作者：黃文功等
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發(fā)布時(shí)間：2021-10-12
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[麻進(jìn)展] 亞麻響應(yīng)低鉀脅迫轉(zhuǎn)錄譜分析
摘 要：鉀是亞麻生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量元素。本研究以鉀高效利用亞麻品種Sofie為試驗(yàn)材料，在低鉀處理12h和96h下，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及qRT-PCR進(jìn)行低鉀脅迫下差異基因表達(dá)調(diào)控的研究。結(jié)果表明，低鉀處理7d的亞麻葉片邊緣變黃，與對(duì)照相比，低鉀處理植株矮化。篩選出對(duì)低鉀響應(yīng)強(qiáng)烈的3個(gè)鉀運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因LusKC1(LusKchannel1)、LusSKOR(LusSTELARK+outwardrectifier)和LusHAK5(LushighaffinityK+transporter5)，低鉀脅迫響應(yīng)峰值時(shí)間為12h和96h；與對(duì)照相比，低鉀處理12h鑒定到差異表達(dá)基因1154個(gè)(508個(gè)上調(diào)，646個(gè)下調(diào))，GO功能富集分析表明，這些差異表達(dá)基因主要富集于代謝過(guò)程、細(xì)胞進(jìn)程、單一生物過(guò)程、催化活性和結(jié)合功能五大類(lèi)，KEGG通路富集分析表明，這些差異表達(dá)基因涉及到能量代謝、碳水化合物代謝、碳代謝、氨基酸代謝、萜類(lèi)化合物代謝和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路。進(jìn)而篩選出7個(gè)與鉀直接相關(guān)基因(4個(gè)鉀運(yùn)輸?shù)鞍住?個(gè)鉀通道蛋白及1個(gè)鈉鉀鈣交換蛋白)、13個(gè)與激素相關(guān)基因以及6個(gè)與纖維素合成相關(guān)基因。7個(gè)與鉀直接相關(guān)基因中，2個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)1.75倍和2.64倍，5個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)1.21~9.57倍。以上解析的差異基因初步揭示了亞麻低鉀涉及的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，可為亞麻耐低鉀相關(guān)基因的克隆與功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：亞麻；低鉀；轉(zhuǎn)錄組；差異表達(dá)基因
中國(guó)耕地土壤鉀含量普遍低，以土壤中速效鉀含量70mgkg-1為標(biāo)準(zhǔn)，中國(guó)低鉀土壤總面積約2.27×108hm2，嚴(yán)重制約了作物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。中國(guó)鉀肥施用量從2011年的6.05×109kg增加到2017年的1.95×1010kg。大量施用鉀肥，不僅增加生產(chǎn)成本、加速鉀資源枯竭，并造成環(huán)境污染問(wèn)題。研究表明，不同物種甚至同一作物不同品種在土壤鉀素利用上表現(xiàn)出顯著差異。最近，轉(zhuǎn)基因等方法被用來(lái)提高鉀吸收和利用效率。這些措施將緩解鉀素資源的進(jìn)一步枯竭，并提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)。亞麻(LinumusttatissimumL.)是一種廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物，有悠久的栽培歷史。鉀是亞麻生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量元素。對(duì)亞麻鉀吸收和利用進(jìn)行科學(xué)研究，提高亞麻對(duì)低鉀脅迫適應(yīng)性，對(duì)于中國(guó)農(nóng)業(yè)化肥實(shí)現(xiàn)“雙減”，保護(hù)環(huán)境，避免過(guò)量施用化肥造成的環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)綠水青山理念，實(shí)現(xiàn)中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展有重要意義。
