50％以上，甚至絕產(chǎn)，造成紅麻生產(chǎn)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。
截止到目前，對紅麻根結(jié)線蟲的研究仍處于感染后篩選抗病優(yōu)良品種的初級階段，現(xiàn)有技術(shù)的缺點是成本高、效率底、耗時間，同時還不能準(zhǔn)確地把抗蟲基因?qū)氲郊t麻根系中，靶向定位直接解決根結(jié)線蟲。
大豆是中國重要糧食作物之一，已有五千年栽培歷史，是一種其種子含有豐富植物蛋白質(zhì)的作物，大豆蛋白質(zhì)含量為35％～40％。大豆最常用來做各種豆制品、榨取豆油、釀造醬油和提取蛋白質(zhì)。關(guān)于大豆根結(jié)線蟲的預(yù)防，已有將抗蟲基因轉(zhuǎn)化大豆子葉誘導(dǎo)根系生成的技術(shù)，具體將包含目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599中，進(jìn)行大豆子葉的遺傳轉(zhuǎn)化，最后誘導(dǎo)毛狀根生成(王玲爽.大豆GmBIN2基因的克隆及功能分析[D] .東北農(nóng)業(yè)大學(xué).2018)。
目前，發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆技術(shù)較為成熟，由于紅麻和大豆相比用途不同，且種植面積和種植地點差異等導(dǎo)致紅麻發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化組培實驗還未開展。
為了解決紅麻根結(jié)線蟲病害問題，本發(fā)明提供了一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，該方法能夠有效將紅麻根結(jié)線蟲抗性基因?qū)爰t麻，獲得抗根結(jié)線蟲的紅麻植株，該方法能夠節(jié)省大量的時間、人力和物力，提高工作效率。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
本發(fā)明提供一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，所述培育方法包括：
將HcNIR基因片段連接在過表達(dá)載體上，獲得HcNIR基因過表達(dá)載體；
將所述HcNIR基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，后制備發(fā)根農(nóng)桿菌菌液；
紅麻種子萌發(fā)后，將其子葉進(jìn)行切割，獲得外植體；
將所述外植體傷口朝下置于培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；
預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體浸泡在所述發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，后取出，傷口朝上置于恢復(fù)培養(yǎng)基中，進(jìn)行黑暗培養(yǎng)；
黑暗培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體傷口朝下置于根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得帶根系的外植體；
其中，所述HcNIR基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
所述HcNIR基因片段編碼白蛋的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。
進(jìn)一步的，所述將HcNIR基因片段連接在過表達(dá)載體上，獲得HcNIR基因過表達(dá)載體，具體包括：
將HcNIR基因片段連接在過表達(dá)載體PHG上，獲得HcNIR基因過表達(dá)載體PHG?HcNiR。
進(jìn)一步的，所述將所述HcNIR基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，后制備發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，具體包括：
采用凍融法將所述HcNIR基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌A4感受態(tài)細(xì)胞，獲得含有HcNIR基因的發(fā)根農(nóng)桿菌；
將所述含有HcNIR基因的發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，獲得發(fā)根農(nóng)桿菌菌液。
進(jìn)一步的，所述紅麻種子萌發(fā)后，將其子葉進(jìn)行切割，獲得外植體，具體包括：
將滅菌后的紅麻種子置于萌發(fā)培養(yǎng)基中，放在環(huán)境溫度為25℃，光周期為16/8h(明/暗)的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7?10d后，去掉種皮，將子葉切割成大小均一的矩形，獲得外植體。
進(jìn)一步的，所述將所述外植體傷口朝下置于培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，具體包括：
將所述外植體傷口朝下置于恢復(fù)培養(yǎng)基中，在環(huán)境溫度25℃，16h光照條件下，將外植體預(yù)培養(yǎng)1d。
進(jìn)一步的，所述預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體浸泡在所述發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，后取出，傷口朝上置于恢復(fù)培養(yǎng)基中，進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，具體包括：
