摘  要：本發(fā)明涉及生物工程和苧麻纖維脫膠領(lǐng)域，具體涉及一種堿性果膠裂解酶及其在苧麻脫膠中的應(yīng)用。本發(fā)明對來源于Paenibacillustarimensis的氨基酸序列為SEQIDNo:1所示的野生型堿性果膠裂解酶進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得熱穩(wěn)定性顯著提升的堿性果膠裂解酶，其氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的堿性果膠裂解酶屬于嗜熱耐堿酶，能夠在pH6～12范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，為苧麻脫膠酶制劑或復(fù)合酶制劑提供了一種新的優(yōu)良的選擇。與對應(yīng)的野生型堿性果膠裂解酶相比，本發(fā)明的堿性果膠裂解酶在65℃,pH10熱堿條件下的半衰期提高了接近1倍，且具有更佳的苧麻脫膠效果，更有利于工業(yè)應(yīng)用。

 

技術(shù)要點(diǎn)

1.一種堿性果膠裂解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。

2.編碼權(quán)利要求1所述堿性果膠裂解酶的基因。

3.如權(quán)利要求2所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。

4.一種包含如權(quán)利要求2所述基因的重組載體或重組菌株。

5.如權(quán)利要求4所述的重組載體或重組菌株，其特征在于，所述重組載體的表達(dá)載體包括以pPIC9K。

6.如權(quán)利要求4所述的重組載體或重組菌株，其特征在于，所述重組菌株的宿主包括畢赤酵母。

7.如權(quán)利要求1所述堿性果膠裂解酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：構(gòu)建權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，獲得重組表達(dá)菌株，對所述重組表達(dá)菌株進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化，得到所述堿性果膠裂解酶。

8.如權(quán)利要求7所述制備方法，其特征在于，構(gòu)建所述重組表達(dá)載體包括如下步驟：

(1)篩選得到氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的堿性果膠裂解酶，合成對應(yīng)的核苷酸序列并連接至表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒，所述核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；

(2)以所述重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)突變引物，進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得所述重組表達(dá)載體。

9.如權(quán)利要求1～8所述堿性果膠裂解酶在苧麻脫膠中的應(yīng)用。

10.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述堿性果膠裂解酶用于苧麻脫膠的溫度為50℃~70℃,pH為6～12。

 

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程和苧麻纖維脫膠領(lǐng)域，具體涉及一種堿性果膠裂解酶及其在苧麻脫膠中的應(yīng)用。

 

背景技術(shù)

紡織工業(yè)中最常用的原料為植物纖維，如棉花、苧麻等，這些植物纖維中大都含有果膠類雜質(zhì)，因此在紡織工業(yè)原料加工過程中，需要通過一些手段去除植物纖維中的果膠類雜質(zhì)，即脫膠處理。傳統(tǒng)的化學(xué)脫膠方法是利用高溫和強(qiáng)堿性條件處理紡織原料以達(dá)到脫膠的目的，該方法存在生產(chǎn)能耗大、處理時(shí)間長、操作環(huán)境比較危險(xiǎn)及產(chǎn)生的廢液對環(huán)境危害較大等弊端。因此，目前紡織工業(yè)脫膠處理的發(fā)展趨勢是采用生物酶法進(jìn)行原料脫膠處理，其常用的酶有果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、淀粉酶以及纖維素酶等。

其中，果膠裂解酶來源廣泛，主要由真菌和細(xì)菌產(chǎn)生，通過β-消除反應(yīng)作用于聚半乳糖醛酸(Polygalacturonicacid)的α-1，4糖苷鍵，并在非還原末端生成4，5-不飽和寡聚半乳糖醛酸。作為棉織物精練、苧麻脫膠的關(guān)鍵酶之一，果膠裂解酶可以去除果膠質(zhì)，提高纖維吸水性，保持纖維柔軟手感，并提高纖維的可紡性能、成紗性能。目前，國內(nèi)外已有許多商品化的果膠裂解酶制劑用于紡織工業(yè)中，但大多數(shù)果膠裂解酶的使用條件是常溫或中溫，無法滿足苧麻脫膠高溫強(qiáng)堿的工作環(huán)境，且需較長的作用時(shí)間才能達(dá)到預(yù)期效果。

 