鉀是植物生長(zhǎng)的必需元素，是植物體內(nèi)含量最高的陽(yáng)離子，占植物干物質(zhì)總量2%~10%，在生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用。植物中的鉀調(diào)節(jié)許多物理過(guò)程包括植株生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)數(shù)。鉀參與光合作用及葉綠素合成，鉀是植物體中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。K+遷移對(duì)低鉀土壤中的植物生長(zhǎng)至關(guān)重要，已發(fā)現(xiàn)許多鉀通道，如KT/KUP/HAK轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族和KCOs家族。還發(fā)現(xiàn)其他具有雙重功能的轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括具有Na+和K+轉(zhuǎn)運(yùn)體雙重功能的HKT轉(zhuǎn)運(yùn)體和CBL-CIPK，后者受Ca2+信號(hào)通路調(diào)節(jié)，并激活A(yù)KT1通道。此外，ROS信號(hào)通路中的RCI3/RAP被認(rèn)為激活轉(zhuǎn)運(yùn)體HAK。植物低鉀表現(xiàn)明顯癥狀為莖弱、容易倒伏、葉片失水、耐旱性和耐寒性降低、蛋白質(zhì)和葉綠素分解、葉片變黃最終組織壞死。
目前已發(fā)表的亞麻基因組序列圖極大地促進(jìn)了亞麻的研究。亞麻的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序結(jié)果表明，遺傳圖譜總長(zhǎng)度為1483.25cM，2339個(gè)標(biāo)記均勻分布于15個(gè)連鎖群，分別對(duì)應(yīng)于亞麻15條染色體，相鄰標(biāo)記間平均距離為0.63cM，該圖譜是目前為止密度最高的亞麻全基因組遺傳連鎖圖譜。有學(xué)者提出一種涉及激活蛋白的低鉀反應(yīng)機(jī)制的存在。目前亞麻對(duì)低鉀脅迫的分子機(jī)制及參與這一調(diào)控過(guò)程的基因仍不明晰。特定響應(yīng)基因表達(dá)的變化決定了鉀脅迫下亞麻形態(tài)及生理變化，差異基因表達(dá)研究有利于揭示鉀脅迫下亞麻內(nèi)在的分子響應(yīng)機(jī)制，為分子輔助品種選育奠定基礎(chǔ)。本研究以亞麻品種Sofie為研究材料，深入挖掘低鉀脅迫下Sofie中的差異表達(dá)基因，通過(guò)揭示鉀脅迫相關(guān)的分子及信號(hào)通路，以期為亞麻耐低鉀相關(guān)基因的克隆與功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 植物材料
鉀高效利用亞麻品種Sofie由國(guó)家麻類(lèi)種質(zhì)改良中心亞麻分中心提供。
1.2 生長(zhǎng)條件及脅迫處理
將Sofie種子播種于裝有蛭石(已經(jīng)過(guò)121℃濕熱滅菌20min)的紙杯中，紙杯置于塑料托盤(pán)上，每個(gè)托盤(pán)澆等體積水，每個(gè)紙杯播種30粒種子。出苗至脅迫處理前每3天澆1/2MS，將播種后的亞麻置于相對(duì)濕度70%的植物培養(yǎng)箱中，23℃,16h光照/18℃,8h黑暗。設(shè)MS培養(yǎng)基中的K+濃度(20mmolL-1K+)和0(0mmolL-1K+)2個(gè)鉀處理梯度。
在Sofie生長(zhǎng)至3對(duì)真葉時(shí)(出苗后7d)進(jìn)行2種濃度的鉀處理，每個(gè)組培瓶中放置10株均勻一致的亞麻植株，每個(gè)組培瓶200mL培養(yǎng)液，處理重復(fù)3次。每3d更換1次培養(yǎng)液，直至出現(xiàn)低鉀癥狀(葉片邊緣變黃)為止。
生長(zhǎng)一致的3周Sofie幼苗正常澆MS培養(yǎng)液(充足的K+供應(yīng)，含KCl)作為低鉀對(duì)照(ck)，澆低鉀培養(yǎng)液(無(wú)KCl)的作為低鉀處理(lk)。ck營(yíng)養(yǎng)液是改變的MS培養(yǎng)液，KCl代替KNO3。ck和lk脅迫12h和96h，整株苗取樣，液氮凍后80℃貯存，供RNA提取用于后續(xù)測(cè)序分析。