預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體置于所述發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡15min，后取出吸干多余菌液，傷口朝上置于恢復(fù)培養(yǎng)基中，25℃黑暗條件下黑暗培養(yǎng)2～3d。
進(jìn)一步的，所述黑暗培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體傷口朝下置于根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得帶根系的外植體，具體包括：
黑暗培養(yǎng)結(jié)束后，將所述外植體傷口朝下置于根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7?10d，獲得帶根系的外植體。
基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明提供一種紅麻植株，所述紅麻植株通過上述一種紅麻快速發(fā)根的培育方法制備。
本發(fā)明實施例中的一個或多個技術(shù)方案，至少具有如下技術(shù)效果或優(yōu)點：
1.本發(fā)明一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，該方法將紅麻HcNIR基因重組子轉(zhuǎn)入到發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)，制備出發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，切割紅麻子葉作為外植體，再將帶目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)化紅麻外植體，最后進(jìn)行生根培養(yǎng)，該方法抗根結(jié)線蟲基因的轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化后經(jīng)統(tǒng)計成功轉(zhuǎn)化植株占總數(shù)的93％以上，紅麻的生長周期為半年以上，本發(fā)明直接用紅麻發(fā)根的快速培育方法，節(jié)省了大量的時間，人力，物力，還能提高工作效率，準(zhǔn)確的將抗紅麻根結(jié)線蟲基因?qū)氲礁?，快速篩選得到抗根結(jié)線蟲的紅麻過表達(dá)植株。
2.本發(fā)明一種紅麻快速發(fā)根的培育方法，該方法經(jīng)過前期篩選符合紅麻轉(zhuǎn)化的發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)，然后對紅麻發(fā)根培養(yǎng)的組培條件的探索，培養(yǎng)基及抗生素的配比的研究得到適合紅麻種子的生長培養(yǎng)，切割子葉后的恢復(fù)培養(yǎng)以及生根培養(yǎng)條件，為制備紅麻抗根結(jié)線蟲的轉(zhuǎn)基因植株做好基礎(chǔ)，制備出的紅麻轉(zhuǎn)基因植株制備優(yōu)異的抗根結(jié)線蟲性能。
為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作一簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。
圖1為HcNIR基因過表達(dá)載體PHG?HcNiR質(zhì)粒圖譜。
圖1
圖2為本發(fā)明紅麻快速發(fā)根的培育試驗照片。
圖2
圖3為轉(zhuǎn)基因紅麻根中HcNIR基因PCR驗證圖譜。
圖3
圖4為將重組子轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌并轉(zhuǎn)化紅麻子葉后在發(fā)根培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d后的照片。
圖4
圖5為未導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌的紅麻子葉外植體在發(fā)根培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d后的照片。
圖5
具體實施方式
下文將結(jié)合具體實施方式和實施例，具體闡述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和各種效果將由此更加清楚地呈現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些具體實施方式和實施例是用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
在整個說明書中，除非另有特別說明，本文使用的術(shù)語應(yīng)理解為如本領(lǐng)域中通常所使用的含義。因此，除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的一般理解相同的含義。若存在矛盾，本說明書優(yōu)先。
除非另有特別說明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等，均可通過市場購買得到或者可通過現(xiàn)有方法制備得到。
下面將結(jié)合實施例及實驗數(shù)據(jù)對本申請一種紅麻快速發(fā)根的培育方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
實施例1
本實施例一種紅麻快速發(fā)根的培育方法。
1.總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄cDNA
1.1總RNA的提取
1)加液氮研磨粉碎紅麻葉片材料。每50～100mg材料加入1mlTRIZOL(材料體積應(yīng)小于TRIZOL體積的10％)，振蕩或用移液器打至無大顆粒。
2)懸液在室溫放置5分鐘，使核酸－蛋白復(fù)合物徹底分解。加入0.2ml氯仿/mlTRIZOL(起始)，用手劇烈振蕩15秒，15～30℃放置2～3分鐘。12,000rpm，2～8℃，離心15分鐘。