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明通過酶挖掘與改造技術(shù)獲得新的嗜熱的堿性果膠裂解酶，為苧麻脫膠工藝提供新的酶制劑，為紡織復(fù)合酶制劑創(chuàng)制提供新選擇。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種堿性果膠裂解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。

本發(fā)明的堿性果膠裂解酶屬于嗜熱耐堿酶，通過對來源于Paenibacillustarimensis的氨基酸序列為SEQIDNo:1所示的野生型堿性果膠裂解酶進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得，與野生型堿性果膠裂解酶相比，本發(fā)明的堿性果膠裂解酶在65℃,pH10熱堿條件下的半衰期提高了接近1倍，且具有更佳的苧麻脫膠效果，更有利于工業(yè)應(yīng)用，為苧麻脫膠酶制劑或復(fù)合酶制劑提供了一種新的優(yōu)良的選擇。

進(jìn)一步，編碼所述堿性果膠裂解酶的基因。

進(jìn)一步，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。

進(jìn)一步，包含所述基因的重組載體或重組菌株。

進(jìn)一步，所述重組載體的表達(dá)載體包括pPIC9K。

進(jìn)一步，所述重組菌株的宿主包括畢赤酵母。

進(jìn)一步，所述堿性果膠裂解酶的制備方法包括如下步驟：構(gòu)建所述重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，獲得重組表達(dá)菌株，對所述重組表達(dá)菌株進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化，得到所述堿性果膠裂解酶。

進(jìn)一步，構(gòu)建所述重組表達(dá)載體包括如下步驟：

(1)篩選得到氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的堿性果膠裂解酶，合成對應(yīng)的核苷酸序列并連接至表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒，所述核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；

(2)以所述重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)突變引物，進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得所述重組表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供所述堿性果膠裂解酶在苧麻脫膠中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述堿性果膠裂解酶用于苧麻脫膠的溫度為50℃~70℃,pH為6～12。

說明書附圖

圖1為本發(fā)明突變型堿性果膠裂解酶pel114-A308I基因片段的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道M為Marker；泳道1為pel114-A308I基因；

  

圖2是本發(fā)明突變型堿性果膠裂解酶經(jīng)Ni-NTA親和層析處理后的SDS-PAGE分析結(jié)果；其中，泳道M為分子量Marker；泳道1為畢赤酵母GS115/pPIC9K-pel114-A308I純化樣品；泳道2為畢赤酵母GS115/pPIC9K-pel114-A308I發(fā)酵上清液；

  

圖3是本發(fā)明野生型及突變型堿性果膠裂解酶的最適反應(yīng)溫度曲線；

  

圖4是本發(fā)明野生型及突變型堿性果膠裂解酶的最適pH曲線；

  

圖5是本發(fā)明野生型及突變型堿性果膠裂解酶在65℃下的半衰期曲線；

  

圖6是本發(fā)明野生型及突變型堿性果膠裂解酶的pH穩(wěn)定性曲線。

  

 

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對本發(fā)明的限定。其中，采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示堿性果膠裂解酶中突變的氨基酸，如“AxxB”表示第xx位的氨基酸由野生型酶的氨基酸A替換成氨基酸B，位置的編號對應(yīng)SEQIDNo:1中野生型堿性果膠裂解酶的氨基酸序列編號。

為了獲得一種新的嗜熱的堿性果膠裂解酶，為苧麻脫膠工藝提供新的酶制劑或復(fù)合酶制劑提供新選擇，發(fā)明人進(jìn)行了以下酶挖掘和改造過程：

(1)進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研并整理比較已報(bào)道的不同來源的堿性果膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)，選擇了目前報(bào)道酶活最高的來自于類芽孢桿菌0602的pelN酶作為探針酶，該酶最適反應(yīng)溫度為65℃,最適pH為9.8，比酶活為2060U/mg，在60℃下的半衰期為16.5min。

(2)基于探針酶pelN的氨基酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫上通過Blastp進(jìn)行候選序列收集，篩選與探針酶序列相似性在30％～80％的氨基酸序列，剔除重復(fù)、異常、不完整的序列后，共收集到565條序列，并通過分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析(MAFFT等工具)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

(3)選擇探針酶所在及臨近分支，進(jìn)行來源及家族結(jié)構(gòu)域劃分，從中篩選與探針酶同一家族且同樣來自類芽孢桿菌的候選序列，利用序列分析軟件對探針酶及所述候選序列進(jìn)行比對，通過確定的保守的序列模式篩選具有果膠裂解酶活性的候選序列。

