作者：陳文濤等
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發(fā)布時間：2021-10-13
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[麻進展]紅麻HcMS1基因的克隆、表達與功能分析
摘 要：為挖掘紅麻雄性不育核基因，解釋紅麻花蕾敗育的分子機理，通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用同源克隆的方法從紅麻花藥中克隆出擬南芥MALE STERILITY1(MS1)的同源不育基因，并命名為HcMS1基因。利用生物信息學方法對HcMS1蛋白進行結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及親緣關(guān)系等分析，并通過qRT-PCR分析HcMS1基因在紅麻不育系、保持系不同時期的表達水平；構(gòu)建過表達載體，利用葉盤法轉(zhuǎn)化本氏煙草并對轉(zhuǎn)基因煙草進行表型觀察。HcMS1基因序列開放閱讀框(ORF)為1 950bp，編碼649個氨基酸。生物信息學分析顯示，HcMS1蛋白為親水蛋白，定位在細胞核上且含有典型PHD-finger結(jié)構(gòu)域，沒有信號肽和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，與陸地棉MS1蛋白親緣關(guān)系最近，其次為木槿MS1蛋白。qRT-PCR結(jié)果表明，HcMS1基因的表達量在保持系和不育系中均呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢，且在紅麻花蕾的四分體至單核期表達量最高，這與擬南芥中MS1基因表達模式一致；另外在保持系中基因的表達水平顯著高于不育系，推測紅麻敗育與HcMS1基因的低量表達相關(guān)。通過遺傳轉(zhuǎn)化試驗發(fā)現(xiàn)，HcMS1轉(zhuǎn)基因煙草株型較矮，花萼大小不一，花筒長度縮短，并出現(xiàn)自交不結(jié)實的現(xiàn)象，說明紅麻HcMS1基因的異源表達有影響本氏煙草正常育性的功能。從紅麻花藥中成功克隆出核不育相關(guān)基因HcMS1，并對其進行功能分析，為后續(xù)紅麻雄性不育育種工作提供了一定的理論依據(jù)與基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：紅麻雄性不育；HcMS1基因；生物信息學分析；表達分析；煙草轉(zhuǎn)化
紅麻(Hibiscus cannabinus L.)是錦葵科木槿屬一年生纖維作物，具有抗旱、耐鹽堿、適應性廣、生物量大等特性，在造紙、紡織、建筑材料、復合材料、水土保持、吸附劑、飼料、栽培基質(zhì)等方面有良好的應用價值，還可有效地緩解土壤重金屬污染問題。
紅麻有明顯的雜種優(yōu)勢，雜交紅麻的韌皮纖維或生物產(chǎn)量可提高40%左右。雄性不育是利用雜種優(yōu)勢的一條有效途徑，利用細胞質(zhì)雄性不育(Cytoplas-mic male sterility)構(gòu)建三系配套進行雜交制種可以免去人工去雄，同時提高雜交種子的純度。目前，國內(nèi)關(guān)于紅麻雄性不育分子機理的研究工作已陸續(xù)開展。趙艷紅構(gòu)建紅麻線粒體atp9基因過表達載體轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)在陽性植株出現(xiàn)葉形、株高、花冠性狀異常且花藥不正常的現(xiàn)象，另外對線粒體基因atp9、atp6和atpA的RNA編輯研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)變的氨基酸大多以非極性氨基酸取代極性氨基酸。史奇奇以紅麻不育系UG93A和保持系UG93B花藥為樣品，分別建立smallRNA文庫，并使用高通量測序技術(shù)鑒定42個保守miRNA和41個新的miRNA。韋范通過乙酰化蛋白質(zhì)組學分析在UG93A和UG93B花藥中鑒定到56個乙?；揎棽町惖鞍祝l(fā)現(xiàn)乙?；蛘{(diào)控GAPDH酶活力以及組蛋白乙?；{(diào)控了細胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生。李增強等通過研究紅麻不育系UG93A和保持系UG93B葉片和不同時期花藥基因組DNA甲基化情況，發(fā)現(xiàn)甲基化變化的基因在不育系和保持系之間的表達差異顯著，推測這些甲基化變化在雄性不育中發(fā)揮了重要的作用。錢景華、陳勵虹等分別克隆紅麻轉(zhuǎn)錄因子MYB21基因和編碼生長素受體的TIR1基因，分析基因表達模式并構(gòu)建了過表達載體和沉默載體。Chen等通過對紅麻不育系、保持系的轉(zhuǎn)錄組測序檢測到838個顯著上調(diào)基因和528個顯著下調(diào)基因，并將其注釋到155個GO和74條KEGG代謝通路上。隨著對紅麻不育機理的研究增多，更多的不育基因得到挖掘，復雜的作用機制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)逐漸清晰，將在紅麻生產(chǎn)實踐發(fā)揮重要的作用。
