紅麻分布廣泛，遍布世界各地，主要集中在亞洲和拉丁美洲等熱帶和亞熱帶地區(qū)。自從紅麻從印度引入中國后，其種植規(guī)模迅速發(fā)展，種植面積較大的地區(qū)主要集中在黃淮海地區(qū)、華南地區(qū)和長江流域^[5]。然而，由于農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，紅麻種植區(qū)域逐漸向中西部地區(qū)轉(zhuǎn)移，隨著紅麻纖維的高效綜合利用，對其育種提出了更高的要求，因此，選育紅麻新種質(zhì)顯得尤為重要。

在自然界，植物多倍體主要由天然雜交或自然突變引起，通常是由于生長環(huán)境的變化對染色體產(chǎn)生影響，導致染色體加倍^[6]。研究^[7-8]表明，多倍體植物通常表現(xiàn)出對環(huán)境的適應性增強和具有更強的遺傳可塑性等優(yōu)勢特征，因此人工多倍體育種技術得到越來越廣泛的應用。通過誘導紅麻產(chǎn)生多倍體，不僅可以改良其農(nóng)藝性狀，還有望提高其對逆境的適應性，如耐鹽性、耐旱性等。這為紅麻的育種方法創(chuàng)新提供了基礎，有助于滿足人們對天然纖維需求的不斷增長。本研究采用棉球覆蓋法和浸漬法兩種方式對紅麻進行多倍體誘導，旨在獲得更多具有優(yōu)良性狀的品種，為后續(xù)優(yōu)質(zhì)紅麻種質(zhì)資源的選育提供一定的材料基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

紅麻品種“中紅21”種子由中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所提供。試驗在2022年6月—2023年1月于中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所和試驗基地中進行。

1.2秋水仙素誘導試驗方法

1.2.1浸漬法

選取籽粒飽滿，大小相近的紅麻種子，將充分洗凈的紅麻種子分別放入0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 4種不同濃度秋水仙堿溶液中，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別靜置12、

24、36、48h后，清水沖洗干凈，置于鋪有一層脫脂棉紗布、一層定性濾紙的培養(yǎng)皿中，空白對照組用無菌水進行處理。將培養(yǎng)皿置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，溫度25℃，暗處理。每隔兩天加蒸餾水一次，保持培養(yǎng)皿中環(huán)境濕潤。待種子露白后，均勻播入育苗盤中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中（控制溫度25℃，光照時間16h/d，光照強度3000xl）^[9]。每組處理51粒種子，觀察并記錄，變異率=變異株數(shù)/存活株數(shù)×100%。

1.2.2棉球覆蓋法

選取籽粒飽滿，大小相近的紅麻種子，紅麻種子萌發(fā)后，待長至2至3片真葉時，選擇生長狀況一致的幼苗平均分成4組，每組60棵，用0.4%、0.8%、1.2%秋水仙素滴于脫脂棉包裹的紅麻幼苗生長點上，如圖1，連續(xù)5d，定點滴液。

圖1棉球覆蓋法示意圖

1.3多倍體鑒定方法

1.3.1氣孔鑒定

根據(jù)誘變苗與二倍體紅麻苗的植株形態(tài)特征，初步篩選出形態(tài)變異株，采用指甲油涂抹撕取法^[10]，觀察氣孔形態(tài)。

1.3.2 流式細胞術鑒定

使用由美國Becton,Dickinson and Company (BD)公司生產(chǎn)的Accuri C6流式細胞儀對待測液體進行倍性鑒定和分析，配置4種不同的解離液解離紅麻葉片。用流式細胞儀對不同解離液Count（（吸收的顆粒數(shù)）和FL2-A（（熒光強度(fluorescence in-tensity,FL)關系直方圖，即DNA相對含量直方圖)中相對熒光強度、碎片背景與變異系數(shù)等參數(shù)進行綜合分析，以確定最適宜紅麻葉片倍性檢測的細胞核解離液。

表1 3種解離液配比

取幼嫩葉片置于預冷過的培養(yǎng)皿中，加入1mL解離液，使用手術刀迅速切碎葉片，并用移液槍充分吸打，確保葉片碎片與解離液均勻混合。通過400目濾網(wǎng)將混合液過濾至1.5mL離心管中，向濾液中加入2.5μL的RNaseA，并在4℃黑暗條件下孵育30min，隨后加入17.5μL碘化丙啶（PI），待1～2min后得到細胞核解離液，隨即上機檢測^[11-12]。

