摘 要：本發(fā)明涉及植物提取和發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種雙向調(diào)節(jié)雌激素的亞麻籽提取物的制備方法及其產(chǎn)品。本發(fā)明通過選取亞麻籽的特定部位，采用微生物發(fā)酵配合特定的方法提取，得到富含亞麻木酚素的產(chǎn)物，其提取純度和提取率較高。同時(shí)產(chǎn)物經(jīng)小鼠實(shí)驗(yàn)，表明具有顯著的雙向調(diào)節(jié)雌激素水平的功效。
1.一種亞麻籽提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
取亞麻籽，通過需氧發(fā)酵，堿水溶液提取發(fā)酵液，然后過濾，添加酸性物質(zhì)調(diào)整pH為6.5?7.5后干燥后得到麻籽提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻籽提取物的制備方法，其特征在于，所述亞麻籽的部位為亞麻籽殼皮和/或亞麻籽粕。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻籽提取物的制備方法，其特征在于，所述液態(tài)需氧發(fā)酵的菌種為酵母菌和芽孢桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的亞麻籽提取物的制備方法，其特征在于，所述液態(tài)需氧發(fā)酵的條件為：通氧，溫度為25?37℃，時(shí)間為12?24h。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的亞麻籽提取物的制備方法，其特征在于，所述酵母菌和芽孢桿菌的質(zhì)量比為1：1?3；
所述菌種的添加量為發(fā)酵底物質(zhì)量的0.5?2wt％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻籽提取物的制備方法，其特征在于，所述酸性物質(zhì)為以下物質(zhì)中的至少一種：
檸檬酸，醋酸、維生素C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻籽提取物的制備方法，其特征在于，堿水溶液提取的條件為pH為9?12的堿水溶液；溫度為50?70℃；
所述堿水溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸氫鈉溶于水后形成的溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻籽提取物的制備方法，其特征在于，所述過濾為先通過纖維膜過濾后通過超濾膜超濾，超濾后濃縮。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻籽提取物的制備方法，其特征在于，所述干燥為噴霧干燥或冷凍干燥。
10.一種產(chǎn)品，其特征在于通過權(quán)利要求1?9的制備方法所制備得到。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及亞麻籽晾曬技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種亞麻籽懸磁晾曬機(jī)及其使用方法。本發(fā)明涉及植物提取和發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種雙向調(diào)節(jié)雌激素的亞麻籽提取物的制備方法及其產(chǎn)品。
亞麻在全球溫帶地區(qū)廣泛種植 使木酚素提取原料充足。僅我國亞麻的年種植面積已達(dá)300?400萬畝，每年出口62萬噸。亞麻的種植與產(chǎn)品加工業(yè)在國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。而木酚素的開發(fā)利用研究己經(jīng)受到高度重視國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)木酚素作為天然植物提取物是非活性物質(zhì)，它在哺乳動(dòng)物腸道微生物的作用下生成腸二醇和腸內(nèi)醋后才成為活性物質(zhì)。木酚素在亞麻中的高含量及其具有的雌激素效應(yīng)、抗癌、抗腫瘤和預(yù)防糖尿病等方面的藥效成為了天然產(chǎn)物研究中的焦點(diǎn)之一。美國和加拿大在研制木酚素商品上發(fā)展迅速，已經(jīng)研制出含木酚素的亞麻籽殼純品，木酚素粉末產(chǎn)品、膠囊，含木酚素的亞麻籽油膠囊。在化妝品中也添加木酚素，利用其抗氧化性用于防治濕疹、座瘡、皮膚干燥等。亞麻籽木酚素是在提取亞麻膠和榨取亞麻油的廢渣的基礎(chǔ)上再次開發(fā)利用。
