摘  要: 本發(fā)明涉及羅布麻鑒定技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及基于羅布麻葉綠體基因制備的條形碼及其應(yīng)用，本發(fā)明的DNA條形碼標(biāo)是基于羅布麻屬葉綠體基因設(shè)計的，能快速的對羅布麻屬(Apocynum)的兩個品種：羅布紅麻(A.venetum)和羅布白麻(A.pictum)進(jìn)行區(qū)分、鑒定，經(jīng)基因?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)：羅布紅麻(A.venetum)和羅布白麻(A.pictum)的ycf1基因和rpoC2基因差異明顯，特異性位點差別很大，可能通過對上述兩種進(jìn)行測序，就能快速區(qū)分羅布麻屬的兩個品種，該方法為能為后續(xù)的羅布麻植物學(xué)分類提供更準(zhǔn)確的基因輔助工具。

 

權(quán)利要求書

1.基于羅布麻葉綠體基因制備的條形碼,其特征在于,所述條形碼為DNA條形碼,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1SEQ ID NO.4所示。

2.如權(quán)利要求1所述基于羅布麻葉綠體基因制備的條形碼在區(qū)分不同羅布麻種質(zhì)資源中的應(yīng)用。

3.一種應(yīng)用如權(quán)利要求1所述條形碼對不同羅布麻種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定的方法,其特征在于,所述方法為:提取待鑒定的羅布麻材料的葉綠體DNA,以葉綠體DNA為模板,應(yīng)用rpoC2基因引物:如SEQ ID NO.5SEQ ID NO.6所示和ycf1基因引物:如SEQ ID NO.7SEQ ID NO.8所示對其基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,如測序的rpoC2基因序列如SEQIDNO.1所示,在176184bp處的基因序列為:5’TAACCTCTC3’且在203211bp處的基因序列為:5’TAACCTCTC3’,則該樣品為羅布白麻(A.pictum),如測序的rpoC2基因序列如SEQ ID NO.2所示,則該樣品為羅布紅麻(A.venetum);如測序的ycf1基因序列如SEQ ID NO.3所示,在153158bp處的基因序列為:5’AAAGAA3’,則該樣品為羅布紅麻(A.venetum),如測序的ycf1基因序列如SEQ ID NO.4所示,則該樣品為羅布白麻(A.pictum)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,所述PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系為25μl:2×Reaction Mix 12.25μl, Golden DNAPolymerase 0.25μl,正反向引物各2.5μl,ddH₂O 5μl,DNA模板2.5μl;

反應(yīng)條件為:①94℃預(yù)變性3min;②94℃變性30s;③58℃退火30s;④72℃延伸30s;⑤步驟②④循環(huán)35次;⑥72℃延伸7min。

 

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及羅布麻鑒定技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及基于羅布麻葉綠體基因制備的條形碼及其應(yīng)用。

 

背景技術(shù)

羅布麻(Apocynum venetum)又稱茶棵子和茶葉花等,隸屬夾竹桃科(Apocynaceae),是一種半灌木狀多年生草本宿根植物,通過種子和根蘗繁殖。羅布麻能夠在鹽堿沙荒地等惡劣的自然環(huán)境下生長,具有改土保水等良好的生態(tài)效用,也可作為觀賞植物種植。羅布麻葉可以入藥,也可制保健茶;羅布麻纖維有“野生纖維之王”的美譽(yù),是一種不可多得的天然纖維材料,因此綜合利用價值巨大。