1.3 qRT-PCR引物
根據(jù)擬南芥中的鉀運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白相關(guān)基因，在網(wǎng)站(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmL)設(shè)計(jì)亞麻L(zhǎng)usKC1、LusSKOR、LusAKT2、LusHAK5、LusKUP2、LusKUP3、LusKUP12、LusKEA5、LusCHX17共9個(gè)基因的引物，每個(gè)基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物。
1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
采用TIANGENRNApreppure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA。用TIANGENTgemSpectrophotometen檢測(cè)所提取RNAA260/A280比值及濃度。ck和lk處理12h和96h提取的Sofie整株植株RNA(3次重復(fù))分別命名為12h-ck-1、12h-ck-2、12h-ck-3、12h-ks-1、12h-ks-2、12h-ks-3、96h-ck-1、96h-ck-2、96h-ck-3、96h-ks-1、96h-ks-2和96h-ks-3。總RNA的質(zhì)量和數(shù)量分析、建庫(kù)及Illumina測(cè)序由華大基因公司(BGI，Shenzhen，China)完成。RNA-seq相應(yīng)數(shù)據(jù)(編號(hào)：SRP120129)上傳至公共數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
1.5 qRT-PCR分析
按上述方法提取總RNA。TIANGENRNApreppurePlantKit已含有去基因組DNA試劑，逆轉(zhuǎn)錄時(shí)省去該步驟。逆轉(zhuǎn)錄方法采用ReverTraAceqPCRRTMasterMixwithgDNARemover(CodeNo.FSQ-301)。RNA的變性：將RNA65℃5min，立即冰上冷卻。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為10µL，包含RNAtemplate0.5pg~0.5µg、Nuclease-freeWater、5×RTMasterMixⅡ。輕輕攪拌反應(yīng)溶液，以下溫度進(jìn)行反應(yīng)：37℃15min，50℃5min，98℃5min，4℃保存。
將1μg總RNA合成第1鏈cDNA。PCR反應(yīng)體系為95℃3min；95℃5s，60℃40s，72℃10s，45個(gè)循環(huán)。為驗(yàn)證引物特異性，45個(gè)循環(huán)后進(jìn)行溶解曲線繪制。qRT-PCR試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR試驗(yàn)內(nèi)參基因?yàn)長(zhǎng)usActin。利用2−ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。利用Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)設(shè)計(jì)引物。
1.6 統(tǒng)計(jì)分析
所有試驗(yàn)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。采用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)，各組間比較采用單因素方差分析。P<0.05的值為顯著差異。
2 結(jié)果與分析
2.1 亞麻低鉀脅迫響應(yīng)時(shí)間的確定
2.1.1亞麻低鉀脅迫處理前后亞麻表型
Sofie出苗7d，在蛭石中的生長(zhǎng)狀態(tài)及各植株生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1-A。由圖1-B可看出，各植株生長(zhǎng)一致，長(zhǎng)勢(shì)良好。處理時(shí)，對(duì)照和處理的生長(zhǎng)狀態(tài)見(jiàn)圖1-C。處理7d，低鉀和對(duì)照的生長(zhǎng)狀態(tài)見(jiàn)圖1-D和E。說(shuō)明低鉀處理7d植株出現(xiàn)葉片邊緣變黃癥狀，和對(duì)照相比，低鉀處理植株矮化。
2.1.2 亞麻低鉀脅迫標(biāo)記基因篩選