3)吸出無色上清，加入0.5ml異丙醇/mlTRIZOL(起始)，15～30℃放置10分鐘。12,000rpm，2～8℃，離心10分鐘。
4)75％乙醇洗滌(>1ml乙醇/mlTRIZOL)，7,500rpm，2～8℃，離心5分鐘。
5)室溫放置10?20分鐘干燥(briefly，徹底干燥會降低RNA溶解度)，加入經(jīng)DEPC處理的H2O，55～60℃，10分鐘。每100mg葉片可以獲得100～200μg總RNA。
1.2RT?PCR反應(yīng)
采用東洋紡公司的ReverTraRTKit(FSQ?101，TOYOBO)
1)10μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：
加入不含核酸酶的水補足至10μl；
2)反應(yīng)條件為：在37℃條件下，進(jìn)行15分鐘的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；
在98℃條件下，進(jìn)行5分鐘的酶失活反應(yīng)；
4℃保溫5min；
反應(yīng)結(jié)束后，加入不含核酸酶的水80μl稀釋，稀釋后的cDNA溶液可放?20℃長期保存，若經(jīng)常使用，需分裝成若干小管保存，經(jīng)常凍融不利于cDNA的穩(wěn)定。
2.PCR，構(gòu)建載體
2.1高保真酶PCR反應(yīng)：構(gòu)建質(zhì)粒
2.1.120μlPCR反應(yīng)體系：
2μl10×緩沖液
2μl2mMdNTPs
2μlDNA模板(紅麻葉片提取的cDNA)
1μlDMSO
0.8μl10pmol/μl上、下游引物(見表1中NirAF和NirAR)
0.5UkodDNA聚合酶(KOD?401,TOYOBO)
加水補足20μl。
其中，涉及的引物如表1所示：
表1
2.1.2PCR擴(kuò)增程序：
94℃預(yù)變性4min；
94℃變性30s，50～64℃退火30s，68℃延伸1min/kb，45個循環(huán)；
68℃保溫8min。
2.2DNA電泳，回收與酶切：
2.2.1電泳：
每個反應(yīng)管中加入適量10×上樣buffer，在1％?3％(10ulEB，1～3g瓊脂糖/100ml0.5×TBE緩沖液)的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。在0.5×TBE緩沖液中以5～10V/cm進(jìn)行電泳，結(jié)束電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。
2.2.2瓊脂糖凝膠DNA回收(GK2042，捷瑞生物)：
1)將DNA目標(biāo)條帶小心割下,放入1.5mlEP管中。
2)向管中加入400ul的bandingB,放入70℃水浴中，直到凝膠完全溶解。
3)向管中加入100ul的異丙醇，室溫放1分鐘，5000rpm離心1分鐘過柱。
4)重復(fù)步驟3
5)加500ulwashbuffer12000rmp洗兩次，10000rmp離心1分鐘。
6)向柱中加入40ul雙蒸水，37℃放置2分鐘，12000rmp離心1分鐘收集。
2.2.3酶切：
40μl酶切體系：
質(zhì)粒pHG?HcNiR(30ul)
4μl10×酶切緩沖液
4μl10×BSA(加或不加參考說明書)
6U限制性內(nèi)切酶(NEB)
加水補足40μl
在37度水浴處理1h左右。
2.3質(zhì)粒構(gòu)建步驟：
PCR片段經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后，與酶切回收的空載體混合，加入EasyGenoDNA重組體系連接(#VI201?02，天根生物)，10ul重組體系如下：
5ul2×EasyGenoAssemblyMix
2.5ul酶切載體DNA
2.5ul片段DNA
將反應(yīng)體系加入250ulEP管中，放50℃水浴30分鐘后轉(zhuǎn)化大腸桿菌涂板，放37℃培養(yǎng)箱16小時后，挑菌，送測序，測序正確的提質(zhì)粒放在?20℃長期保存，質(zhì)粒圖譜如圖1所示。
2.4質(zhì)粒的提取
2.4.1普通堿法小量抽提大腸質(zhì)粒DNA
接種一單菌落于3ml含適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取1.5ml培養(yǎng)物(低拷貝質(zhì)粒取3ml)，12,000rpm離心30秒；吸盡上清液，懸浮菌體于100μl溶液Ⅰ(Glucose50mmol/L，EDTA10mmol/L，Tris?HCl25mmol/L，pH8.0)中；加入200μl新鮮配制的溶液Ⅱ(NaOH0.2mol/L，SDS1％)，立即輕輕上下混勻；加入150μl溶液Ⅲ(KAc5mol/L，pH4.8)，快速上下混勻，室溫放置5分鐘；12,000rpm，離心10分鐘；轉(zhuǎn)移上清至另一離心管，加入2倍體積的乙醇，混勻；12,000rpm離心10分鐘；去上清，70％乙醇洗滌DNA沉淀，12,000rpm離心1分鐘，去除上清；真空干燥沉淀；溶于60μl含10μg/mlRNaseA的雙蒸水中。
3.重組子轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌：
(1)發(fā)根農(nóng)桿菌we感受態(tài)細(xì)胞的制備：
1)將發(fā)根農(nóng)桿菌A4活化，挑取單菌落于1.5mLYEP液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，震蕩過夜；
2)取1.5mL活化的菌液接種于50mLYEP培養(yǎng)基中，28℃，180rpm，震蕩至OD600為0.40?0.60；
3)冰浴30min，并隨時震蕩混勻并在低溫4℃下5500rpm離心8?10min，棄上清；
4)用10mL預(yù)冷的0.1MNaCl溶液重懸細(xì)胞，低溫4℃下5500rpm離心8?10min，棄上清；
5)用1mL預(yù)冷的20mM的CaCl2溶液重懸細(xì)胞，將菌液分裝成每管100μL(30％甘油)，液氮速凍后?80℃保存。