絨氈層參與花粉壁物質(zhì)合成，為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)并適時地分泌胼胝質(zhì)酶以釋放小孢子，其在花藥發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1遺傳途徑被證實調(diào)控擬南芥絨氈層發(fā)育，其中DYT1、TDF1和AMS在絨氈層早期發(fā)育中起作用，而MS188和MS1在絨氈層晚期發(fā)育中起重要作用。MS1是MS188的直接靶點，在調(diào)控擬南芥孢子體花粉外殼蛋白基因的表達起關(guān)鍵作用。MS1在擬南芥中編碼 PHD-finger蛋白，在四分體期的絨氈層中表達，其突變體不能產(chǎn)生有活力的花粉，花粉在四分體釋放小孢子后不久退化，絨氈層也出現(xiàn)異?？张莼?。本試驗在前期紅麻不育系LC0301A和保持系LC0301B的花藥轉(zhuǎn)錄本中，發(fā)現(xiàn)一個顯著差異表達的基因，其編碼蛋白序列與澳洲棉MS1蛋白有90%一致性、與擬南芥MS1蛋白有50%一致性，命名其為HcMS1基因。通過同源克隆的方法獲得了紅麻HcMS1基因，利用生物信息學預測該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、保守域和親緣進化關(guān)系等，通過qRT-PCR對紅麻不育系、保持系不同時期的花藥進行表達量分析，并構(gòu)建過表達載體對本氏煙草進行遺傳轉(zhuǎn)化試驗，以驗證HcMS1基因可能在紅麻不育中發(fā)揮一定的作用。
1材料和方法
1.1試驗材料
1.1.1植物材料
試驗所用紅麻品種不育系LC0301A和保持系LC0301B由中國農(nóng)業(yè)科學院麻類所一年生創(chuàng)新育種團隊提供，種植于麻類所長沙創(chuàng)新試驗基地。根據(jù)李建軍等劃分紅麻花粉發(fā)育時期的標準，按照花蕾的大小分為4個時期：造孢細胞和小孢子母細胞至減數(shù)分裂時期為花蕾一期，四分體到單核期為花蕾二期，雙核期為花蕾三期，花粉成熟期為花蕾四期；取各時期花藥于－80℃冰箱保存。
1.1.2試劑、載體與菌株
TRIzol液，DNAaseI，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa Ex Taq® DNA Polymerase，DNA回收試劑盒，pBLUE-T載體、Pcambia2301-ky過表達載體，T4DNA連接酶，各種相關(guān)限制性內(nèi)切酶購于武漢金開瑞生物工程有限公司。SteadyPure植物RNA提取試劑盒，Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑，SYBR Green qPCR試劑盒購于湖南艾科瑞生物工程有限公司。大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，農(nóng)桿菌菌株GV3101購于長沙天楚生物科技有限公司。
1.2試驗方法
1.2.1總RNA提取及cDNA合成
以不育系LC0301A和保持系LC0301B的花藥為材料，采用T-Izol法提取紅麻總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性；采用TOYOBO公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Re-verTra Ace qPCR RT Kit)進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA以用于基因克隆。使用SteadyPure植物RNA提取試劑盒提取4個時期的不育系、保持系紅麻花藥RNA，使用EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA用于qRT-PCR。
1.2.2紅麻HcMS1基因的PCR擴增及克隆
根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)，分析鑒定紅麻HcMS1基因轉(zhuǎn)錄本，利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffind-er/)的Open Reading Frame Finder找出紅麻HcMS1的開放閱讀框。用此序列在Primer6.0軟件中設(shè)計特異性克隆引物(表1)，以紅麻花蕾cDNA為模板，使用Taq酶擴增HcMS1基因的CDS序列，擴增程序:94℃預變性3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶連接到pBLUE-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，37℃，100mg/L氨芐青霉素LB培養(yǎng)基上抗性篩選，挑取陽性克隆進行測序驗證。