亞麻籽中主要含有開環(huán)異落葉松樹脂酚(SECO)和烏臺(tái)樹脂酚(MAT)。通常SECO是以如圖所示開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷SDG(附圖1)的形式存在的。SDG存在兩種空間異構(gòu)體。木酚素為無色晶體，能溶于水、甲醇、含水乙醇和丙醇，并易被酶和酸水解。
亞麻木酚素，以開環(huán)異落葉松樹脂素酚二葡萄糖苷(secoisolariciresinoldiglucoside，SDG)及開環(huán)異落葉松樹脂素酚(secoisolarciresinol，SECO)為主。亞麻木酚素主要存在于亞麻籽外種皮骨細(xì)胞的次生細(xì)胞壁中，只有約8％存在于胚乳細(xì)胞。
亞麻木酚素作為一種天然植物雌激素具有多種生物學(xué)作用在抗癌、抗腫瘤、抗心血管疾病等方面具有顯著藥效有重要的利用價(jià)值和廣闊的市場前景。
SECO(或SDG)和MAT在人體或動(dòng)物的胃腸道內(nèi)會(huì)被兼性需氧微生物作用轉(zhuǎn)化為能被人體吸收利用的活性動(dòng)物木酚素:腸內(nèi)脂和動(dòng)物木酚素腸二醇如附圖2所示。
木酚素可以降低婦女絕經(jīng)后的乳腺癌發(fā)病率。
雌性激素可以緩解更年期女性絕經(jīng)后荷爾蒙代謝，Hutchins等人發(fā)現(xiàn)在更年期女性食物中補(bǔ)充亞麻木酚素可以減少雌二醇和硫酸雌酮的含量，進(jìn)而增加血液中催乳激素的濃度。Abe等人研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)期女性通過食用添加亞麻木酚素的食品，可以很大程度上改善了因絕經(jīng)導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松、高血脂、高血壓、肥胖等癥狀。
因此，有必要開發(fā)含有高含量亞麻木酚素的相關(guān)產(chǎn)品。
針對前述問題，本發(fā)明提供了一種雙向調(diào)節(jié)雌激素的亞麻籽提取物的制備方法及其產(chǎn)品，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
一種亞麻籽提取物的制備方法，包括以下步驟：
取亞麻籽，通過需氧發(fā)酵，堿水溶液提取發(fā)酵液，然后過濾，添加酸性物質(zhì)調(diào)整pH為6.5?7.5后干燥后得到麻籽提取物。
優(yōu)選的，所述亞麻籽的部位為亞麻籽殼皮和/或亞麻籽粕。
優(yōu)選的，所述液態(tài)需氧發(fā)酵的菌種為酵母菌和芽孢桿菌；所述液態(tài)需氧發(fā)酵的條件為：通氧，溫度為25?37℃，時(shí)間為12?24h；所述酵母菌和芽孢桿菌的質(zhì)量比為1：1?3；所述菌種的添加量為發(fā)酵底物質(zhì)量的0.5?2wt％。
優(yōu)選的，所述酸性物質(zhì)為以下物質(zhì)中的至少一種：
檸檬酸，醋酸、維生素C。
優(yōu)選的，堿水溶液提取的條件為pH為9?12的堿水溶液；溫度為50?70℃；
所述堿水溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸氫鈉溶于水后形成的溶液。
優(yōu)選的，所述過濾為先通過纖維膜過濾后通過超濾膜超濾，超濾后濃縮。
優(yōu)選的，所述干燥為噴霧干燥或冷凍干燥。
一種產(chǎn)品，通過前述的制備方法所制備得到。
本發(fā)明中：
發(fā)酵工藝：利用需氧發(fā)酵提高亞麻木酚素含量：亞麻籽中的亞麻木酚素含量可以通過微生物發(fā)酵得到提升。酵母菌和芽孢桿菌的共同作用可能會(huì)激活亞麻籽中的酶系統(tǒng)，促進(jìn)亞麻木酚素的釋放和合成，同時(shí)還能加速水解，釋放亞麻籽自身的亞麻木酚素。
