摘 要：本發(fā)明屬于基因工程和紡織科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種堿性漆酶及其在苧麻脫膠中的應(yīng)用。本發(fā)明通過定點突變將來自嗜熱嗜堿卡式桿菌的野生型堿性漆酶(氨基酸序列如SEQIDNO:1所示)的第190位甘氨酸突變?yōu)楦彼?、?54位谷氨酰胺酸突變?yōu)槔野彼帷⒌?/font>336位甘氨突變?yōu)榈?/span>氨酸、第510位天冬氨酸突變?yōu)楸奖彼幔瑢⑼蛔?/span>后的目的基因嵌入表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入宿主細胞，經(jīng)表達純化得到氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的突變型堿性漆酶。與野生型堿性漆酶相比，突變型堿性漆酶具有相似的最適溫度、最適pΗ和更高的熱穩(wěn)定性，可與木聚糖酶和果膠酶復(fù)配用于堿性中溫環(huán)境下的苧麻脫膠工藝，實現(xiàn)顯著降低苧麻的殘膠率，為苧麻脫膠工業(yè)復(fù)配酶制劑需求提供了一種新選擇。
權(quán)利要求書
1.一種堿性漆酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述堿性漆酶的基因。
3.如權(quán)利要求2所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
4.一種包含如權(quán)利要求2所述基因的重組載體或重組菌株。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體或重組菌株，其特征在于，所述重組載體的表達載體包括pET28a。
6.如權(quán)利要求4所述的重組載體或重組菌株，其特征在于，所述重組菌株的宿主包括大腸桿菌BL21(ED3)。
7.如權(quán)利要求1所述堿性漆酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：構(gòu)建權(quán)利要求4或5所述重組表達載體并轉(zhuǎn)化至宿主細胞，獲得重組表達菌株，對所述重組表達菌株進行培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達、分離純化，得到所述堿性漆酶。
8.如權(quán)利要求7所述制備方法，其特征在于，構(gòu)建所述重組表達載體包括如下步驟：
(1)篩選得到氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的堿性漆酶，合成對應(yīng)的核苷酸序列并連接至表達載體，獲得重組質(zhì)粒，所述核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；
(2)以所述重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計突變引物，進行重疊延伸PCR擴增反應(yīng)，獲得所述重組表達載體。
9.如權(quán)利要求1～8所述堿性漆酶在苧麻脫膠中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述堿性漆酶用于苧麻脫膠的溫度為50℃～70℃，pH為6～10。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及基因工程和紡織科學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種堿性漆酶及其在苧麻脫膠中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
苧麻是一種重要的工業(yè)纖維作物，種植歷史悠久，苧麻單纖維的長度、細度和強度等一適應(yīng)紡紗要求，但纖維在原麻中被膠質(zhì)粘連在一起，需進行苧麻脫膠。苧麻脫膠是指將苧麻原麻脫去膠質(zhì)制取苧麻纖維，是苧麻纖維加工的關(guān)鍵工序，脫膠效果直接影響麻纖維質(zhì)量和制成率。傳統(tǒng)的苧麻脫膠生產(chǎn)基本上是以燒堿為主的化學(xué)脫膠工藝，但其存在脫膠流程長、工序繁瑣、勞動強度大、能耗大、環(huán)境污染等缺點。同時由于使用強酸、強堿、高溫高壓煮練等苛性條件，致使部分纖維素纖維分子鏈斷裂、結(jié)晶度增高，造成精干麻制成率低、剛性強、織物手感粗糙等問題。
苧麻原料的主要組成為纖維素，其膠質(zhì)主要包括果膠、半纖維素和木質(zhì)素，因此可以采用采用酶法進行脫膠，而目前主要采用果膠酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶進行酶法脫膠。由于果膠、半纖維素和木質(zhì)素在無空間阻礙時，依靠游離的羥基、羧基進行物質(zhì)結(jié)合、氫鍵連接或化學(xué)鍵結(jié)合，使膠質(zhì)分子之間相互連接，形成更復(fù)雜的聚合體。當(dāng)用單種酶進行脫膠時，由于膠質(zhì)復(fù)合體形成的網(wǎng)絡(luò)體系，酶分子很難滲透到膠質(zhì)內(nèi)部與其中的膠質(zhì)作用，一部分膠質(zhì)大分子雖被相應(yīng)的酶所降解，但由于這些片斷與其他大分子連接在一起而不能從膠質(zhì)體系中游離出來。因此采用多種酶復(fù)配進行聯(lián)合脫膠時，去除膠質(zhì)的效果優(yōu)于他們單獨進行脫膠的總和。
