摘 要：目的 對工業(yè)大麻植株花葉和大麻加工產(chǎn)品中的Δ9-四氫大麻酚進行提取分離，建立Δ9-THC的液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）定性定量檢驗方法和液相色譜（LC）定量檢驗方法。方法 樣品自然晾干后經(jīng)過研磨，加入甲醇提取后進樣分析，采用ACQUITYUPLC®BEHC18色譜柱，液相色譜以水、乙腈進行梯度洗脫，檢測波長：215nm，帶寬：4.8nm。液相色譜-質(zhì)譜以0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈進行梯度洗脫，電噴霧離子源、掃描方式：正離子模式，多個特征離子對進行定性分析，外標標準曲線法進行定量分析。結(jié)果 工業(yè)大麻植株花葉和大麻加工產(chǎn)品在液相色譜中Δ9-THC在0.001~0.1mg/mL范圍內(nèi)線性良好，液相色譜-質(zhì)譜中在5~100ng/mL的范圍內(nèi)線性良好，R2均>0.999。液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用檢驗方法的測量值相對誤差均在±2%以內(nèi)，精密度均<2%。結(jié)論 本文建立的方法可應用于工業(yè)大麻植株花葉和大麻加工產(chǎn)品中Δ9-THC的檢驗，可為實驗室針對工業(yè)大麻植株花葉和大麻加工產(chǎn)品中四氫大麻酚的檢驗提供技術(shù)支持。
關(guān)鍵詞:法醫(yī)毒物分析；Δ9-四氫大麻酚；工業(yè)大麻；液相色譜；液相色譜-質(zhì)譜
我國是大麻的重要起源地之一，不僅擁有豐富的野生資源，同時也是最早栽培利用大麻的國家，資源類型非常豐富。工業(yè)大麻是指四氫大麻酚含量低于0.3%的大麻屬原植物及其提取產(chǎn)品。隨著工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)化的快速發(fā)展，工業(yè)大麻中四氫大麻酚含量的檢測技術(shù)面臨著新的挑戰(zhàn)。由于工業(yè)大麻中四氫大麻酚含量甚微，采用毒品大麻的檢驗方法很不適用，常出現(xiàn)氣相色譜法與液相色譜法定量結(jié)果相互矛盾的問題，專門針對工業(yè)大麻檢測技術(shù)的標準尚未建立，凸顯了公安機關(guān)對工業(yè)大麻監(jiān)管工作的鑒定技術(shù)滯后和管理力量比較薄弱的問題。
目前，對大麻毒品的溯源，可采用DNA分子手段對大麻的DNA分型和遺傳相關(guān)信息進行研究[1,2]，主流的大麻快速檢測方法有免疫膠體金法和量子點熒光免疫層析法。大麻實驗室檢驗鑒定主要依靠氣相色譜法（GC）[3,4]、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[5]和液相色譜法（LC）[6-9]，但由于GC分析時需要衍生化將酸性大麻素熱脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)橹行源舐樗?，分析結(jié)果通常是酸性和中性大麻素的總和，因此存在一定的局限性。由于大麻素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，使HPLC分析時難以準確分離所有的大麻素，因此近年來常常與質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）[10,11]實現(xiàn)對大麻素類物質(zhì)的精確、快速定量分析。LC-MS分析不需對樣品進行衍生化處理，可同時實現(xiàn)對中性和酸性大麻素的準確定性定量，該項技術(shù)在大麻植物和大麻制品的檢測中具有廣闊的應用前景。目前暫無檢驗工業(yè)大麻植株花葉和大麻加工產(chǎn)品中的Δ9-四氫大麻酚的LC-MS定性定量檢驗方法和LC定量檢驗方法，建立該方法可切實加強工業(yè)大麻種植及其加工產(chǎn)業(yè)的監(jiān)督管理，推進依法行政，嚴密防范工業(yè)用大麻流入非法制毒渠道，消除毒品危害，推動工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。
1實驗部分
1.1儀器和試劑
ACQUITYUPLC超高相液相色譜儀，ACQUITYUPLC-TQS超高相液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱：ACQUITYUPLC®BEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）（美國沃特世公司），刀式研磨儀（德國萊馳）。
甲醇、乙腈（色譜純、德國Merck公司），甲酸（色譜純、德國Honeywell公司），純水（由Milli-Q制備、德國Merck公司）。
1.2標準溶液的配制
1mg/mL的單一標準物質(zhì)儲備溶液（甲醇）：-18℃保存，有效期使用期限。0.1mg/mL的混合標準物質(zhì)工作溶液：分別移取1mg/mL的單一標準物質(zhì)儲備溶液，用甲醇配置成0.1mg/mL的混合標準物質(zhì)工作溶液，密封，-18℃避光保存，有效期6個月。1μg/mL的混合標準物質(zhì)工作溶液∶移取0.1mg/mL的混合標準物質(zhì)工作溶液，用甲醇配置成1μg/mL的混合標準物質(zhì)工作溶液，0℃~4℃冷藏避光保存，有效期1個月。
1.3樣品前處理
1.3.1選取和晾干
選取工業(yè)大麻植株頂端30cm長度內(nèi)的花葉組織，置于陰涼處晾干，充分脫水后備用。
1.3.2粉碎研磨