1.2.3生物信息學分析
Prot Param(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)ProtScale(https://web.expasy.org/protscal；www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；SignalP-5.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白質(zhì)是否含有信號肽；ProtComp9.0進行亞細胞定位進行分析；Inter-Pro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；SOPMA分析和預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；Phyre2分析預測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；MEGA7.0軟件構(gòu)建分子進化樹。
1.2.4實時熒光定量
PCR根據(jù)HcMS1序列設(shè)計熒光定量引物(表1)，以紅麻GAPDH基因為內(nèi)參基因(表1)，以不同樣品反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板。反應體系為20μL，包含1μL模板，10μL2×SYBRPremix、10μmol/L上游引物和下游引物各0.4μL、滅菌水補足20μL。定量在BioRadCFX96qPCR儀進行，程序設(shè)置為：95℃預變性2min；95℃5s，60℃30s，40個循環(huán)后進行熔解曲線分析，以確定引物的特異性?；蛳鄬Ρ磉_量采用公式2－ΔΔCt計算，使用SPSS21進行單因素方差分析，利用Origin9進行繪圖。
1.2.5HcMS1基因過表達載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化
根據(jù)HcMS1基因的ORF序列信息，選用SacⅠ/BamHⅠ內(nèi)切酶為酶切位點并設(shè)計擴增引物，引物序列為MS1-F2/R2(表1)，以TA克隆為模板進行HcMS1基因的PCR擴增克隆。SacⅠ/BamHⅠ雙酶切pcam-bia2301-ky載體和HcMS1目的基因，回收HcMS1片段和pcambia2301-ky載體，進行連接反應。反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌并在50mg/L卡那霉素(Kana)和50mg/L利福平(Rif)抗性平板上進行篩選，挑取單克隆菌落過夜搖菌并進行菌落PCR驗證，將PCR陽性菌落提取質(zhì)粒后進行測序，測序引物為35S-F/2301-F(表1)。將測序后比對成功的過表達載體質(zhì)粒，采用凍融法轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌并在50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平抗性平板上28℃進行篩選，挑取單克隆菌落180r/min過夜搖菌15h，加入等量60%甘油于－80℃超低溫保存待用。
本氏煙草轉(zhuǎn)化試驗參考王會強葉盤法轉(zhuǎn)化煙草的方法。切取無菌培養(yǎng)的煙草葉片預培養(yǎng)2d；農(nóng)桿菌侵染液濃度(OD600)為0.5，侵染時間為5～8min；煙草葉片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)最佳時間為2d。各時期培養(yǎng)基配方為:預培養(yǎng)、共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA)，分生培養(yǎng)基(MS+1mg/L6-BA+0．1mg/LNAA+50mg/LKana+500mg/LCef)，生根培養(yǎng)基(MS+0．25mg/LNAA+50mg/LKana+500mg/LCef)。
2結(jié)果與分析
2.1HcMS1基因的克隆