發(fā)酵條件優(yōu)化：通過控制通氧、溫度和時(shí)間以及酵母菌和芽孢桿菌的比例，可以優(yōu)化發(fā)酵過程，提高亞麻木酚素的產(chǎn)量和純度。
堿水溶液提取效率高：以有效溶解亞麻木酚素，同時(shí)較低的溫度有利于減少熱敏感物質(zhì)的破壞。
雙重過濾工藝：先用纖維膜過濾去除大顆粒雜質(zhì)，再用超濾膜進(jìn)一步凈化，可以有效地分離出目標(biāo)成分，同時(shí)保留亞麻木酚素的活性。
濃縮過程：超濾后的濃縮步驟可以增加提取物的濃度，減少后續(xù)干燥過程中的能耗。
干燥方式多樣性：采用噴霧干燥或冷凍干燥兩種干燥方式，可以根據(jù)最終產(chǎn)品的需求選擇合適的干燥方法，噴霧干燥適用于大規(guī)模生產(chǎn)，而冷凍干燥則能更好地保持亞麻木酚素的活性和穩(wěn)定性。
提取亞麻籽的非傳統(tǒng)部位：通常亞麻籽的油脂被廣泛提取利用，但本發(fā)明使用亞麻籽殼皮和/或亞麻籽粕，這些部位可能含有未充分利用的亞麻木酚素，通過特定的提取工藝可以更充分地利用亞麻籽資源。
本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面：
本發(fā)明通過選取亞麻籽的特定部位，采用微生物發(fā)酵配合特定的方法提取，得到富含亞麻木酚素的產(chǎn)物，其提取純度和提取率較高。同時(shí)產(chǎn)物經(jīng)小鼠實(shí)驗(yàn)，表明具有顯著的雙向調(diào)節(jié)雌激素水平的功效。
附圖說明
圖1為亞麻木酚素(SDG)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
圖1
圖2為司可異羅葉松酯素(SECO)與烏臺(tái)樹脂酚((MAT)在人體內(nèi)的代謝成腸內(nèi)脂和動(dòng)物木酚素腸二醇的路徑。
圖2
圖3為SDG標(biāo)準(zhǔn)品?2ul?280nmHPLC譜圖。
圖3
圖4為SDG標(biāo)準(zhǔn)品?DAD譜圖。
圖4
具體實(shí)施方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，其中實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
本發(fā)明中部分成分的來源如下
白假絲酵母Candidaalbicans，編號CICC1965，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；
枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis，編號CICC10732，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；
地衣芽胞桿菌Bacilluslicheniformis，編號CICC10084，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；
乳酸菌Lactiplantibacillusplantarum：編號CICC21790，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；
米曲霉Aspergillusoryzae，編號CICC2001，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；
亞麻籽(完整)、亞麻籽殼皮、亞麻籽粕：市場銷售。
一種亞麻籽提取物的制備方法，包括以下步驟：
(1)取亞麻籽原料，破碎后得原料；
(2)原料中加入菌種、亞麻籽原料質(zhì)量5wt％的水；攪拌后保溫供氧發(fā)酵，得發(fā)酵液；
(3)發(fā)酵液通過堿水溶液水浴下攪拌提取，得提取液，堿水溶液為氫氧化鈉水溶液；
(4)提取液經(jīng)纖維膜過濾，5000道爾頓分子量截留超濾膜超濾，超濾膜透過液，再經(jīng)200道爾頓納濾膜濃縮；得濃縮液；
(5)濃縮液中加入檸檬酸，醋酸或維生素C將ph調(diào)節(jié)至6.5?7.5的范圍內(nèi)。
(6)濃縮液噴霧干燥或冷凍干燥，得到麻籽提取物。
具體的參數(shù)和成分配比如下表1所示。
表1亞麻籽提取物的制備參數(shù)
續(xù)表1亞麻籽提取物的制備參數(shù)