以低鉀處理48hK0的cDNA稀釋10倍為模板進(jìn)行PCR，篩選標(biāo)記基因引物及內(nèi)參。從圖2-A~C可看出，引物L(fēng)usKC1-1、LusSKOR-1、LusHAK5-2、LusKEA5-2和LusActin特異性好。本試驗(yàn)從4個(gè)特異性好的標(biāo)記基因引物L(fēng)usKC1-1、LusSKOR-1、LusHAK5-2和LusKEA5-2中選取3個(gè)標(biāo)記基因LusKC1、LusSKOR、LusHAK5及內(nèi)參LusActin進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。
2.1.3亞麻低鉀脅迫響應(yīng)時(shí)間篩選
在低鉀脅迫6h、12h、24h、48h、96h、192h、10d和15d時(shí)，利用篩出的標(biāo)記基因引物L(fēng)usKC1-1、LusSKOR-1、LusHAK5-2及內(nèi)參LusActin引物進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。從圖3可看出，LusKC1在12h和96h表達(dá)量顯著高于其他時(shí)間(P<0.05)；LusSKOR在12h和96h表達(dá)量高，這2個(gè)時(shí)間LusSKOR表達(dá)量顯著高于其他時(shí)間(P<0.05)；LusHAK5在12h和96h表達(dá)量顯著高于其他時(shí)間(P<0.05)。綜合3個(gè)標(biāo)記基因LusKC1、LusSKOR和LusHAK5qRT-PCR表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，3個(gè)標(biāo)記基因12h開(kāi)始高表達(dá)，96h表達(dá)處于另一個(gè)高峰。選取低鉀處理及對(duì)照在12h和96h取樣，進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
2.2 亞麻低鉀的RNA-seq
2.2.1 亞麻低鉀轉(zhuǎn)錄組測(cè)序統(tǒng)計(jì)分析
利用低鉀12h和96hSofie及對(duì)應(yīng)時(shí)間對(duì)照樣品總RNA構(gòu)建illumina測(cè)序文庫(kù)。每個(gè)文庫(kù)平均得到38.07Mb原始測(cè)序讀數(shù)，其中95.38%以上為過(guò)濾讀數(shù)。將過(guò)濾讀數(shù)與亞麻基因組序列比對(duì)，至少86.17%讀數(shù)成功與數(shù)據(jù)庫(kù)參考基因組序列比對(duì)上(表2)。
2.2.2 亞麻低鉀差異表達(dá)基因篩選
本研究將差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)閾值設(shè)為≥2.0，q-value閾值設(shè)為≤0.05。利用q-value閾值＜0.05和log2ratio的絕對(duì)值≥1來(lái)篩選出低鉀的差異表達(dá)基因。低鉀12h鑒定到1154個(gè)(508個(gè)上調(diào)表達(dá)，646個(gè)下調(diào)表達(dá))低鉀響應(yīng)表達(dá)基因。低鉀96h差異表達(dá)基因明顯減少，共鑒定到247個(gè)(131個(gè)上調(diào)表達(dá)，116個(gè)下調(diào)表達(dá))低鉀響應(yīng)表達(dá)基因。圖4-A展示了不同低鉀時(shí)期的差異表達(dá)基因的異同情況，18個(gè)基因在兩時(shí)期均響應(yīng)，其中上調(diào)基因8個(gè)，下調(diào)基因10個(gè)，推測(cè)這些基因可能在整個(gè)低鉀時(shí)期有重要功能。圖4-B顯示低鉀對(duì)照組和處理組差異基因數(shù)。比較這些結(jié)果消除了基因表達(dá)與時(shí)間和生長(zhǎng)相關(guān)的自然變異。在ck組和ks組中，有886個(gè)基因共同表達(dá)，其中343個(gè)基因上調(diào)，543個(gè)基因下調(diào)。
2.3 GO功能富集
對(duì)差異表達(dá)基因(1154個(gè))進(jìn)行GO功能富集發(fā)現(xiàn)，在12h-ksvs12h-ck對(duì)比組差異基因主要富集于代謝過(guò)程、細(xì)胞進(jìn)程、單一生物過(guò)程、催化活性和結(jié)合功能五大類(lèi)(圖5)。
2.4 KEGG通路富集