堿性漆酶(Laccase)是一類含銅的多酚氧化酶，木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)中含有的酚羥基可通過堿性漆酶催化氧化而形成自由基，進而引發(fā)木質(zhì)素的降解。堿性漆酶可以高效專一地催化木質(zhì)素氧化分解，且其只產(chǎn)生水一種副產(chǎn)物，并且堿性漆酶可將酚式羥基轉(zhuǎn)化成苯氧自由基，引發(fā)自由基反應(yīng)，從而起到對苧麻本身的色素進行脫色，減少漂白劑的用量，因此堿性漆酶成為苧麻脫膠復(fù)配酶的考量之一。苧麻脫膠是在堿性中溫環(huán)境下進行的，而目前被發(fā)現(xiàn)的堿性漆酶主要用于在紡織中脫色、降解秸稈中的木質(zhì)素等方面，且大多數(shù)僅滿足堿性或高溫一個環(huán)境，同時滿足堿性、中溫以上環(huán)境的堿性漆酶數(shù)量微乎其微，且堿性中溫堿性漆酶在降解苧麻的木質(zhì)素中的應(yīng)用尚未見報道。
基于此，本發(fā)明通過酶挖掘與改造技術(shù)獲得一種熱穩(wěn)定性強的堿性中溫漆酶，并將其用于苧麻脫膠工業(yè)降解苧麻的木質(zhì)素，為苧麻脫膠工業(yè)復(fù)配酶制劑需求提供一種選擇。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種堿性漆酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
本發(fā)明提供的堿性漆酶的最適溫度為65℃，最適pH為7.5，能夠在pH6.0～10.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，與對應(yīng)的野生型堿性漆酶相比，本發(fā)明的堿性漆酶提升了近20％的熱穩(wěn)定性，并且具有更優(yōu)的輔助苧麻脫膠作用，可通過與木聚糖酶和果膠酶復(fù)配，實現(xiàn)顯著降低苧麻的殘膠率，為苧麻脫膠工業(yè)復(fù)配酶制劑需求提供了一種新選擇。
進一步，編碼所述堿性漆酶的基因。
進一步，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
進一步，包含所述基因的重組載體或重組菌株。
進一步，所述重組載體的表達載體包括pET28a。
進一步，所述重組菌株的宿主包括大腸桿菌BL21(ED3)。
進一步，所述堿性漆酶的制備方法包括如下步驟：構(gòu)建權(quán)利要求4或5所述重組表達載體并轉(zhuǎn)化至宿主細胞，獲得重組表達菌株，對所述重組表達菌株進行培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達、分離純化，得到所述堿性漆酶。
進一步，構(gòu)建所述重組表達載體包括如下步驟：
(1)篩選得到氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的堿性漆酶，合成對應(yīng)的核苷酸序列并連接至表達載體，獲得重組質(zhì)粒，所述核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；
(2)以所述重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計突變引物，進行重疊延伸PCR擴增反應(yīng)，獲得所述重組表達載體。
本發(fā)明還提供所述堿性漆酶在苧麻脫膠中的應(yīng)用。
進一步，所述堿性漆酶用于苧麻脫膠的溫度為50℃～70℃，pH為6～10。
圖1為本發(fā)明的野生型堿性漆酶及突變型堿性漆酶的SDS?PAGE分析；其中，泳道M為分子量Marker，泳道1為純化后的野生型堿性漆酶LacCT，泳道2為純化后的突變型堿性漆酶LacCT?G190P?Q254Y?G336M?D510F。
圖1
圖2為本發(fā)明野生型堿性漆酶與突變型堿性漆酶的最適溫度圖。
圖2
圖3為本發(fā)明野生型堿性漆酶與突變型堿性漆酶的最適pH圖。
圖3
圖4為本發(fā)明野生型堿性漆酶與突變型堿性漆酶的溫度穩(wěn)定性圖。
圖4
圖5為本發(fā)明野生型堿性漆酶與突變型堿性漆酶的pH穩(wěn)定性圖。
圖5
具體實施方式