(4)制備步驟(3)篩選的候選序列對應(yīng)的酶并分析其酶學(xué)性質(zhì)，從中篩選可以分解果膠的嗜熱耐堿酶，獲得了來源于Paenibacillustarimensis的野生型堿性果膠裂解酶pel114(NCBIReferenceSequence登錄號：WP_235289114.1)，其與探針酶的序列相似性為69.18％，且目前尚未有與該野生型堿性果膠裂解酶pel114的應(yīng)用相關(guān)的報(bào)道。

其中，所述氨基酸序列對應(yīng)的酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì)分析過程如下：根據(jù)所述氨基酸序列，合成對應(yīng)的核苷酸序列，將所述核苷酸序列連接至表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，獲得重組菌株并進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化，獲得純度較高的重組蛋白；檢測重組蛋白分解不飽和聚半乳糖醛酸的酶活、最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定性和半衰期，篩選嗜熱耐堿的重組蛋白。

(5)利用SWISS-MODEL平臺對堿性果膠裂解酶pel114進(jìn)行同源建模，并利用第三方平臺對模型情況進(jìn)行打分，打分情況為優(yōu)。

(6)通過alphafold2對堿性果膠裂解酶pel114進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測，基于FireProt網(wǎng)站的理性設(shè)計(jì)進(jìn)行預(yù)測，得到一些活性位點(diǎn)。

(7)在300K和350K的耦合溫度下對堿性果膠裂解酶pel114進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，根據(jù)均方根波動值(RMSF)波動確定堿性果膠裂解酶pel114的柔性區(qū)域，對該區(qū)域進(jìn)行虛擬飽和突變，得到一些自由能較低的突變位點(diǎn)。同時(shí)，將本發(fā)明的堿性果膠裂解酶與已有報(bào)道的耐熱的堿性果膠裂解酶進(jìn)行序列比對，得到一些潛在的突變位點(diǎn)。

(8)對步驟(7)獲得的突變位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，制備相應(yīng)的突變型堿性果膠裂解酶，檢測上述突變型堿性果膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)，經(jīng)篩選，得到熱穩(wěn)定性顯著提高的突變體A308I，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。

基于上述理論分析，發(fā)明人根據(jù)探針酶篩選獲得了氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的野生型堿性果膠裂解酶pel114，然后對該野生型堿性果膠裂解酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測、分子動力學(xué)模擬等，獲得一些潛在突變位點(diǎn)，然后通過篩選獲得A308I定點(diǎn)突變的突變型堿性果膠裂解酶A308I，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，其篩選和制備方法包括如下步驟：

(1)篩選得到氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的野生型堿性果膠裂解酶pel114，合成對應(yīng)的核苷酸序列并連接至表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒，所述核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；

(2)以步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)突變引物，進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得所述重組表達(dá)載體；

(3)將步驟(2)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，獲得重組表達(dá)菌株；

(4)對步驟(3)獲得的重組菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，然后離心收集上清液，利用Ni-NTA柱層析獲得純度較高的重組蛋白；

(5)檢測重組蛋白分解不飽和聚半乳糖醛酸的酶活、最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定性和半衰期，篩選嗜熱耐堿的重組蛋白，獲得堿性果膠裂解酶A308I。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

本發(fā)明實(shí)施例中的全基因合成皆由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

本發(fā)明實(shí)施例所用試劑如下：

MD固體培養(yǎng)基包含20g/L葡萄糖，13.4g/L無氨基酵母氮源，20g/L瓊脂。

BMGY液體培養(yǎng)基包含20g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、10mL/L甘油、13.4g/L無氨基酵母氮源、0.1mol/L磷酸鹽。

BMMY液體培養(yǎng)基包含20g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、13.4g/L無氨基酵母氮源、0.1mol/L磷酸鹽、10mL/L甲醇。

此外，內(nèi)切酶購自Fermentas公司，連接酶購自Invitrogen公司，底物不飽和聚半 乳糖醛酸購買自sigma公司。所使用的其他材料、試劑等，如無特別說明，為從商業(yè)途徑得到 的材料和試劑。