將晾干后的植物置于刀式研磨儀內(nèi)，充分研磨成細粉狀，保證樣本均勻性備用。
1.3.3提取
稱量適量研磨后的植物樣本檢材，置于50mL離心管內(nèi)后加入甲醇溶液，超聲、振蕩、離心后提取上清液，濾膜過濾至2mL進樣瓶，得到樣本提取液。大麻加工產(chǎn)品如大麻啤酒、大麻油等，直接稱量或移取部分檢材，置于50mL離心管內(nèi)后加入甲醇溶液，同上述步驟操作。
1.3.4進樣
樣本提取液可直接進行進樣分析。
1.4前處理方法優(yōu)化
1.4.1提取液考察
分別考察了水、甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正己烷、環(huán)己烷、異丙醇、正庚烷9種不同溶劑對Δ9-THC的提取效果（圖1），綜合考慮基線穩(wěn)定、雜質(zhì)量、重復性等因素，選擇甲醇作為最佳提取溶劑。
圖1不同溶劑相對提取效率
1.4.2提取方式和時間考察
本研究對超聲和振蕩時間進行了考察，平行稱取均質(zhì)化后的樣品，分別對超聲5min、10min、15min、20min、25min、30min的提取效果進行了考察。結(jié)果顯示，在超聲10min后提取效率沒有明顯提升，最終選擇超聲10min。對振蕩的時間進行了考察，通過比較分別振蕩了10min、20min、30min、40min后的提取效果，發(fā)現(xiàn)振蕩30min后提取效果最好，且實驗偶然發(fā)現(xiàn)，在有陽光光照環(huán)境下振蕩時，會顯著降低Δ9-THC含量，懷疑是陽光直照射造成的影響，建議在避免陽光照射條件下進行振蕩實驗。
1.5液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜法
1.5.1色譜條件
液相色譜分析：色譜柱：ACQUITYUPLC®BEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)（美國沃特世公司）
流動相：A：水，B：乙腈。梯度洗脫程序：0~5min，25%A；5~6min，0%A；6~8min，0%A；8~9min，25%A；9~11min，25%A。柱溫：35℃;進樣體積：1μL；流速：0.3mL/min；檢測波長：215nm，帶寬：4.8nm。
液相色譜質(zhì)譜分析：色譜柱：ACQUITYUPLC®BEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)（美國沃特世公司）。
流動相：A：0.1%甲酸水，B：0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序：0~5min，25%A；5~6min，0%A；6~8min，0%A；8~9min，25%A；9~11min，25%A。柱溫：35℃;進樣體積：1μL；流速：0.3mL/min。
1.5.2質(zhì)譜參數(shù)
離子源：電噴霧離子源，掃描方式：正離子模式；毛細管電壓：3000V；離子源溫度：150℃;去溶劑氣：995L/h；去溶劑氣溫度：500℃;錐孔氣：150L/h，碰撞氣為氬氣。主要化合物質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。
表1質(zhì)譜參考條件
注：*定量離子
2方法學驗證
2.1選擇性
在選定的色譜條件下，液相色譜Δ9-THC的最佳吸收波長為215nm。液相色譜-質(zhì)譜分析中采用正離子模式掃描，Δ9-THC出峰時間為2.3min，空白溶劑無色譜峰干擾。
2.2檢出限、定量限和線性范圍
2.2.1檢出限和定量限
在液相色譜條件下，根據(jù)10倍信噪比計算，Δ9-THC方法的定量限為0.50μg/mL。在液相色譜-質(zhì)譜條件下，由于工業(yè)大麻規(guī)范中要求其THC總量低于0.3%即可認定為工業(yè)大麻，因為液相色譜-質(zhì)譜方法檢測靈敏度高，為降低儀器污染等客觀因素，根據(jù)10倍信噪比計算將Δ9-THC的檢出限和定量限均定為1.0ng/mL。
2.2.2線性范圍
分別配制濃度為0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL、0.001mg/mL和5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、100ng/mL的Δ9-THC標準溶液，以上樣品各進行檢驗三次。以標準溶液峰面積平均值為Y軸，以標準溶液濃度為X軸，進行線性擬合。Δ9-THC在0.001mg/mL~0.1mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，R2=0.99994（圖2）。
圖2Δ9-THC液相標準工作曲線
液相色譜-質(zhì)譜中Δ9-THC在5ng/mL~100ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，R2=0.99961（圖3）。
圖3 Δ9-THC液相色譜-質(zhì)譜標準工作曲線
2.3準確度和穩(wěn)定性
2.3.1準確度
LC-UV采用外標標準曲線法測量0.05mg/mLΔ9-THC，進樣10次，含量結(jié)果準確，測量值相對誤差在±2%以內(nèi)（表2）。
表2 LC-UV方法準確度
LC-MS采用外標標準曲線法測量50ng/mLΔ9-THC，進樣10次，含量結(jié)果準確，測量值相對誤差在±2%以內(nèi)（表3）。
表3 LC-MS方法準確度
2.3.2精密度和穩(wěn)定性
LC-UV在不同時間用標準工作曲線測定0.05mg/mL的Δ9-THC標準溶液濃度，方法精密度良好，RSD為0.66%。