如圖1至圖6所示，本發(fā)明包括制備罐1、升降氣缸3、密封蓋5、攪拌組件6、托盤8和振動組件，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行詳細描述。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。其中，采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示堿性漆酶中突變的氨基酸，如“AxxB”表示第xx位的氨基酸由野生型酶的氨基酸A替換成氨基酸B，位置的編號對應(yīng)SEQ ID No:1中野生型堿性漆酶的氨基酸序列編號。
為了獲得一種新的熱穩(wěn)定性較強的堿性中溫漆酶，使其用于苧麻脫膠工業(yè)以降解苧麻中的木質(zhì)素，為苧麻脫膠工業(yè)復(fù)配酶制劑需求提供一種選擇，發(fā)明人進行了以下酶挖掘和改造過程：
(1)以來源于極端環(huán)境且酶學(xué)性質(zhì)為耐高溫耐堿性的堿性漆酶CtLac(AVD69558.1)為探針序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blastp，收集序列相似性在40％～80％范圍內(nèi)的候選序列，共1254條，通過分子進化遺傳學(xué)分析對以上候選序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。
(2)根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，在探針序列臨近分支上的候選序列中篩選來源于極端環(huán)境并具有堿性漆酶保守結(jié)構(gòu)域的候選序列。
(3)制備步驟(2)篩選的候選序列對應(yīng)的酶并分析其酶學(xué)性質(zhì)，獲得一條候選序列LacCT(NCBI Reference Sequence登錄號：WP_007502612.1)，其與探針序列CtLac的序列相似性為64.47％。
其中，所述氨基酸序列對應(yīng)的酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì)分析過程如下：根據(jù)所述氨基酸序列，合成對應(yīng)的核苷酸序列，將所述核苷酸序列連接至表達載體，獲得重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，獲得重組菌株并進行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達和分離純化，獲得純度較高的重組蛋白；檢測重組蛋白的酶活、最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，篩選嗜熱耐堿的重組蛋白。
(4)對候選序列LacCT進行密碼子優(yōu)化，全基因合成獲得優(yōu)化后的LacCT序列即堿性漆酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。
(5)利用AlphaFold2從頭計算獲得LacCT序列的預(yù)測模型，利用Fireprot服務(wù)器基于能量計算和基于序列進化預(yù)測熱穩(wěn)定性提高的突變位點，在排除活性中心附近的位點后，獲得38個突變位點。
基于上述理論分析，發(fā)明人根據(jù)探針酶篩選獲得了氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型堿性漆酶LacCT，然后對該野生型堿性漆酶進行結(jié)構(gòu)預(yù)測，獲得38個的可能提升酶的熱穩(wěn)定性的突變位點。
對38個突變位點進行定點突變并制備相應(yīng)的突變型堿性漆酶，檢測突變型堿性漆酶的酶學(xué)性質(zhì)，篩選出4個熱穩(wěn)定性提高的正向突變體。將獲得的四個正向突變體進行組合突變，得到11種組合突變體，制備并檢測這11種組合突變體的酶學(xué)性質(zhì)，篩選得到一個熱穩(wěn)定性最佳的四點組合突變體LacCT?G190P?Q254Y?G336M?D510F，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
其中，單體突變和組合突變的堿性漆酶突變體的制備和篩選方法包括如下步驟：
(1)篩選得到氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型堿性漆酶LacCT，合成對應(yīng)的核苷酸序列并連接至表達載體，獲得重組質(zhì)粒，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
(2)以步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計突變引物，進行定點突變PCR擴增反應(yīng)，獲得單體突變的重組表達載體并轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，獲得重組表達菌株；
(3)對步驟(2)獲得的重組菌株進行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達，然后離心收集菌體，提取胞內(nèi)表達的重組蛋白并進行分離純化；