雖然羅布麻于1952年由董正鈞先生命名,但其植物學(xué)分類問題并沒有得到相應(yīng)解決,只是沿用當(dāng)?shù)厮追Q,分為紅麻和白麻兩種。之后,張鵬云等多位學(xué)者就羅布麻的植物學(xué)分類問題發(fā)表了不同意見,分歧主要在于分類體系是采用Woodson的分類方法還是林氏分類法。1975年出版的《中國植物志》記載:我國俗稱羅布麻的植物有3種,劃歸2個屬。具體包括羅布麻屬(Apocynum)中的羅布麻(A.venetum)及白麻屬(Poacynum)中的白麻(P.pictum)和大葉白麻(P.hendersonii)。直至近年,羅布麻類植物的植物學(xué)分類問題依然未得到解決,不同學(xué)者之間仍存在爭議,焦點主要在于白麻屬與羅布麻屬物種之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近以及白麻屬類植物是否有必要另立新屬。有學(xué)者根據(jù)對羅布麻和大葉白麻葉表面氣孔形態(tài)?葉片?花和種子等結(jié)構(gòu)形態(tài)的觀察,認(rèn)為二者在這些方面性狀十分相似,大葉白麻沒有另立新屬的必要,建議將白麻屬撤銷,并將大葉白麻歸并到羅布麻屬。另一部份學(xué)者認(rèn)為:通過對羅布麻屬物種羅布麻(羅布紅麻)?加拿大麻和白麻屬物種大葉白麻和白麻的ITS?trnL內(nèi)含子及trnLF非編碼區(qū)序列比對,發(fā)現(xiàn)羅布紅麻?大葉白麻和白麻的ITS序列完全一致,但與加拿大麻ITS序列差異較大;在trnL內(nèi)含子和trnLF非編碼區(qū),大葉白麻和白麻序列完全一致,與羅布紅麻僅有3個位點的變異。即來源不同地區(qū)不同居群的羅布麻樣品之間以及羅布麻和大葉白麻樣品的ITS?trnL及trnLF序列基本沒有變化,但加拿大麻與此兩種植物在這3個DNA標(biāo)記序列上具有多達(dá)十多個SNP以及多處堿基插入/缺失的差異。因此認(rèn)為羅布紅麻與大葉白麻和白麻之間的親緣關(guān)系可能較羅布紅麻與羅布麻屬內(nèi)其它物種間的親緣關(guān)系更近,建議撤銷白麻屬。將大葉白麻和白麻歸入羅布麻屬。因此,目前一般認(rèn)為我國的羅布麻植物可劃分為1屬2種,即羅布麻屬(Apocynum),包括羅布紅麻(A.venetum)和羅布白麻(A.pictum)兩個種。

因此,為了更好的對羅布麻屬種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分,有必要從基因手段深入研究,找出能確實區(qū)分羅布麻屬種質(zhì)的基因位點,在分子水平上快速區(qū)分不同的羅布麻屬種質(zhì),達(dá)到簡單?高效?準(zhǔn)確區(qū)分不同羅布麻屬種質(zhì)的目的,為后續(xù)的羅布麻植物學(xué)分類提供更準(zhǔn)確的基因輔助工具。

 

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述內(nèi)容，有必要對羅布麻基因進(jìn)行深入研究，找出能準(zhǔn)確、快速對羅布麻品種進(jìn)行種質(zhì)區(qū)分的基因位點，并將該位點制備成基因條形碼，該條形碼將能快速、準(zhǔn)確的對不同羅布麻種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分，為后續(xù)的羅布麻植物學(xué)分類提供更準(zhǔn)確的基因輔助工具。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：基于羅布麻葉綠體基因制備的條形碼，所述條形碼為DNA條形碼，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明還包括所述基于羅布麻葉綠體基因制備的條形碼在區(qū)分不同羅布麻種質(zhì)資源中的應(yīng)用。

本發(fā)明還包括一種應(yīng)用所述條形碼對不同羅布麻種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定的方法，所述方法為：提取待鑒定的羅布麻材料的葉綠體DNA，以葉綠體DNA為模板，應(yīng)用rpoC2基因引物：如SEQ ID NO.5SEQ ID NO.6所示和ycf1基因引物：如SEQ ID NO.7SEQ ID NO.8所示對其基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，如測序的rpoC2基因序列如SEQ ID NO.1所示，在176184bp處的基因序列為：5’TAACCTCTC3’且在203211bp處的基因序列為：5’TAACCTCTC3’，則該樣品為羅布白麻(A.pictum)，如測序的rpoC2基因序列如SEQ ID NO.2所示，則該樣品為羅布紅麻(A.venetum)；如測序的ycf1基因序列如SEQ ID NO.3所示，在153158bp處的基因序列為：5’AAAGAA3’，則該樣品為羅布紅麻(A.venetum)，如測序的ycf1基因序列如SEQ ID NO.4所示，則該樣品為羅布白麻(A.pictum)。