表1中“?”表示沒有添加或無相關(guān)步驟；發(fā)酵溫度為初始發(fā)酵溫度，同時(shí)控制整個(gè)發(fā)酵過程溫度在初始發(fā)酵溫度±1℃內(nèi)。
對比例4與實(shí)施例2的區(qū)別在于：用亞麻籽(完整)作為發(fā)酵原料。
對比例5與實(shí)施例2的區(qū)別在于：用單一酵母菌發(fā)酵。
對比例6與實(shí)施例2的區(qū)別在于：用單一芽孢桿菌發(fā)酵。
對比例7與實(shí)施例2的區(qū)別在于：用單一乳酸菌發(fā)酵。
對比例8與實(shí)施例2的區(qū)別在于：用去單一曲霉發(fā)酵。
對比例9與實(shí)施例2的區(qū)別在于：使用了較低的發(fā)酵溫度。
對比例10與實(shí)施例2的區(qū)別在于：酵母菌和芽孢桿菌的質(zhì)量比為2：1。
含量和提取率測試：
利用HPLC測量各對比例和實(shí)施例的亞麻木酚素含量，同時(shí)根據(jù)原料和產(chǎn)物的質(zhì)量比計(jì)算得率。
(1)色譜條件
Waterse2695型號HPLC，2998PDA檢測器，色譜柱：AltalantisTMT3(250mm*4.6mm,5um)；柱溫度30℃；流速1.0ml/min；檢測波長254nm，327，220，280nm；流動(dòng)相梯度表如下：
表2流動(dòng)相梯度
(2)溶液制備
對照品溶液制備：精密稱取SDG對照品約5mg于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度。
樣品溶液制備：精密稱取亞麻木酚素樣品約10mg于25mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度。
(3)樣品測定
在上述色譜條件下，進(jìn)樣測定，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中SDG的含量。
(4)結(jié)果如下所示：
實(shí)施例1：得率6.68％，純度43.7％；
實(shí)施例2：得率6.11％，純度41.2％；
實(shí)施例3：得率7.02％，純度42.6％；
對比例4：得率3.68％，純度29.4％；
對比例5：得率4.91％，純度36.2％；
對比例6：得率3.76％，純度32.6％；
對比例7：得率2.24％，純度41.7％；
對比例8：得率3.45％，純度28.4％；
對比例9：得率3.12％，純度26.2％；
對比例10：得率5.16％，純度31.9％；
對比例4由于使用的是亞麻籽(完整)作為發(fā)酵原料，由于原料中含有大量的油分，嚴(yán)重影響了不溶于脂類的亞麻木酚素得率和純度。
對比例5?8采用不同的菌種發(fā)酵，結(jié)果顯示其效果都不如酵母菌和芽孢桿菌混合發(fā)酵好。
對比例9采用較低溫度發(fā)酵，其菌種不活躍，無法提高產(chǎn)率；同時(shí)也無法發(fā)酵加快水解的方法釋放亞麻木酚素，導(dǎo)致純度也較低。
實(shí)施例1?3、對比例10采用不同比例的酵母菌和芽孢桿菌，其效果有差異，證明酵母菌和芽孢桿菌并非以任意比例混合都能進(jìn)一步提高得率。
雌激素調(diào)節(jié)測試：
1、試劑和藥品
促黃體生成激素放免試劑盒、白細(xì)胞介素?2放免藥盒、雌二醇放免試劑盒、促卵泡生成激素放免試劑盒、尼爾雌醇片(2mg/片)：市售。
亞麻籽提取物：由實(shí)施例2所制備的樣品；
2、儀器
1470型Wizard全自動(dòng)伽瑪計(jì)數(shù)器；
DK?型電熱恒溫水槽；
LDZ5?2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)；
Leica TP1020自動(dòng)脫水機(jī)。
3、動(dòng)物
SD大白鼠雌性40只，體重250～280g，雌雄各半。
4、實(shí)驗(yàn)方法
4.1.去卵巢大鼠更年期綜合征模型復(fù)制
選用雌性SD大鼠40只，體重250～280g。將實(shí)驗(yàn)鼠以乙醚麻醉，腹位固定于大鼠固定板上，并以浸透乙醚的棉球放置動(dòng)物口鼻部位維持麻醉。然后在最末肋骨下、腋中線和距脊柱外側(cè)約2cm交叉處，剪除長毛，切開皮膚和背肌約1.5～2cm，切口視野中可見一乳白色脂肪團(tuán)，卵巢即包埋其中，結(jié)扎卵巢下輸卵管，摘除雙側(cè)卵巢，術(shù)后將子宮角送回腹腔，縫針。手術(shù)后5d作陰道涂片，觀察造模后動(dòng)物動(dòng)情周期，每天1次，連續(xù)5d，挑選不顯周期性改變(即卵巢切除干凈)的大鼠為造模成功的大鼠。