本發(fā)明實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1：野生型堿性果膠裂解酶的制備

(1)重組質(zhì)粒pPIC9K-pel114的構(gòu)建

通過NCBI獲得來源于Paenibacillus tarimensis的堿性果膠裂解酶的全基因序 列pel114，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，將其進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到如SEQ ID No:2 所示的核苷酸序列，全基因合成優(yōu)化后的核苷酸序列并亞克隆到表達(dá)載體pPIC9K上，得到 重組質(zhì)粒pPIC9K-pel114。

(2)菌落PCR鑒定和測序

將步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒pPIC9K-pel114用SacI進(jìn)行線性化，利用電轉(zhuǎn)化的方法  將其轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞畢赤酵母GS115中。對轉(zhuǎn)化的抗MD平板上的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證， 得到表達(dá)菌種畢赤酵母GS115/pPIC9K-pel114。

(3)酶的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將表達(dá)菌種畢赤酵母GS115/pPIC9K-pel114接種于10mL BMGY液體培養(yǎng)基中，30 ℃ , 250rpm，振蕩培養(yǎng)過夜；常溫3000g離心2min后，收集菌體，將其轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn) 接后的菌液OD600為0.5～1 .0；30℃ , 250rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h～120h，期間每隔24h取樣并 向培養(yǎng)基中添加甲醇至1.0％v/v，培養(yǎng)完成后，固液分離獲得發(fā)酵上清液。

使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對獲得的發(fā)酵上清液進(jìn)行Ni-NTA柱層析。用含有300mM咪唑的20mMTris-HCl緩沖液洗脫，用超濾管(Millipore)濃縮收集目標(biāo)蛋白溶液，得到野生型堿性果膠裂解酶WT，通過SDS-PAGE分析判斷WT蛋白質(zhì)純度。

實(shí)施例2：突變型堿性果膠裂解酶的制備

(1)重組質(zhì)粒pPIC9K-pel114-A308I的構(gòu)建

以實(shí)施例1的重組質(zhì)粒pPIC9K-pel114為模板，設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得具有特異性點(diǎn)突變A308I的目的基因片段。用內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pPIC9K進(jìn)行酶切，再使用連接酶對酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-pel114-A308I。

表1引入突變堿基的引物及其序列

  

(2)菌落PCR鑒定和測序

將步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒pPIC9K-pel114-A308I用SacI進(jìn)行線性化，利用電轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞畢赤酵母GS115中。對轉(zhuǎn)化的抗MD平板上的單菌落進(jìn)行菌落PCR，然后將PCR產(chǎn)物點(diǎn)至1％瓊脂糖凝膠電泳膠孔內(nèi)(另點(diǎn)一孔Marker作為對照)，110V分離30min后將瓊脂糖凝膠電泳膠浸泡于Gelred染色液15min，根據(jù)Marker判斷菌落PCR產(chǎn)物條帶的大致大小，并與預(yù)期的條帶大小相比較，從而確定表達(dá)菌株構(gòu)建是否完成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。本實(shí)施例中，通過菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，得到表達(dá)菌種畢赤酵母GS115/pPIC9K-pel114-A308I。將含有A308I突變的堿性果膠裂解酶命名為A308I，其氨基酸序列為SEQIDNO:3，編碼核苷酸序列為SEQIDNO:4。

(3)酶的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將表達(dá)菌種畢赤酵母GS115/pPIC9K-pel114-A308I接種于10mLBMGY液體培養(yǎng)基中，于30℃,250rpm振蕩培養(yǎng)過夜；常溫、3000g條件下離心2min以收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基中，使轉(zhuǎn)接后的菌液OD600為0.5～1.0；于30℃,250rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h~120h，期間每隔24h取樣并向培養(yǎng)基中添加甲醇至1.0％v/v，培養(yǎng)完成后，固液分離獲得發(fā)酵上清液。

使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對獲得的發(fā)酵上清液進(jìn)行Ni-NTA柱層析，用含有300mM咪唑的20mMTris-HCl緩沖液洗脫，用超濾管濃縮收集目標(biāo)蛋白溶液，得到突變型堿性果膠裂解酶A308I，通過SDS-PAGE分析判斷A308I蛋白質(zhì)純度，圖2表明，通過Ni-NTA一步純化，獲得了電泳純的堿性果膠裂解酶A308I目的蛋白。