(2)凍融法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞：
1)重組質(zhì)粒提取；
2)取5μL質(zhì)粒，加入100μL發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管底混勻；
3)冰浴30min，液氮速凍2?3min，37℃水浴鍋熱激5min后迅速放在冰上冰浴3?5min；
4)向離心管中加入500?600μLYEP液體培養(yǎng)基，放在28℃，180rpm搖床中振蕩培養(yǎng)2h；
4.紅麻毛狀根的誘導(dǎo)
(1)培養(yǎng)基成分
1)萌發(fā)培養(yǎng)基：40g/L含瓊脂和蔗糖的MS培養(yǎng)基，1mg/L6?BA，1?2g瓊脂，pH＝5.8；
2)恢復(fù)培養(yǎng)基：40g/L含瓊脂和蔗糖的MS培養(yǎng)基，1?2g瓊脂，250mg/LCef，pH＝5.6。
3)根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：40g/L含瓊脂和蔗糖的MS培養(yǎng)基，1?2g瓊脂，250mg/LCef，植物組培抗菌劑PPM作用濃度為0.05％?0.2％，pH＝5.6。
(2)發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的制備
挑取含有目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，涂于含有Kanacine的發(fā)根固體培養(yǎng)基(或者是YEP固體培養(yǎng)基)上，28℃倒置培養(yǎng)2d。挑取單菌落接種于含有50mg/mL Kanacine的發(fā)根液體培養(yǎng)基(或者是YEP液體培養(yǎng)基)中，28℃220rpm震蕩培養(yǎng)16h。取菌液1：100進(jìn)行二次活化，當(dāng)菌液達(dá)到OD600＝0.8時，收集菌體于50mL無菌離心管中，低溫4℃4000rpm離心10min。用0.1mM/LMgCl2的溶液重懸，作為轉(zhuǎn)化用菌液。
(3)毛狀根的誘導(dǎo)
在無菌操作臺中將飽滿的紅麻種子用75％酒精消毒5分鐘，再倒入次氯酸鈉(分析純)液體消毒20分鐘，滅菌水沖洗3?5次；將滅菌過的紅麻種子種在萌發(fā)培養(yǎng)基中，放在環(huán)境條件為25℃，光周期為16/8h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7?10d后，去掉種皮，用無菌刀切子葉成大小均一的矩形0.5～0.7cm，傷口朝下，放于恢復(fù)培養(yǎng)基上，25℃，16h光周期條件下，將外植體預(yù)培養(yǎng)1d。第2天時，將外植體放入至準(zhǔn)備好的發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染菌液中，浸泡15min后，倒掉菌液，將外植體取出。使用無菌濾紙將外植體上多余的菌液吸干，傷口朝上，放于恢復(fù)培養(yǎng)基上。25℃黑暗條件下培養(yǎng)2～3d后，將外植體傷口朝下放于到根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周到十天即可見到根的生成。
如圖2所述，A圖為萌發(fā)培養(yǎng)基，B圖為切割后的紅麻子葉，C圖為子葉外植體的恢復(fù)培養(yǎng)狀態(tài)，D圖為生根培養(yǎng)狀態(tài)，E圖為生根培養(yǎng)一周后狀態(tài)，可見到根的生成，F(xiàn)圖為生根培養(yǎng)三周后狀態(tài)，可見到大量的再生根已布滿發(fā)根培養(yǎng)基中。
用該方法對紅麻HcNIR基因重組子轉(zhuǎn)到發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)，然后再將紅麻種子滅菌，種到萌發(fā)培養(yǎng)基中，切割子葉后進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化紅麻外植體，最后進(jìn)行生根培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化后經(jīng)統(tǒng)計成功轉(zhuǎn)化植株占總數(shù)的93％以上。紅麻的生長周期要半年多，所以直接用紅麻發(fā)根的快速培育方法，節(jié)省了大量的時間，人力，物力還能提高工作效率，準(zhǔn)確的將抗紅麻根結(jié)線蟲基因?qū)氲礁锌焖俸Y選得到抗根結(jié)線蟲的紅麻過表達(dá)植株。以轉(zhuǎn)基因紅麻根中的DNA為模板，用表1中的測序引物GFP?FCX和NiRAR1進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖3，獲得近1500bp跑膠圖，條帶位置大小正確。
圖4為將重組子轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌并且轉(zhuǎn)化紅麻子葉在發(fā)根培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天后的效果圖，可見子葉外植體有再生根生成。
圖5為將未導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌的紅麻子葉外植體放入本發(fā)明發(fā)根培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天后的效果圖，可見子葉外植體并無再生根生成。
最后，還需要說明的是，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。
盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。
顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。