4.2.評價(jià)指標(biāo)
4.2.1.動(dòng)情周期的陰道涂片細(xì)胞學(xué)變化
(1)動(dòng)情間期：主要是大量多核的白細(xì)胞，也有少量的上皮細(xì)胞。
(2)動(dòng)情前期：有大量上皮細(xì)胞，呈粒狀胞漿，尚有少量角化(無核)的上皮細(xì)胞，但無白細(xì)胞。
(3)動(dòng)情期：主要是大量角化上皮細(xì)胞，形狀大而不規(guī)則，間有少量上皮細(xì)胞。
(4)動(dòng)情后期：有大量白細(xì)胞，亦有融合的角化上皮細(xì)胞。
4.2.2.造模成功參考結(jié)果：
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從手術(shù)后第5天起，全部進(jìn)入了動(dòng)情間期，以后脫落細(xì)胞逐日減少，至第9日，僅見到少量的白細(xì)胞，偶見有核上皮細(xì)胞，但動(dòng)物仍活潑喜動(dòng)，毛色光滑，肌肉緊張度正常。
4.3.分組給藥
將造模成功的大鼠隨機(jī)分為4組：(1)假手術(shù)組：蒸餾水10ml/kg；(2)模型組：蒸餾水10ml/kg；(3)尼爾雌醇組：0.42mg/kg；(4)亞麻籽提取物組：8.0g(生藥)/kg。
4.4.檢測指標(biāo)
(1)陰道涂片細(xì)胞學(xué)觀察：于灌胃給藥后第10日作陰道涂片觀察大鼠的動(dòng)情周期，用消毒棉簽插入大鼠陰道約1?2cm，沿陰道壁旋轉(zhuǎn)一圈取出，均勻涂于載波片上，稍風(fēng)干后用10％甲醛溶液固定，經(jīng)常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，制片，HE染色后進(jìn)行光鏡檢查，每日1次，連續(xù)4日。
(2)性激素水平測定：末次給藥后24h大鼠眼眶取血，檢測血清促性腺激素、性激素水平：放免法測定雌二醇(E2)、促黃體生成素(LH)、促卵泡素(FSH)、白細(xì)胞介素?2(IL?2)等指標(biāo)。
4.5.統(tǒng)計(jì)方法
量反應(yīng)用Excel軟件作student?t檢驗(yàn)。質(zhì)反應(yīng)用SPSS軟件作χ2(卡方)檢驗(yàn)。
5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
5.1對大鼠陰道涂片及動(dòng)情周期結(jié)果的影響
結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)大量角化上皮細(xì)胞的動(dòng)物數(shù)明顯低于假手術(shù)組，與假手術(shù)組比較差異顯著(p<0.01)；各給藥組出現(xiàn)大量角化上皮細(xì)胞的動(dòng)物數(shù)目均比模型組有所增加，其中亞麻籽提取物組與模型組比較有顯著性差異(p<0.05)，但提取物I組與模型組比較有極顯著性差異(p<0.01)。提示藥物可改善更年期大鼠模型的動(dòng)情周期的變化；如表3所示。
5.2.對大鼠血清IL?2及LH、E2、FSH激素水平的影響
結(jié)果提示，造模后大鼠白細(xì)胞介素?2(IL?2)、雌二醇(E2)低于假手術(shù)組，促黃體生成素(LH)、促卵泡素(FSH)高于假手術(shù)組。結(jié)果見表4。
表3大鼠陰道涂片的影響
表4大鼠血清激素水平的影響
表3、表4中與假手術(shù)組比較，△△p<0.01；與模型組比較，**p<0.01，*p<0.05。
6、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
從上述研究結(jié)果表明，本發(fā)明所得的提取物對調(diào)節(jié)雌激素有一定的作用，可以緩解更年期女性絕經(jīng)后荷爾蒙代謝。
上述詳細(xì)說明是針對本發(fā)明其中之一可行實(shí)施例的具體說明，該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