TRIzol法提取RNA后取500ng進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA用于后續(xù)試驗。以上述cDNA為模板擴增目的基因HcMS1，擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(圖1-A)，擴增產(chǎn)物與目的片段大小一致且無雜帶。將擴增PCR產(chǎn)物切膠回收后克隆到T載體上，藍白斑篩選后進行菌落PCR擴增，擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(圖1-B)顯示，在2 000bp處有明顯的目的條帶，且無特異性擴增。分別取2個菌落PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)化子進行測序驗證，將測序結(jié)果與原始參考序列進行比對，HcMS1基因比對結(jié)果(圖2)顯示，測序結(jié)果和參考序列比對結(jié)果一致，克隆成功。
2.2HcMS1基因的生物信息學分析
利用Prot Param網(wǎng)站，對紅麻HcMS1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析。結(jié)果顯示：HcMS1基因序列開放閱讀框(ORF)為1 950bp，共編碼氨基酸數(shù)649，包含20種常見氨基酸(表2)，原子總數(shù)10 279，分子量73．566 72ku，分子式為C3270H5118N910O938S43，由于含有43個硫原子，故蛋白中可能存在二硫鍵。帶負電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為76，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為79，理論pI為7．89。HcMS1蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)為30．80，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪指數(shù)為86．30，親水性指數(shù)平均值(GRAVY)為－0．221，更偏向為親水蛋白。
第16位氨基酸出現(xiàn)最低值－3．411，親水性最強，在第80位氨基酸出現(xiàn)最高值2．444，疏水性最強。整體看疏水氨基酸和親水氨基酸分布較均勻，偏向為親水蛋白。利用TMHMM在線分析HcMS1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3-B)，HcMS1蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，推測為膜外蛋白。
利用SOPMA預測HcMS1蛋白二級結(jié)構(gòu)(圖4-A)，HcMS1蛋白由α-螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成，分別占整個肽鏈的37．90%，15．87%，3．85%，42．37%。利用Phyre2模擬HcMS1蛋白三級結(jié)構(gòu)。建模過程中共搜索1 000條序列與目的蛋白序列進行比對，報告單按照置信度大小列出前120條序列模型，并以99．0%置信度，10%序列長度覆蓋度的d1weea(FYVE/PHD zincfinger)蛋白為參考建立模型(圖4-B)。
2.2.2信號肽、結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位分析
通過SignalP-5．0Server分析(圖5-A)，N端前70位氨基酸殘基，存在信號肽的概率幾乎為零，故推測Hc-MS1蛋白沒有信號肽，屬于非分泌蛋白。利用Inter-Pro在線分析(圖5-B)，HcMS1蛋白預測到多個結(jié)構(gòu)域(591－641位Znf－PHD-finger、594－640位PHD、593－639位Znf－PHD)，同源性超家族(590－644位Znf－FYVE－PHD、576－643位Znf－RING/FYVE/PHD)和保守序列(594－638位Zinc－finger－PHD-type－CS)。ProtComp9．0分析HcMS1蛋白亞細胞定位于細胞核。
2.2.3進化樹分析
在NCBI的BlastP中輸入HcMS1蛋白序列，在non-redundant protein sequences庫中搜索，獲得多個物種的同源蛋白并下載靠前的20個物種MS1蛋白序列，其中包括:陸地棉(Gos-sypium hirsutum)、榴蓮(Durio zibethinus)、木槿(Hi-biscus syriacus)、百花鶴望蘭(Herrania umbratica)、栓皮櫟(Quercus suber)、蓖麻(Ricinus communis)、巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)、番木瓜(Carica papaya)、毛果楊(Populus trichocarpa)、山茶花(Camelliasinensis)、桑樹(Morella rubra)、木薯(Manihot escu-lenta)、大麻(Cannabis sativa)、甜櫻桃(Prunus avi-um)、葡萄(Vitis vinifera)、相思子(Abrus precatori-us)、鷹嘴豆(Cicer arietinum)、月季(Rosa chinensis)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、大豆(Glycinemax)。利用MEGA7．0軟件，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。分析構(gòu)建結(jié)果(圖6)，其中陸地棉MS1蛋白與紅麻HcMS1蛋白進化關(guān)系最近，其次為木槿。