效果例1：野生型和突變型堿性果膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)測定

(1)堿性果膠裂解酶的酶活測定

取160μL底物溶液(0.2％不飽和聚半乳糖醛酸溶液)在最適溫度下預(yù)熱適當(dāng)時(shí)間，加入40μL酶液，最適溫度下震蕩反應(yīng)10min后，加入300μL0.03M的H3PO4溶液終止反應(yīng)，繼續(xù)震蕩5min后，取200μL加入紫外專用酶標(biāo)板，測量其在波長為235nm下的吸光值。對照組則加入40μL緩沖液，160uL底物溶液，相同條件下反應(yīng)10min，加入300μL0.03M的H3PO4溶液終止反應(yīng)，繼續(xù)震蕩5min后，取200μL加入紫外專用酶標(biāo)板，測量其在波長為235nm下的吸光值。

果膠裂解酶酶活(U)的定義為：每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生1μM的不飽和聚半乳糖醛酸所需的酶量。

果膠裂解酶酶活的計(jì)算公式如下：

  

其中，T(min)為在酶反應(yīng)的線性范圍內(nèi)的酶促反應(yīng)時(shí)間，b(cm)為光程，酶量(mg)＝濃度*體積，A1為樣品反應(yīng)液在235nm的吸收值，A0為對照組在235nm的吸收值，4600(L·mol-1cm-1)為不飽和聚半乳糖醛酸在235nm處的摩爾吸光系數(shù)。

(2)酶學(xué)性質(zhì)測定

按照上述酶活測定方法，測定實(shí)施例1制備的野生型堿性果膠裂解酶WT和實(shí)施例2制備的突變型堿性果膠裂解酶A308I在不同的溫度(45～75℃)下的酶活和不同pH(pH7.0~11.0)下的酶活，確定其最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH。

將適當(dāng)稀釋的酶液置于65℃中，每隔20min取一次樣并測定其酶活，以加熱前的酶活為100％計(jì)算相對酶活，統(tǒng)計(jì)所得數(shù)據(jù)并算出野生型及突變型堿性果膠裂解酶的半衰期t1/2來衡量其熱穩(wěn)定性。

分別用50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.0～9.0)、50mM的Gly-NaOH緩沖液(pH9.0~11.0)和50mM的Na2HPO4-NaOH緩沖液(pH12.0)配制酶液，使反應(yīng)體系的pH在6.0-12.0范圍內(nèi)，于4℃下處理12h，測定殘余酶活性，以未處理的酶活為100％計(jì)算相對酶活，以研究堿性果膠裂解酶的pH穩(wěn)定性。

參閱圖3～圖4，野生型堿性果膠裂解酶WT與突變型堿性果膠裂解酶A308I的最適溫度均為60℃,最適反應(yīng)pH均為10.0。參閱圖5，在65℃條件下，野生型堿性果膠裂解酶的半衰期為55min，其熱穩(wěn)定性顯著高于探針酶pelN，另外，突變型堿性果膠裂解酶的半衰期為90min，顯著高于野生型堿性果膠裂解酶，因此突變體的熱穩(wěn)定性有較大的提高。參閱圖6，在pH6.0～12.0范圍內(nèi)室溫處理野生型堿性果膠裂解酶與突變型堿性果膠裂解酶12h，兩者均能保持80％以上的酶活力。

效果例2：野生型和突變型堿性果膠裂解酶的苧麻脫膠分析

按照以下方法進(jìn)行苧麻脫膠：

①壓麻：將苧麻進(jìn)行機(jī)械碾壓直至苧麻柔軟松散。

②預(yù)處理：將苧麻浸漬在含5g/L尿素、3g/L滲透劑JFC?6的溶液中24h，固浴比為1：10。

③酶處理：將苧麻按浴比1：10浸泡在含1g/L滲透劑JFC?6的50mMGly?NaOH，pH10的緩沖液中，加入適量酶在60℃水浴16h進(jìn)行酶脫膠處理。其中，每15g苧麻需使用1000U的堿性果膠裂解酶進(jìn)行酶脫膠處理。

④堿氧處理：將苧麻按浴比1：10浸漬在含6mL/L30％H2O2，4g/LNaOH溶液中于40℃水??；將溫度升至60℃,保溫10min后加入6mL/L30％H2O2；將溫度升至98℃,保溫30min，期間多次翻拌，保證漂白均勻。