(4)檢測步驟(3)獲得的重組蛋白的酶活、最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，篩選得到四個使重組蛋白熱穩(wěn)定性提升的突變位點；
(5)步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒為模板，利用步驟(4)篩選的突變位點所對應(yīng)的突變引物進行PCR擴增反應(yīng)，重復(fù)步驟(2)～(4)，篩選得到熱穩(wěn)定性顯著提升的組合突變重組蛋白，即突變型堿性漆酶LacCT?G190P?Q254Y?G336M?D510F。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
本發(fā)明實施例中的全基因合成皆由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。
本發(fā)明實施例中的DNA測序由廣州擎科生物公司完成。
本發(fā)明實施例所用試劑如下：
LB液體培養(yǎng)基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％ NaCl，121℃高壓滅菌20min。
TB培養(yǎng)基：將12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油溶解在0 .9L水中并進行高壓滅菌。待培養(yǎng)基冷卻到60℃，加入100mL滅菌的KH2PO4/K2HPO4的溶液。
KH2PO4/K2HPO4的溶液：2.31g KH2PO4和12.54g K2HPO4溶在足量的水中，使終體積為100mL，121℃高壓滅菌20min。
本發(fā)明實施例中所使用的其他材料、試劑等，如無特別說明，為從商業(yè)途徑得到的材料和試劑；未注明具體條件的實驗方法，通常按照制造廠商所建議的條件。
實施例1：野生型堿性漆酶的制備
(1)重組質(zhì)粒pET28a?LacCT的構(gòu)建
通過NCBI獲得嗜熱嗜堿卡式桿菌來源的候選序列LacCT，其氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示。將候選序列LacCT進行密碼子優(yōu)化后得到如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列，全基因合成優(yōu)化后的核苷酸序列并亞克隆到大腸桿菌基因表達載體pET28a，得到重組質(zhì)粒pET28a?LacCT。
(2)菌落PCR鑒定和測序
將重組質(zhì)粒pET28a?LacCT轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細胞，將細胞涂布在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。從平板中挑取陽性單菌落進行菌落PCR初步鑒定和DNA測序，得到重組質(zhì)粒pET28a?LacCT。將含有正確重組質(zhì)粒的克隆菌株E.coli Top10/pET28a?LacCT加50％甘油于?80℃保存。
(3)酶的誘導(dǎo)表達及純化
將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET28a?LacCT加入E .coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，輕輕吹打混勻，冰浴5min。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。
將重組表達菌株接種到10mL的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)菌液按1:100接種到500mL的LB液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～1，加入終濃度為0.5mM的誘導(dǎo)劑IPTG，并將培養(yǎng)基置于16℃，200rpm過夜誘導(dǎo)表達。
誘導(dǎo)表達結(jié)束后，離心收集菌體，向離心好的菌沉淀中分別加入一定體積的Tris?HCl buffer并用超聲波破碎細胞，然后離心以提取、收集胞內(nèi)表達的重組蛋白。用Ni2+柱對重組蛋白進行純化，獲得野生型堿性漆酶WT(LacCT )。
實施例2：突變型堿性漆酶的制備
(1)重組質(zhì)粒pET28a?G190P?Q254Y?G336M?D510F的構(gòu)建
對核苷酸序列如SEQ ID No:3所示的野生型堿性漆酶LacCT基因進行組合突變，得到堿性漆酶突變體，具體步驟如下：以表1所示序列為引物，pET28a?LacCT為模板，通過重疊延伸PCR獲得完整的引入突變位點的突變基因。
表1 引入突變堿基的引物及其序列
(2)菌落PCR鑒定和測序