為進(jìn)一步理解差異表達(dá)基因的功能，將12h-ksvs12h-ck對(duì)比組所有差異基因(1154個(gè))與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定差異表達(dá)基因參與的最主要的能量代謝(光合有機(jī)物固碳、光合作用)，碳水化合物代謝(戊糖、果糖磷酸途徑、甘露糖代謝)、碳代謝、氨基酸代謝、萜類(lèi)化合物代謝和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(圖6)。差異表達(dá)基因中有本研究關(guān)注的pathway注釋的基因?yàn)?個(gè)，富集的途徑有5條，包括光合作用途徑(photosynthesis)1條、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(planthormonesignaltransduction)3條及萜類(lèi)主鏈生物合成途徑(Terpenoidsbackbonebiosynthesis)1條。其中基因Potassiumtransporter5-like(MSTRG.20565.1)表達(dá)量上調(diào)2.64倍，在光合作用途徑中負(fù)責(zé)K+運(yùn)輸；基因TIR(MSTRG.7397.8)表達(dá)量上調(diào)8.52倍，在生長(zhǎng)素合成途徑中負(fù)責(zé)生長(zhǎng)素的合成；基因AHP1(MSTRG.25736.1)表達(dá)量下調(diào)1.81倍，在細(xì)胞分裂素合成途徑中負(fù)責(zé)細(xì)胞分裂素的合成；基因CTR1(MSTRG.16160.5)表達(dá)量下調(diào)6.23倍，在乙烯合成途徑中負(fù)責(zé)乙烯的合成；基因FEI1(MSTRG.5636.3)表達(dá)量下調(diào)1.86倍，在萜類(lèi)主鏈生物合成途徑中負(fù)責(zé)細(xì)胞壁的合成。
2.5 差異表達(dá)基因的功能分析
2.5.1 亞麻低鉀下與鉀直接相關(guān)基因篩選
本研究在亞麻低鉀轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異基因中篩選出7個(gè)與鉀直接相關(guān)基因(表3)，包括4個(gè)鉀運(yùn)輸?shù)鞍?MSTRG.20565.1、MSTRG.24915.2、MSTRG.10817.1和MSTRG.6817.1)，2個(gè)鉀通道蛋白(MSTRG.4695.1和MSTRG.30540.1)及1個(gè)鈉鉀鈣交換蛋白(MSTRG.14498.2)。其中2個(gè)上調(diào)基因(MSTRG.20565.1和MSTRG.4695.1)，5個(gè)下調(diào)基因(MSTRG.24915.2、MSTRG.10817.1、MSTRG.30540.1、MSTRG.14498.2和MSTRG.6817.1)，這些基因可能在鉀脅迫響應(yīng)中起重要作用。
本研究發(fā)現(xiàn)，許多差異表達(dá)基因在低鉀脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控通路中扮演重要角色，如附圖1。1個(gè)AKT通道蛋白(上調(diào)2.15倍)，參與鉀通道轉(zhuǎn)運(yùn)，響應(yīng)于非生物脅迫；19個(gè)CIPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(上調(diào)1.46~11.76倍)，參與鈣信號(hào)傳導(dǎo)，響應(yīng)于非生物脅迫；1個(gè)CML信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(上調(diào)3.74倍)，參與鈣信號(hào)傳導(dǎo)，影響植物生理代謝；2個(gè)ARF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(下調(diào)3.25倍和4.61倍)，參與生長(zhǎng)素調(diào)控，影響側(cè)根發(fā)育；5個(gè)NRT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(下調(diào)1.14~4.69倍)，參與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。鑒于這些基因直接參與鉀信號(hào)傳導(dǎo)及K+運(yùn)輸，與Wang等報(bào)道一致。推測(cè)低鉀脅迫將直接影響這些基因的表達(dá)，進(jìn)而影響亞麻中鉀信號(hào)的傳導(dǎo)及K+運(yùn)輸，從而影響亞麻的表型。
2.5.2 亞麻低鉀下與激素相關(guān)基因篩選