2.3HcMS1表達模式分析
不同時期HcMS1表達模式分析顯示(圖7)，在不育系和保持系的紅麻花藥中，HcMS1的表達隨著花蕾的發(fā)育均呈現(xiàn)先升高、后下降的趨勢，其在二期表達量最高，其次是三期，在四期的表達量最低，相對表達量僅為0．1，0．01。比較不育系與保持系發(fā)現(xiàn)，保持系二期相對表達量為90．35，是不育系二期表達量的2．5倍，在P值0．05水平下呈現(xiàn)顯著差異。在保持系中，HcMS1于二期表達量超高，而在其他時期均為極低的表達水平，這與擬南芥MS1僅在小孢子釋放期表達事實相吻合；相比保持系，不育系HcMS1表達周期較長，在二期、三期均有相對較高的表達量，且在一期、四期表達水平均高于保持系。
2.4HcMS1基因過表達載體構(gòu)建和煙草轉(zhuǎn)化
2.4.1過表達載體構(gòu)建
將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在2000bp處有明顯目的條帶(圖8)。取PCR陽性菌落提取質(zhì)粒后進行測序，比對結(jié)果顯示目的基因序列與參考序列一致，表示過表達載體構(gòu)建成功(圖9)。
2.4.2遺傳轉(zhuǎn)化
圖中培養(yǎng)基無污染、苗狀態(tài)健康(圖10-A)。將生根的煙草組培苗經(jīng)煉苗后移植到滅菌土中繼續(xù)培養(yǎng)，提取野生型煙草和轉(zhuǎn)化煙草的新鮮葉片DNA，使用測序引物35S-F/2301-F(表1)進行PCR擴增片段，電泳后對比野生型發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化煙草在2000bp處有目的條帶，證明HcMS1轉(zhuǎn)化成功(圖10-B)，對煙草成熟期觀察發(fā)現(xiàn):野生型煙草株型較高，可以正常結(jié)實，6片花萼大小均勻，花柱較長，果實大且飽滿；而轉(zhuǎn)基因煙草株型較矮，無法正常結(jié)實，6片花萼大小不一，花柱短小，兩者對比有明顯的差異(圖11)。表明通過葉盤法轉(zhuǎn)化獲得的HcMS1過表達轉(zhuǎn)基因本氏煙草無法正常自交結(jié)實，存在不育現(xiàn)象。
3討論與結(jié)論
紅麻不育機理研究目前主要在細胞生物學、分子生物學方面開展工作。在細胞生物學方面，主要通過研究花藥不同發(fā)育時期絨氈層和各組織化學成分變化，來確定花S藥敗育時期。大量研究表明，花藥絨氈層發(fā)育異常是花粉敗育的重要細胞學原因。朱麗梅等對紅麻細胞質(zhì)雄性不育系L23A和K03A的小孢子敗育過程進行了細胞學觀察，發(fā)現(xiàn)其敗育發(fā)生在四分體及單核小孢子時期。一年生麻類作物創(chuàng)新團隊在前期已通過對不育系LC0301A和保持系LC0301B不同時期的花藥細胞學觀察發(fā)現(xiàn)，不育系發(fā)生敗育的主要時期為單核期，單核期不育系的絨氈層退化嚴重，小孢子出現(xiàn)畸形，不能形成正常的花粉粒。
MS1基因編碼PHD轉(zhuǎn)錄因子并參與調(diào)控花粉和絨氈層發(fā)育。目前MS1基因的功能在擬南芥中研究比較詳細，水稻、小麥等其他作物也相繼開展MS1基因的挖掘與分析工作。關(guān)于擬南芥的MS1基因的研究，早在21世紀初始便積極展開。Wilson等在2001年報道:擬南芥MS1突變體的花粉在四分體釋放小孢子后不久即發(fā)生退化，絨氈層也出現(xiàn)空泡化；MS1在小孢子釋放期的絨氈層部位低水平表達，缺失基因會導致其編碼蛋白的提前終止和PHD-finger基序的丟失。Ito等通過轉(zhuǎn)座子敲除擬南芥MS1基因，小孢子在四分體中分離出來即發(fā)生外層缺失；MS1基因僅在四分體的很短時期內(nèi)于絨氈層表達，并將MS1定位在細胞核上。2007年，Ito等通過構(gòu)建MS1-SRDX融合結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化擬南芥揭示了MS1具有轉(zhuǎn)錄激活因子的功能，參與花粉外壁、花粉胞質(zhì)和絨氈層的發(fā)育。