進(jìn)一步的，所述PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系為25μl：2×ReactionMix12.25μl，GoldenDNAPolymerase0.25μl，正反向引物各2.5μl,ddH2O5μl，DNA模板2.5μl；反應(yīng)條件為：①94℃預(yù)變性3min；②94℃變性30s；③58℃退火30s；④72℃延伸30s；⑤步驟②④循環(huán)35次；⑥72℃延伸7min。

本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的DNA條形碼是基于羅布麻葉綠體基因設(shè)計的，能快速的對不同羅布麻屬(Apocynum)的兩個品種：羅布紅麻(A.venetum)和羅布白麻(A.pictum)進(jìn)行區(qū)分、鑒定，經(jīng)基因?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)：羅布紅麻(A.venetum)和羅布白麻(A.pictum)的ycf1基因和rpoC2基因差異明顯，特異性位點差別很大，可能通過對上述兩種進(jìn)行測序，就能快速區(qū)分羅布麻屬的兩個品種，該方法能為后續(xù)的羅布麻植物學(xué)分類提供更準(zhǔn)確的基因輔助工具。

 

附圖說明

圖1為羅布麻種質(zhì)的葉綠體基因rpoC2差異片段圖，從上至下依次為羅布白麻、羅布紅麻、羅布白麻、羅布紅麻、羅布白麻、羅布白麻、羅布白麻、羅布紅麻、羅布紅麻、羅布紅麻、羅布白麻、羅布白麻、羅布紅麻和羅布紅麻。

  

圖1

圖2圖15為14個不同羅布麻樣品的差異片段的rpoC2基因測序峰圖,其中,圖2?圖4?圖6?圖7?圖8?圖12和圖13的測序峰圖的樣品為羅布白麻;圖3?圖5?圖9?圖10?圖11?圖14和圖15的樣品為羅布紅麻。

 

  

圖2

  

圖3

   

圖4 

圖5

  

圖6

  

圖7

 圖8

  

圖9

  

圖10

  

圖11

  

圖12

  

圖13

 

  

圖14

  

圖15

圖16為羅布麻種質(zhì)的葉綠體基因ycl1差異片段圖，從上至下依次為羅布白麻、羅布紅麻、羅布白麻、羅布紅麻、羅布白麻、羅布白麻、羅布白麻、羅布紅麻、羅布紅麻、羅布紅麻、羅布白麻、羅布白麻、羅布紅麻和羅布紅麻。

  

圖16

 

 

圖17圖30為14個不同羅布麻樣品的差異片段的ycl1基因測序峰圖，其中，圖17、圖19、圖21、圖22、圖23、圖27和圖28的測序峰圖的樣品為羅布白麻；圖18、圖20、圖24、圖25、圖26、圖29和圖30的樣品為羅布紅麻。

  

圖17

圖18

 圖19

圖20

  

圖21

  

圖22

圖23

圖24

 

圖25

  

圖26

  

圖27

  

圖28

 

 

  

圖29

  

圖30

圖31為基因rpoC2的電泳圖。

  

圖31

圖32為基因ycf1的電泳圖。

  

圖32

 

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。

實施例1

本實施例為羅布麻葉綠體基因間區(qū)多態(tài)性區(qū)域的篩選，具體方法如下。

(1)從NCBI上下載羅布紅麻和羅布白麻的葉綠體基因，將羅布紅麻和羅布白麻的這些基因的編碼序列利用DNAMAN進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)羅布紅麻和羅布白麻的rpoC2和ycf1基因之間存在較大片段的差異(InDel)。

(2)收集羅布紅麻(紅桿小花)和羅布白麻(紅桿中花)的葉片，將幼嫩葉片在研缽中充分研磨，使用DNA提取試劑盒(天根DP32003DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒)，按說明書步驟提取DNA。所得DNA20℃保存待用。

(3)對羅布紅麻和羅布白麻的ycf1和rpoC2基因之間的InDel進(jìn)行測序驗證：總反應(yīng)體系為25μl:2×Reaction Mix12.25μl,Golden DNAPolymerase0.25μl,正反向引物各2.5μl,ddH2O5μl，DNA模板2.5μl。反應(yīng)條件為：①94℃預(yù)變性3min；②94℃變性30s；③58℃退火30s；④72℃延伸30s；⑤步驟②④循環(huán)35次；⑥72℃延伸7min。挑選瓊脂糖電泳效果好的、明亮的、無雜帶的樣本PCR產(chǎn)物，送樣進(jìn)行一代sanger測序，均使用正向基因進(jìn)行DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增使用的引物對參見表1。