用QIAquick Gel Extration Kit試劑盒對步驟(1)所得PCR產(chǎn)物進行切膠回收和純化，用Dpn I消除原始模板，然后轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細胞，將細胞涂布在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。從平板中挑取陽性單菌落進行菌落PCR初步鑒定和DNA測序，得到重組質(zhì)粒pET28a?G190P?Q254Y?G336M?D510F。將含有正確重組質(zhì)粒的克隆菌株E.coli Top10/pET28a?G190P?Q254Y?G336M?D510F加50％甘油于?80℃保存。
(3)酶的誘導(dǎo)表達及純化
將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET28a?G190P?Q254Y?G336M?D510F加入E .coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，輕輕吹打混勻，冰浴5min。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。
將重組表達菌株接種到LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)菌液接種到的LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～1，加入誘導(dǎo)劑IPTG，于16℃，200rpm過夜誘導(dǎo)表達。
誘導(dǎo)表達結(jié)束后，離心收集菌體，向離心好的菌沉淀中分別加入Tris?HCl buffer并用超聲波破碎細胞，然后離心以提取、收集胞內(nèi)表達的重組蛋白。用Νi2+柱對重組蛋白進行純化，獲得突變型堿性漆酶Mutant(LacCT?G190P?Q254Y?G336M?D510F)，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2，編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:4。
效果例1：野生型和突變型堿性漆酶的酶學(xué)性質(zhì)測定
(1)堿性漆酶的酶活測定
堿性漆酶的酶活測定以愈創(chuàng)木酚(465＝12100M?1cm?1)為底物，反應(yīng)體系為：適度稀釋的酶液，終濃度2mM的愈創(chuàng)木酚，終濃度10μM的CuSO4，用50mM Tris?HCl緩沖液補充反應(yīng)體系體積至1mL；測定條件為：利用酶標儀檢測堿性漆酶與底物反應(yīng)5min前后在465nm處吸光值的變化，以計算堿性漆酶活力。
將每分鐘催化氧化1μmol底物所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。
堿性漆酶酶活力單位計算公式如下：酶活(U/L)＝n×Vt× Δ OD/(×5×Ve/106)。式中n為酶液稀釋倍數(shù)；Vt為酶反應(yīng)體系的總體積；Ve為酶反應(yīng)體系中酶液體積；ΔOD為反應(yīng)前后吸光值的變化；為底物的摩爾吸光系數(shù)。
(2)最適溫度的測定
以愈創(chuàng)木酚為底物，在最適pH條件下，測定不同溫度條件下野生型和突變型堿性漆酶的酶活力，以最高酶活為100％計算相對酶活。
參閱圖2，突變型堿性漆酶Mutant(LacCT ?G190P?Q254Y?G336M?D510F)的最適溫度與野生型堿性漆酶WT(LacCT)的最適溫度均為65℃。
(3)最適pH的測定
以愈創(chuàng)木酚為底物，在酶的最適反應(yīng)溫度下，測定pΗ值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5時野生型和突變型堿性漆酶的酶活力，以最高酶活為100％計算相對酶活。
參閱圖3，突變型堿性漆酶Mutant的最適pH與野生型堿性漆酶WT的最適pH均為7.5。
(4)溫度穩(wěn)定性的測定
取適當(dāng)稀釋的酶液，在60℃分別處理15、30、45、60min后，以愈創(chuàng)木酚為底物測定酶的殘余活性，以未經(jīng)熱處理酶液的酶活為100％計算相對酶活。
參閱圖4，與野生型堿性漆酶WT相比，突變型堿性漆酶Mutant的熱穩(wěn)定性顯著提升。60℃處理30min后，野生型堿性漆酶WT剩余52％的殘余活性，而突變型堿性漆酶Mutant剩余74％的殘余活性。60℃處理60min后，野生型堿性漆酶WT僅剩余34％的殘余活性，而突變型堿性漆酶Mutant還剩余53％的殘余活性。因此，突變型堿性漆酶Mutant在原有的野生型堿性漆酶WT的基礎(chǔ)上提高了近20％的熱穩(wěn)定性。
(5)pH穩(wěn)定性的測定