1.3.3染色體計數(shù)法鑒定

以1～1.5cm的幼嫩根尖作為原材料，在4℃冰箱中處理12～24h后，置于0.002mol/L的8-羥基喹啉水溶液中預處理1～2h后放置于V（無水乙醇）：V（冰乙酸）=3:1的卡諾氏固定液中，室溫下，固定18h，沖洗數(shù)次后，將根尖置于1mol/L的鹽酸中，在60℃水浴鍋下處理5min，清洗數(shù)次后，轉(zhuǎn)入45%乙酸中室溫下乳化30min以上，將軟化結(jié)束的紅麻根尖清潔后截取根尖白色不透明的生長點部位，滴上石炭酸卡寶品紅染色液進行染色，室溫下一般染色約0.5～2h，利用5×、10×和40×物鏡的顯微鏡觀察并進行拍照計數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1秋水仙素對紅麻四倍體的誘導效果

2.1.1秋水仙素浸泡法對紅麻種子的誘導效果

經(jīng)觀察和統(tǒng)計出現(xiàn)四倍體植株的變異率（（表2），發(fā)現(xiàn)在濃度為0.4%的秋水仙素處理24h后，變異率達到100%，但成活率較低。而在秋水仙素濃度為0.2%處理24h后，變異率為53.85%，成活率為25.49%，表現(xiàn)出較佳的誘導效果。其次是秋水仙素濃度為0.4%處理12h的情況。此外，在相同誘導時間下，紅麻的成活率隨著秋水仙素濃度的增加呈現(xiàn)整體下降的趨勢，而變異率則因秋水仙素濃度的不同呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，但總體上呈現(xiàn)出增加的趨勢。

表2 秋水仙素浸泡法對紅麻種子的誘導效果

當秋水仙素濃度為 0.1%和 0.2%時，成活率隨著時間延長而降低。而當濃度達到 0.3%和 0.4%時，隨著時間延長呈現(xiàn)出較低的成活率。此外，在秋水仙素濃度為 0.2%和 0.4%時，變異率呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，而在秋水仙素濃度為 0.3%時，在浸泡 12 h 后，其變異率達到最高點。

2.1.2秋水仙素棉球覆蓋法對紅麻幼苗的誘導效果

由表3可知，在秋水仙素濃度為0.40%時，其變異率最高，而隨著濃度的逐漸升高，其變異率呈現(xiàn)降低趨勢。

表3 秋水仙素棉球覆蓋法對紅麻幼苗的誘導效果

2.2四倍體鑒定

2.2.1氣孔鑒定

通過浸漬種子法和棉花覆蓋法對紅麻進行多倍體誘導后，先進行形態(tài)鑒定，再進行氣孔鑒定。由圖4及表4可知，在相同視野下，秋水仙素誘導的變異植株的葉片氣孔縱徑顯著增大，達到34.74μm，與對照株相比存在顯著差異。同時，氣孔橫徑也呈現(xiàn)增加的趨勢，而氣孔密度則極顯著減少了58.8%。這些結(jié)果表明，秋水仙素誘導引起了紅麻植株氣孔的明顯變化。因此，通過對氣孔密度和氣孔大小的初步篩選，可以有效地篩選出具有氣孔結(jié)構(gòu)差異的變異植株。

圖2 對照株和變異株的幼苗

圖3 對照株和變異株的葉片

圖4 紅麻變異株與對照株的氣孔大小

表4 紅麻變異株與對照株的氣孔比較

注：“*”表示差異顯著（P＜0.05），“**”表示差異極顯著（P＜0.01）。 

2.2.2流式細胞術鑒定

由表5及圖5可知：不同細胞核解離液的細胞核數(shù)、變異系數(shù)與熒光強度均有所差異。LB01解離液的變異系數(shù)顯著低于Galbraith’s解離液和GPB解離液的變異系數(shù)。LB01解離液和GPB解離液的熒光強度顯著高于其他Galbraith’s解離液的熒光強度。LB01解離液變異系數(shù)較小，且熒光強度和完整細胞核數(shù)均高于其他兩種解離液。綜合對比后，LB01解離液是最適宜紅麻進行多倍體鑒定的解離液。