在所有差異對(duì)比組中，共103個(gè)基因注釋到激素響應(yīng)蛋白功能，包括17個(gè)ABA響應(yīng)蛋白、16個(gè)乙烯響應(yīng)蛋白、22個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白、10個(gè)JA響應(yīng)蛋白以及38個(gè)細(xì)胞分裂素響應(yīng)蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，13個(gè)與激素直接相關(guān)的基因(表4)，其中1個(gè)TIR(上調(diào)8.52倍)，一種植物生長(zhǎng)素受體，參與植物生長(zhǎng)調(diào)控；2個(gè)AUX(下調(diào)1.44倍和1.51倍)，生長(zhǎng)素響應(yīng)基因，應(yīng)答生長(zhǎng)素效應(yīng)；1個(gè)ARF(下調(diào)9.62倍)，生長(zhǎng)素初期響應(yīng)基因；2個(gè)GH3(下調(diào)3.02倍和3.58倍)，植物生長(zhǎng)素原初反應(yīng)基因，參與植物生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)；1個(gè)AHP(下調(diào)1.81倍)，一種組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白，參與細(xì)胞分裂素的負(fù)向調(diào)控；1個(gè)EIN2(下調(diào)10.02倍)，乙烯信號(hào)關(guān)鍵基因，參與乙烯信號(hào)通路的正向調(diào)控；2個(gè)EBF(下調(diào)1.20倍和3.10倍)，負(fù)反饋調(diào)控EIN3，參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；3個(gè)CTR1(下調(diào)6.23倍、1.90倍和7.72倍)，介導(dǎo)乙烯受體的信號(hào)負(fù)調(diào)控乙烯反應(yīng)。
本研究篩選出生長(zhǎng)素合成通路6個(gè)基因，包括1個(gè)TIR、2個(gè)AUX、1個(gè)ARF、2個(gè)GH3，低鉀脅迫下，這些基因調(diào)控亞麻植株生長(zhǎng)，造成植株矮化；細(xì)胞分裂素合成通路1個(gè)基因AHP，低鉀脅迫下，AHP調(diào)控細(xì)胞分裂，造成亞麻植株矮化的表型；乙烯合成通路6個(gè)基因，包括3個(gè)CTR、1個(gè)EIN、2個(gè)EBF，低鉀脅迫下，這些基因引起亞麻植株衰老，即葉片變黃(附圖2)。這3個(gè)通路為揭示植物激素對(duì)低鉀脅迫反應(yīng)分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。低鉀脅迫可能誘導(dǎo)這些基因差異表達(dá)，調(diào)控激素合成，進(jìn)而影響亞麻的生長(zhǎng)發(fā)育。
2.5.3 亞麻低鉀下與纖維素相關(guān)基因篩選
本研究在差異表達(dá)基因中篩選出6個(gè)與纖維素相關(guān)基因(表5)，包括2個(gè)Exo70(下調(diào)8.70倍和2.13倍)，組成胞泌復(fù)合體的關(guān)鍵亞基，參與復(fù)合體在靶膜組裝；2個(gè)COB23(下調(diào)2.03倍和1.73倍)及1個(gè)COB21(下調(diào)1.94倍)，植物糖磷脂酰肌醇錨定蛋白，定向微纖絲，突變后阻礙纖維素合成；1個(gè)FEI1(下調(diào)1.86倍)，一種雙特異性蛋白激酶，參與纖維素合成。本研究篩選出2個(gè)Exo70、2個(gè)COB23、1個(gè)COB21和1個(gè)FEI1(附圖3)，鑒于這些基因直接參與纖維素合成，低鉀脅迫可能誘導(dǎo)這些基因表達(dá)，抑制亞麻纖維素合成，進(jìn)而調(diào)控產(chǎn)量形成。
2.6 RNA-Seq和qRT-PCR相關(guān)性
為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果，隨機(jī)選取Lus10024152、Lus10021422、Lus10028689、Lus10040830、Lus10024511、Lus10013304、Lus10024074和Lus100090928個(gè)基因用于qRT-PCR分析。2種方法得到的基因表達(dá)變化數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.91(圖7)，說(shuō)明RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)相對(duì)準(zhǔn)確，低鉀相關(guān)基因表達(dá)量結(jié)果可信。