⑤還原：按浴比1：10將苧麻置于2g/L乙酸浸漬10min，水洗，然后在含2g/L脫氧酶JMN?6中于50℃浸泡10min。

⑥上油：按浴比1：10將苧麻浸泡在含5g/L乳化油JM?D1、5g/L乳化油JM?D2的溶液中，40℃浸泡45min。

實(shí)驗(yàn)共分為4組，實(shí)驗(yàn)組1不進(jìn)行酶脫膠處理，實(shí)驗(yàn)組2～4分別采用野生型堿性果膠裂解酶WT、突變型堿性果膠裂解酶A308I、突變型堿性果膠裂解酶A308I與甘露聚糖酶復(fù)配進(jìn)行苧麻脫膠的酶處理工藝。

將原麻烘至恒重，冷卻后稱重(記為m0)，經(jīng)過脫膠處理后將其再次烘干，記錄脫膠后苧麻的干重(記為m1)，計(jì)算失重率，失重率＝(m0?m1)/m0×100％。

參照GBT5889?1986《苧麻化學(xué)成分定量分析方法》，對脫膠后的苧麻精干麻的殘膠率進(jìn)行測試，苧麻精干麻殘膠率公式如下：殘膠率(％)＝(試樣的干重?提取殘膠后的試樣干重)/試樣的干重×100％。

參照GBT5885?1986《苧麻纖維白度試驗(yàn)方法》，對脫膠后的苧麻精干麻的白度進(jìn)行測試，精干麻的白度計(jì)算公式如下：白度(度)＝試樣平均白度值/試樣的測定次數(shù)束纖維斷裂強(qiáng)度測試方法如下：測試儀器購于常州第一紡織廠，測試樣品切割長度為40mm，控制樣品重量在10mg左右，將機(jī)器的夾距調(diào)節(jié)為10mm，拉伸速度為300mm/min，束纖維強(qiáng)度的計(jì)算公式為以下所示：麻束的線密度(dtex)＝麻束的質(zhì)量/麻束的切割長度×104，束纖維斷裂強(qiáng)度(cN·dtex?1)＝麻束的斷裂強(qiáng)力/麻束的線密度。

表2不同酶復(fù)配處理對苧麻纖維性能的影響

  

參閱表2，與純堿氧方法相比，加入野生型堿性果膠裂解酶WT或突變型堿性果膠裂解酶A308I后，苧麻的殘膠率下降，其中，突變型堿性果膠裂解酶A308I處理的苧麻的藍(lán)光白度顯著上升，因此，添加堿性果膠裂解酶可以提升苧麻的脫膠效果，其中突變型堿性果膠裂解酶的輔助脫膠效果更佳。此外，突變型堿性果膠裂解酶與甘露聚糖酶復(fù)配處理的苧麻的殘膠率顯著下降，因此，本發(fā)明的突變型堿性果膠裂解酶可以與其他酶復(fù)配，以提升酶法苧麻脫膠的效果。

綜上，本發(fā)明的野生型及突變型堿性果膠裂解酶屬于嗜熱耐堿酶，其最適溫度為60℃,最適pH為10，并且能夠在較寬的pH范圍內(nèi)(即pH6～12)保持穩(wěn)定，并且與探針酶相比，本發(fā)明的堿性果膠裂解酶的熱穩(wěn)定性得以顯著提升，其中突變型堿性果膠裂解酶的熱穩(wěn)定性顯著優(yōu)于野生型果膠裂解酶。本發(fā)明的野生型及突變型堿性果膠裂解酶可用于高溫強(qiáng)堿環(huán)境下的苧麻脫膠工藝，降低苧麻的脫膠率，為苧麻脫膠工業(yè)的酶制劑和復(fù)配酶制劑需求提供了一種新選擇，其中突變型堿性果膠裂解酶在降低苧麻殘膠率的同時(shí)能夠提升苧麻白度，具有更佳的輔助苧麻脫膠的作用。

以上所述實(shí)施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。

 

文章摘自國家大麻專利：一種堿性果膠裂解酶及其在苧麻脫膠中的應(yīng)用，發(fā)明人：鄭穗平，陳妤坤，申請?zhí)枺?/font>202311686995.7，申請日：2023.12.08