2006年，Vizcay-Barrena等通過TUNEL染色和超微結(jié)構(gòu)分析，野生型絨氈層在小孢子有絲分裂Ⅰ后發(fā)生程序性細胞死亡(PCD)，而MS1突變體的絨氈層中未觀察到PCD的跡象。隨著人們認識到MS1基因?qū)φ{(diào)控擬南芥雄性不育的重要性，該基因的挖掘開發(fā)也在別的作物上相繼展開。2011年，Li等在水稻中的報道了一個擬南芥MS1同源基因PTC1，該基因編碼PHD-finger蛋白，控制絨氈層程序化發(fā)育和功能性花粉的形成，其突變體的絨氈層發(fā)生增殖失控和壞死樣死亡。2017年，Wang等在小麥中克隆并鑒定MS1基因，其在小孢子母細胞中特異性表達，編碼的蛋白定位于質(zhì)體和線粒體膜，具有磷脂酶結(jié)合活性；Tucker等發(fā)現(xiàn)小麥ms1可完全恢復了ms1d突變體的育性，編碼一種花粉外壁發(fā)育所必需的糖基磷脂酰肌醇錨定的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白。本試驗從紅麻不育系和保持系的花藥中克隆出一個與擬南芥MS1基因相似度較大的同源基因HcMS1，前期通過細胞生物學的手段發(fā)現(xiàn)導致不育系花粉敗育的原因在于絨氈層PCD異常，絨氈層退化嚴重且提前，這與擬南芥中報道的MS1調(diào)控絨氈層PCD發(fā)育相似；同時通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)HcMS1花蕾二期的表達量在保持系中顯著高于不育系，且在保持系中該基因幾乎只在花蕾二期高度表達，這又與擬南芥MS1表達模式相符合，另外相比保持系，不育系在較長時間都保持著較高水平的表達，推測HcMS1表達時期的紊亂也可能是導致紅麻不育的原因之一。綜合以上，推測HcMS1基因在調(diào)控紅麻雄性不育的過程中亦發(fā)揮著一定的作用。
唐文武等以擬南芥花粉發(fā)育關(guān)鍵基因MS1為參考序列，通過Blast比對獲得蕓薹屬作物同源基因序列，運用生物信息學方法對其編碼氨基酸序列進行預測分析，為作物雜種優(yōu)勢利用提供理論參考。高嵩等同源克隆玉米ZmUdtl基因并利用生物信息學分析預測蛋白性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等，為后期的克隆和功能鑒定奠定基礎(chǔ)。為了預測HcMS1基因的結(jié)構(gòu)功能，挖掘基因潛在信息，本試驗通過生物信息學方法對HcMS1蛋白進行預測分析。結(jié)果顯示，該蛋白為親水蛋白，沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，存在典型的PHD-finger結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域廣泛存在于雄性不育基因MS1編碼蛋白中；其亞細胞定位在細胞核上，推斷HcMS1蛋白可能作為轉(zhuǎn)錄因子，作用于細胞核上，調(diào)控與育性相關(guān)的基因表達。進化樹分析結(jié)果顯示，紅麻HcMS1蛋白與陸地棉MS1蛋白親緣關(guān)系最近。
煙草作為一種模式植物，其轉(zhuǎn)基因體系已相當成熟，目前有很多在煙草上進行異源表達的研究，且大都獲得了與研究目的有關(guān)聯(lián)的價值性狀。試驗通過本氏煙草遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)，35S強啟動子過表達HcMS1基因在陽性轉(zhuǎn)基因煙草中表現(xiàn)為植株矮化、花萼變小且大小不均、花柱縮短、無法結(jié)實，說明過表達HcMS1基因有影響本氏煙草正常育性的功能，為驗證HcMS1是調(diào)控紅麻雄性不育的關(guān)鍵基因提供了有力的支撐?？傊?，本研究利用同源克隆方法在紅麻花藥中克隆出HcMS1基因，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)HcMS1蛋白有顯著的PHD結(jié)構(gòu)保守域，其亞細胞定位于細胞核上，很有可能以轉(zhuǎn)錄因子的形式調(diào)控育性基因的表達。此外，qRT-PCR結(jié)果顯示，HcMS1基因在紅麻保持系花蕾的四分體至單核期高量表達，符合擬南芥MS1基因表達模式。最后，通過本氏煙草遺傳轉(zhuǎn)化試驗，在獲得的HcMS1過表達本氏煙草上發(fā)現(xiàn)了顯著的不結(jié)實現(xiàn)象。本研究克隆出紅麻HcMS1基因，并結(jié)合生物信息學、基因表達和煙草轉(zhuǎn)化對其進行分析，為挖掘紅麻不育調(diào)控基因提供了一定信息資源，為日后該基因的深度功能解析做好了鋪墊。
文章摘自 陳文濤,潘根,唐慧娟,常麗,李德芳,趙立寧,陳安國,李建軍.紅麻HcMS1基因的克隆、表達與功能分析[J].華北農(nóng)學報,2021,36(04):64-74.
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