LC-MS在不同時間用標準工作曲線測定50ng/mL的Δ9-THC標準溶液濃度，方法精密度良好，RSD為1.18%。
3討論與結(jié)論
應用本研究建立的液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜檢驗方法，分別對工業(yè)大麻及其加工產(chǎn)品中的Δ9-THC含量進行檢測，兩種檢測方法的結(jié)果相對相差為0.06%，兩種方法相互進行了驗證，確保了檢驗結(jié)果的準確性。
目前，國內(nèi)尚沒有針對工業(yè)大麻植株花葉和大麻加工產(chǎn)品中Δ9-THC分別進行定性定量的檢驗標準，本研究在國內(nèi)尚屬首次提出，具有較好的推廣應用價值，對貫徹落實國家禁毒委“關(guān)于加強工業(yè)大麻管控工作的通知”要求，嚴防四氫大麻酚含量高于0.3%而流入非法渠道，提升公安機關(guān)對工業(yè)大麻種植和加工的監(jiān)管能力水平，具有重要的社會意義。
參考文獻
［1］Yamamuro T, Miyamoto S, Kitamura M, et al .Development of simple and accurate detection systems for Cannabis sativa using DNA chromatography[J] . Forensic Sci Int, 2018, 291(18): 68-75.
［2］AnabalonL, Solano J, Encina-montoya F, et al. Cannabis seeds authentication by chloroplast and nuclear DNA analysis coupled with high-resolution melting method for quality control purposes[J]. Cannabis Cannabinoid, 2022, 7(4): 548-556.
［3］NaharL, Guo M, Sarker S D. Gas chromatographic analysis of naturally occurring cannabinoids: Areview of literature published during the past decade[J]. Phytochem Analysis, 2020, 31(2): 135-146.
［4］Baranauskaite J, Marksa M, Icanauskas L, et al . Development of extraction technique and GC/FID method for the analysis of cannabinoids in Cannabis sativa L. spp. santicha (hemp)[J]. Phytochem Analysis, 2020, 31(4): 516-521.
［5］He wav ithar an a A K, Golding G, Tempany G, et al . Quantitative GC-MS Analysis of Δ9-Tetrahydrocannabinol in fiber hemp varieties[J]. J Anal Toxicol, 2005, 29(4): 258-261.
［6］Pellati F,Brighenti V, Sperlea J, et al. New methods for the comprehensive analysis of bioactive compounds in cannabis sativa L. (hemp)[J]. Molecules, 2018, 23(10):26-39.
［7］Montero L , MeckelmannSW,KimH , etal . Differentiation of industrial hemp strains by their cannabinoid and phenolic compounds using LC × LCHRMS[J]. Anal Bioanal Chem, 2022, 414(18): 5445-5459.
［8］陳丹丹,彭興盛,鄭榮 . 基于大麻二酚及△ ~9-四氫大麻酚含量的化妝品質(zhì)量研究 [J]. 藥物分析雜志,2022, 42(2): 346-351.
［9］朱敏航,周靖,徐云輝,等 . HPLC 法測定國內(nèi)工業(yè)大麻花葉原料中四氫大麻酚、大麻二酚和大麻二酚酸的含量 [J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2022, 53(1): 95-100.
［10］趙志東,余麗宇,孟嬌,等 . 固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定尿液中四氫大麻酚和Δ~9-四氫大麻酸的含量 [J]. 理化檢驗（化學分冊）,2023, 59(10): 1156-1161.
［11］陳順琴,唐美,黃江,等 . 超聲提取-超高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法測定毛發(fā)中常見毒品及代謝物的含量 [J]. 理化檢驗（化學分冊）,2022, 58(1): 58-64.
文章摘自：劉悅鑫,聞武,賈群,等.UPLC和UPLC-MS/MS法檢驗工業(yè)大麻及其加工產(chǎn)品中Δ~9-四氫大麻酚[J].中國法醫(yī)學雜志,2024,39(03):335-338+367.DOI:10.13618/j.issn.1001-5728.2024.03.016.