(4)將測序序列和NCBI下載序列比對，確認(rèn)羅布紅麻和羅布白麻的rpoC2和ycf1基因間的InDel序列確實存在。

因此人工核對后篩選得出：葉綠體基因rpoC2基因和葉綠體基因ycf1可以作為有效區(qū)分羅布紅麻和羅布白麻核心種質(zhì)特異性鑒別DNA條形碼。

實施例2

(1)按照實施例1的方法獲得14份羅布紅麻或羅布白麻種質(zhì)的DNA(表2)。

(2)對DNA條形碼基因rpoC2和ycf1片段的擴(kuò)增與測序：總反應(yīng)體系為25μl：2×Reaction Mix12.25μl,Golden DNAPolymerase 0.25μl，正反向引物各2.5μl,ddH2O5μl,DNA模板2.5μl。反應(yīng)條件為：①94℃預(yù)變性3min：②94℃變性30s；③58℃退火30s；④72℃延伸30s；⑤步驟②④循環(huán)35次；⑥72℃延伸7min。參照圖31基因rpoC2和圖32基因ycf1的電泳圖，挑選瓊脂糖電泳效果好的、明亮的、無雜帶的樣本PCR產(chǎn)物，送樣測序，均使用正向基因進(jìn)行DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增使用的引物對參見表1。

表1 基因rpoC2和ycf1的擴(kuò)增引物

(3)序列比對、質(zhì)量核查：使用DNAMAN對序列進(jìn)行質(zhì)量核查，通過多重序列比對檢查測序結(jié)果，找出葉綠體基因rpoC2和葉綠體yc11基因存在差異的片段。

羅布白麻rpoC2基因的測序結(jié)果如序列表SEQ ID NO：1所示；羅布紅麻rpoC2基因的測序結(jié)果如序列表SEQ ID NO：2所示。

羅布紅麻ycf1基因的測序結(jié)果如序列表SEQIDNO：3所示；羅布白麻ycf1基因的測序結(jié)果如序列表SEQ ID NO：4所示。

不同種質(zhì)葉綠體rpoC2基因的序列對比情況如圖1所示，圖1中的樣品從上至下依次為表1中的樣品，從圖中可見，羅布白麻樣品在176184bp處的基因序列為：5’TAACCTCTC3’且在203211bp處的基因序列為：5’TAACCTCTC3’，而羅布紅麻樣品的在176184bp和203211bp處的基因均為缺失基因。

不同種質(zhì)葉綠體ycl1基因的序列對比情況如圖16所示，圖16中的樣品從上至下依次為表1中的樣品，從圖中可見，羅布白麻樣品在153158bp處的基因為缺失基因；而羅布紅麻樣品在153158bp處的基因序列為：5’AAAGAA3’。

具體測序的峰圖如圖2圖15和圖17圖30所示，具體情況參見表2。

 

 

 

 

 

 

表2 對14份羅布麻樣品的的測序結(jié)果

通過測序結(jié)果，可以得出，羅布白麻和羅布紅麻樣品在rpoC2基因和ycl1基因中變異位點非常明顯，因此，可以利用rpoC2基因和ycl1基因片段作為鑒定、區(qū)分羅布白麻和羅布紅麻核心種質(zhì)特異性DNA條形碼。

綜上所述，本申請根據(jù)葉綠體的rpoC2基因和ycl1基因制備DNA條形碼能快速的將羅布白麻和羅布紅麻區(qū)分出來，是一種準(zhǔn)確、高效區(qū)分羅布白麻和羅布紅麻種質(zhì)的方法。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

 

文章摘自國家發(fā)明專利，基于羅布麻葉綠體基因制備的條形碼及其應(yīng)用，張吉宇，陳利軍，吳凡，許攀，狄紅艷，申請?zhí)枺?/font>202411231678.0，申請日，2024.09.04。