3 討論
3.1 低鉀對(duì)亞麻表型的影響及亞麻響應(yīng)低鉀的時(shí)間
植物長(zhǎng)期受到低鉀脅迫時(shí)，會(huì)出現(xiàn)黃化病，老葉先顯現(xiàn)癥狀。植物低鉀影響莖葉及根的生長(zhǎng)發(fā)育。植株莖葉低鉀早期老葉葉尖失綠。隨低鉀時(shí)間增加，萎黃癥狀從老葉轉(zhuǎn)移到新葉。嚴(yán)重低鉀時(shí)，植物葉子從葉尖到整個(gè)葉緣顯現(xiàn)出萎黃病，最終壞死。隨腐胺在葉片中積累，植物葉片萎黃并發(fā)生大量褐斑。與上述植物低鉀表型相似，低鉀亞麻植株出現(xiàn)葉片邊緣變黃癥狀，并表現(xiàn)出矮化的表型。
研究表明，西瓜低鉀響應(yīng)早期和后期的時(shí)間點(diǎn)分別為6h和120h。而本研究通過(guò)亞麻低鉀8個(gè)時(shí)間點(diǎn)篩選出12h和96h為亞麻低鉀響應(yīng)的早期和后期時(shí)間點(diǎn)。與西瓜低鉀響應(yīng)不同的是，亞麻低鉀響應(yīng)早期時(shí)間(12h)晚于西瓜(6h)，但亞麻后期響應(yīng)時(shí)間(96h)早于西瓜(120h)。
3.2 植物低鉀脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控
本研究2個(gè)ARF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(下調(diào)3.25倍和4.61倍)，參與生長(zhǎng)素調(diào)控，影響側(cè)根發(fā)育；5個(gè)NRT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(下調(diào)1.14~4.69倍)，參與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。鑒于這些基因直接參與鉀信號(hào)傳導(dǎo)及鉀離子運(yùn)輸，與Wang等報(bào)道一致。推測(cè)低鉀脅迫將直接影響這些基因的表達(dá)，進(jìn)而影響亞麻中鉀信號(hào)的傳導(dǎo)及K+運(yùn)輸，從而影響亞麻的表型。
鉀是植物生長(zhǎng)所需的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。對(duì)低K+條件的適應(yīng)性機(jī)制主要為鈣調(diào)磷酸酶B樣蛋白(CalcineurinB-likeCalciumSensors，CBL)和CBL相互作用激酶(CBL-InteractingProteinKinases，CIPK)組成的Ca2+信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。低鉀脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控通路涉及大量膜上K+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和離子通道基因及細(xì)胞質(zhì)和核中一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。低鉀脅迫通過(guò)調(diào)控細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白影響膜上相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和離子通道基因表達(dá)(附圖1)。本研究低鉀脅迫發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)基因，AKT通道蛋白在亞麻低鉀處理后其表達(dá)量上調(diào)2.15倍，而擬南芥中CIPK23及KC1協(xié)同調(diào)控AKT1介導(dǎo)低鉀脅迫，水稻中過(guò)表達(dá)AKT1可通過(guò)提高組織內(nèi)K+含量提高植株對(duì)滲透和干旱脅迫抗性，說(shuō)明AKT通道蛋白在亞麻和擬南芥或水稻有類(lèi)似功能；發(fā)現(xiàn)CIPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在亞麻低鉀處理后其表達(dá)量上調(diào)1.46~11.76倍，而楊樹(shù)中CBL-CIPK信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控Shaker-like鉀通道增加對(duì)低鉀脅迫耐受性，說(shuō)明CIPK信號(hào)通路在亞麻和楊樹(shù)有類(lèi)似功能；發(fā)現(xiàn)ARF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在亞麻低鉀處理后其表達(dá)量下調(diào)3.25倍和4.61倍，而擬南芥中低鉀脅迫下ARF2磷酸化可解除對(duì)K+轉(zhuǎn)運(yùn)基因HAK5抑制，促進(jìn)鉀吸收，說(shuō)明ARF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在亞麻和擬南芥有類(lèi)似功能；發(fā)現(xiàn)NRT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在亞麻低鉀處理后其表達(dá)量下調(diào)1.14~4.69倍，而擬南芥中NPF7.3/NRT1.5介導(dǎo)的NO3-遷移可通過(guò)調(diào)控SKOR影響K+從根到芽遷移，說(shuō)明NRT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在亞麻和擬南芥有類(lèi)似功能。鑒于這些基因在低鉀脅迫亞麻中的表達(dá)明顯改變，推測(cè)這些基因在亞麻對(duì)低鉀脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。
3.3 植物激素在低鉀脅迫中的作用
植物激素廣泛參與逆境生理和生化反應(yīng)。乙烯是植物對(duì)非生物脅迫應(yīng)答中重要信號(hào)分子之一，它與乙烯受體等主要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游基因表達(dá)，觸發(fā)乙烯應(yīng)答。生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)ARF/AUX/GH3等基因在植物脅迫應(yīng)答中快速瞬時(shí)高表達(dá)。脫落酸作為植物地下-地上部分之間信息傳遞的中心媒介，通過(guò)激活K+進(jìn)出細(xì)胞路徑誘導(dǎo)細(xì)胞膨脹壓變化。植物激素也相互影響，乙烯和生長(zhǎng)素通過(guò)抑制主根生長(zhǎng)而促進(jìn)根毛伸長(zhǎng)，從而對(duì)低鉀脅迫下根系形態(tài)發(fā)育起指導(dǎo)作用。生長(zhǎng)在低鉀條件的植物根形態(tài)類(lèi)似于生長(zhǎng)在響應(yīng)外源乙烯和生長(zhǎng)素處理的形態(tài)。低鉀條件下，乙烯合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)。
4 結(jié)論
利用qRT-PCR篩選出亞麻對(duì)低鉀響應(yīng)強(qiáng)烈的3個(gè)標(biāo)記基因及內(nèi)參分別為：LusKC1、LusSKOR、LusHAK5和LusActin。鉀脅迫相關(guān)基因?qū)Φ外涰憫?yīng)高峰時(shí)間出現(xiàn)在12h和96h。通過(guò)低鉀轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析和挖掘，確定7個(gè)與鉀直接相關(guān)基因(4個(gè)鉀運(yùn)輸?shù)鞍住?個(gè)鉀通道蛋白及1個(gè)鈉鉀鈣交換蛋白)，低鉀脅迫直接影響亞麻這些基因的表達(dá)，進(jìn)而影響亞麻中鉀信號(hào)的傳導(dǎo)及K+運(yùn)輸；確定13個(gè)與激素相關(guān)基因(生長(zhǎng)素合成通路6個(gè)基因、細(xì)胞分裂素合成通路1個(gè)基因和乙烯合成通路6個(gè)基因)，低鉀脅迫誘導(dǎo)這些基因表達(dá)，調(diào)控激素合成，進(jìn)而影響亞麻生長(zhǎng)發(fā)育；確定6個(gè)與纖維素合成相關(guān)基因(2個(gè)EXOCYST、3個(gè)COB和1個(gè)FEI基因)，低鉀脅迫誘導(dǎo)這些基因表達(dá)抑制亞麻纖維素合成，進(jìn)而調(diào)控產(chǎn)量形成。
文章來(lái)源：黃文功,姜衛(wèi)東,姚玉波,宋喜霞,劉巖,陳思,趙東升,吳廣文,袁紅梅,任傳英,孫中義,吳建忠,康慶華.亞麻響應(yīng)低鉀脅迫轉(zhuǎn)錄譜分析[J/OL].作物學(xué)報(bào):1-13[2021-02-17].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201215.0849.006.html.
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