分別用50mmol/L檸檬酸緩沖液(pH4.0～6.0)、50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0～8.0)、50mmol/L Tris?HCl緩沖液(pH7.0～9.0)和50mmol/L甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH9.0～10.0)配制酶液，使反應(yīng)體系的pH在4.0～10.0范圍內(nèi)，將上述反應(yīng)體系置于4℃孵育12h，測定酶的殘余活性，以最高酶活為100％計算相對酶活。
參閱圖5，野生型及突變型堿性漆酶在pH6.0～10.0范圍內(nèi)保持超過85％以上的活性，因此野生型及突變型堿性漆酶具有相似的pH穩(wěn)定性，可以在較寬的pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。
效果例2：野生型和突變型堿性漆酶的苧麻脫膠分析
堿性漆酶能夠有效降解苧麻中難以去除的木質(zhì)素，利于纖維分離從而可應(yīng)用于苧麻脫膠，但苧麻中木質(zhì)素含量僅為4％左右，采用單一堿性漆酶進行脫膠時脫膠效果微弱，因此將堿性漆酶與常用的果膠酶、木聚糖酶復(fù)配，共同用于苧麻脫膠。
(1)苧麻脫膠工藝流程
實驗共分為4組，實驗組1為未經(jīng)苧麻脫膠工藝處理的原麻，實驗組2～4的區(qū)別在于酶脫膠過程所用復(fù)合酶的種類不同，其中，實驗組2僅使用果膠酶和木聚糖酶復(fù)配，實驗組3使用野生型堿性漆酶WT、木聚糖酶和果膠酶復(fù)配，實驗組4使用突變型堿性漆酶Mutant、木聚糖酶和果膠酶復(fù)配。
使用上述復(fù)合酶進行苧麻脫膠的工藝流程如下：將苧麻進行5次機械碾壓，然后于5g/L尿素、3g/LJFC?6溶液中浸漬24h，苧麻和溶液的浴比為1:10，將浸漬后的苧麻置于軟墊上用橡膠錘反復(fù)敲打至纖維分散，然后將10g苧麻纖維按浴比1:10完全浸沒于生物復(fù)合酶溶液中，在50℃浸泡16h，所述生物酶復(fù)合溶液為16g/L果膠酶、8g/L木聚糖酶和1.5U/mL野生型或突變型堿性漆酶復(fù)配，溶于含1g/LJFC?6的50mMTris?HCl緩沖液(pH7.5)。其中，實驗組2不含堿性漆酶，僅為果膠酶和木聚糖酶復(fù)配。
然后對苧麻纖維進行堿氧處理：將苧麻纖維置于含6mL/L30％H2O2，4g/LNaOH，3g/LTF?122H的溶液中，將溫度從40℃升溫到60℃；然后加入6mL/L30％H2O2，將溫度從60℃升溫到98℃并保溫30min后，使用80～85℃熱水洗麻；然后將苧麻置于2g/L乙酸浸泡10min后水洗；再將苧麻置于2g/LJMN?6，50℃浸漬10min后水洗。將堿氧處理后的苧麻置于5g/L乳化油JM?D1、5g/L乳化油JM?D2中，于40℃保溫45min，浴比1：10，然后進行烘干處理。
(2)失重率和殘膠率測定
將原麻烘至恒重，冷卻后稱重(記為m0)，經(jīng)過脫膠處理后將其再次烘干，記錄脫膠后苧麻的干重(記為m1)，計算失重率，失重率＝(m0?m1)/m0×100％。
另外，參考GB/T18147.2—2008《大麻纖維試驗方法第2部分：殘膠率試驗方法》測定苧麻纖維的殘膠率。
(3)束纖維強度測定
將脫膠后的苧麻纖維在(21±1)℃、濕度65％±2％調(diào)濕24h后，用鋼梳(10根/cm)對纖維進行梳理使其平行順直；將束纖維切割至10cm，稱量后計算束纖維細度，再采用YG(B)?026D?250型電子織物強力機(溫州大榮)測試強度，拉伸速率為300mm/min，拉伸隔距為25mm。
(4)束纖維白度測定
根據(jù)GB/T5885—1986《苧麻纖維白度試驗方法》，整理試樣麻束，去除麻結(jié)，使纖維平直，在WSDⅢ型織物白度儀(北京康光儀器有限公司)上測定苧麻纖維的藍光白度。
參閱表4，與實驗組2相比，實驗組3～4即加入堿性漆酶復(fù)配的復(fù)合酶脫膠處理顯著降低苧麻的殘膠率，同時將苧麻的束纖維強度保持同樣水平，說明酶脫膠處理時加入堿性漆酶可將苧麻中木質(zhì)素去除，利于纖維分離，從而更有利于膠質(zhì)的去除。
實驗組4的苧麻白度和束纖維強度與實驗組3保持一致水平，但與實驗組3相比，其殘膠率更低，說明突變型堿性漆酶Mutant(LacCT?G190P?Q254Y?G336M?D510F)比野生型堿性漆酶WT輔助脫膠效果更優(yōu)。
表4不同酶復(fù)配處理對苧麻纖維性能的影響
綜上，本發(fā)明提供的野生型及突變型堿性漆酶屬于堿性中溫酶，其最適溫度為65℃，最適pH為7.5并且能夠在較寬的pH范圍內(nèi)(即pH6.0～10.0)保持穩(wěn)定，其中突變型堿性漆酶在野生型堿性漆酶的基礎(chǔ)上提升了近20％的熱穩(wěn)定性。另外，本發(fā)明的野生型或突變型堿性漆酶可與木聚糖酶和果膠酶復(fù)配用于堿性中溫環(huán)境下的苧麻脫膠工藝，實現(xiàn)顯著降低苧麻的殘膠率，因此本發(fā)明的野生型或突變型堿性漆酶具有輔助苧麻脫膠的作用，為苧麻脫膠工業(yè)復(fù)配酶制劑需求提供了一種新選擇，其中，突變型堿性漆酶輔助苧麻脫膠的效果比野生型堿性漆酶更優(yōu)。
以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準。