圖5 不同解離液獲得的紅麻葉片體細胞 DNA 相對含量

表 5 不同解離液的細胞核參數(shù)

將對照株與變異株進行倍性檢測。圖6結(jié)果顯示，對照植株在細胞數(shù)量為220000左右時出現(xiàn)單峰值（（約為135），而變異植株在細胞數(shù)量為410000左右時出現(xiàn)單峰值（（約為140），約為對照株的2倍，這一結(jié)果明確表明，經(jīng)誘變處理的此樣品為四倍體植株。

圖6 二倍體與四倍體紅麻 DNA 相對含量

2.2.3染色體計數(shù)鑒定

對植物根尖染色體進行計數(shù)是植物倍性鑒定中最精確的方法之一。由圖7可知，在紅麻中，二倍體植株的染色體數(shù)目為2n=36，而四倍體植株的染色體數(shù)目為4n=72。根尖染色體的計數(shù)提供了一種準確鑒定各植株倍性的手段。這一方法能夠有效地區(qū)分不同倍性植株，并為后續(xù)的遺傳學研究和育種工作提供可靠的基礎。

圖7 二倍體與四倍體紅麻根尖染色體數(shù)目

3討論

進行植物多倍體誘導時，化學誘導因具有專一性和操作簡便等特點而被廣泛應用。秋水仙素是目前化學誘導中最常用的試劑，其誘導效果受處理濃度、作用時間、環(huán)境溫度和植物材料等因素的影響顯著^[13-14]。首先，多種植物物種均已使用秋水仙素成功獲得多倍體，然而不同植物物種之間的多倍體誘導效果存在一定差異。例如，本研究中的紅麻種子與前人研究中的郁金香種子^[15]的誘導率不同，這可能與植物材料本身對秋水仙素的耐受能力有關。其次，研究表明，秋水仙素的處理濃度和時間對誘導效果也有顯著差異。本研究采用浸泡法處理紅麻種子，發(fā)現(xiàn)在16個處理中有4個組的誘導率大于40%，其中秋水仙素濃度為0.2%、處理時間24h的誘導率最高，達到53.85%，與前人的研究結(jié)果相一致^[16]。不同的處理方法，如浸漬法、棉球覆蓋法、注射法等，對植物的誘導效果也存在顯著差異。本研究結(jié)果顯示，浸漬法對紅麻的誘導效果更佳，這與前人對高丹草的多倍體研究結(jié)果相反^[17]。這可能是由于秋水仙素濃度的提高和處理時間的延長會導致植物畸形苗和嵌合體增加、致死率上升，從而降低多倍體誘導率，同時也可能受環(huán)境因素的影響，而本研究中由于樣本量較大，因而并未設置重復處理，也可能存在一定的關聯(lián)。

植物的倍性鑒定在多倍體育種中扮演著至關重要的角色，通常采用形態(tài)學觀測、氣孔觀測、染色體計數(shù)、流式細胞儀測定等方法。氣孔觀測屬于細胞學觀測范疇，氣孔大小與植物光合作用及蒸騰作用中的CO₂濃度及水分釋放密切相關，因此可以作為倍性水平的指標。本研究發(fā)現(xiàn)，變異植株的氣孔頻度顯著減小，氣孔顯著增大，這與前人^[18]研究結(jié)果一致。染色體計數(shù)法能夠直觀、準確地對植物倍性進行鑒定，流式細胞儀作為快速鑒定加倍植株倍性的工具，還能判斷是否為嵌合體^[19]。分子標記可以在細胞或組織中準確地識別和定位特定的分子或結(jié)構(gòu)，跟蹤生物分子或細胞的運動、變化或相互作用，從而了解其在生物學過程中的功能和行為，進一步對生物分子或細胞進行定量和定性分析，以深入了解其結(jié)構(gòu)、功能和相互關系^[20]。在標記基因型分析中，多倍體的最明顯標志是觀察到來自假定單一位點標記的多個帶狀圖案，多倍體的進行基因型檢測可能是在單個基因組區(qū)域存在兩個以上的單倍型，同時在序列讀取的組裝方面存在額外的困難^[21]，因此，綜合利用三種鑒定方法可以更全面地評估植物的倍性，為多倍體育種的選育工作提供重要參考。

多倍體育種是一項重要的植物遺傳改良技術，其應用廣泛且潛力巨大，可以改善作物的品質(zhì)、產(chǎn)量和抗逆性，加速育種進程，提高植物的價值，本研究通過對化學誘導方法和倍性鑒定的深入研究，不僅為紅麻植株的改良和適應不同環(huán)境的栽培提供了新途徑、為紅麻多倍體育種的選育工作提供了參考，同時在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學研究領域具有實際和理論上的重要意義。

參考文獻

[1]李德序,汪青,黃鑫,等.堿處理提取紅麻纖維素的研究[J].毛紡科技,2023,51(4):37-43.

[2]劉倩,戴志剛,陳基權,等.應用SRAP分子標記構(gòu)建紅麻種質(zhì)資源分子身份證[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2013,46(10):1974-1983.

[3]Yi Y S, Lin K N. Hibiscus cannabinus L. (kenaf) studies: Nutritional composition, phytochemistry, pharmacology, and potential applications [J]. Food Chemistry,2020,344:128582-128588.

[4]CHEN M X, SHE Z Y, Aslam Mohammad, et al. Genomic insights of the WRKY genes in kenaf (Hibiscus cannabinus L.) reveal that HcWRKY44 improves the plant’s tolerance to the salinity stress[J]. Frontiers in Plant Science,2022,13:984233-984233.

[5]熊和平.麻類作物育種學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社,2008.

[6]Sattler M C, Carvalho C R, Clarindo W R. The polyploidy and its key role in plant breeding [J]. Planta,2016,243(2):281-96.

[7]Tossi V E, Martínez T L, Laino L E, et al. Impact of polyploidy on plant tolerance to abiotic and biotic stresses [J]. Frontiers in Plant Science,2022,13:869423.

[8]JIANG Y L, LIU S L, HU J, et al. Polyploidization of Plumbago auriculata Lam. in vitro and its characterization including cold tolerance[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2020, 140 (2): 315-325.

[9]SHI H X, GUO X B, WANG Q, et al. Induction and flow cytometry identification of tetraploids from seed-derived explants through colchicine treatments in Catharanthus roseus (L.) G. Don[J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology,2011,2011:793198-793198.

[10]劉明智,努爾巴衣·阿布都沙力克,潘曉玲.指甲油涂抹撕取法制取植物葉氣孔裝片[J].生物學通報,2005(10):44-63.

[11]Galbraith D W. Simultaneous flow cytometric quantification of plant nuclear DNA contents over the full range of described angiosperm 2C values.[J]. Cytometry Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology,2009,75(8):692-698.

[12]張仕超.南紅梨和杜梨多倍體誘導及鑒定[D].咸陽:西北農(nóng)林科技大學,2022.

[13]陳建新,張春來,張海楠,等.秋水仙素誘導萬壽菊多倍體種質(zhì)創(chuàng)制研究[J].種子,2022,41(11):54-61.

[14]Hirokazu T. Controlling size in multicellular organs: focus on the leaf[J]. Plos Biology,2008,6:e174.

[15]陳娟娟.兩種野生郁金香種子萌發(fā)特性及多倍體誘導研究[D].沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學,2018.

[16]任雪羽,王曉紅,肖芬,等.木槿種子的多倍體誘導及鑒定研究[J].西部林業(yè)科學,2019,48(4):119-125.

[17]王煒,陳琛,葛玉彬,等.高丹草多倍體的誘導與鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)學報,2021,30(9):1394-1401.

[18]成敏,石螢,王金乙,等.秋水仙素誘導辣椒多倍體研究[J/OL].分子植物育種:1-8[2024-09-13].http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20231024.1414.006.html.

[19]許蕾,陳佩琳,馮光燕,等.利用流式細胞儀鑒定鴨茅倍性[J].草業(yè)學報,2019,28(3):74-84.

[20]Hayward A C,Tollenaere R, Dalton-Morgan J, et al. Molecular marker applications in plants.[J]. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.),2015,1245:13-27.

[21]Mason A S. Challenges of genotyping polyploid species.[J]. Methods in Molecular Biology,2015,1245:161168.

文章摘自：史盈盈,高澤昕,陳建華,鄧勇,李建軍,唐慧娟,潘根,欒明寶.紅麻四倍體的誘導方法比較與鑒定[J].中國麻業(yè)科學,1-9.