摘  要：研究大麻二酚（CBD）緩解由于表面活性劑、機械損傷、防腐劑導(dǎo)致的肌膚紅腫、熱脹、發(fā)麻的功效。通過十二烷基硫酸鈉（SDS）刺激模型、膠帶撕拉模型測定經(jīng)皮水分流失TEWL值、血紅素EI值、皮膚紅度a^*值的變化程度,評價不同濃度CBD的抗炎和舒緩抗刺激功效。用苯氧乙醇刺激模型評價CBD即時舒緩刺痛、發(fā)燙感的效果；用雞胚絨毛尿囊膜模型（HET-CAM）評價CBD抗刺激性能力。結(jié)果表明,質(zhì)量分數(shù)0.05%和0.1%的CBD在膠帶黏貼試驗中于7天后能達到81.05%和87.35%的損傷修復(fù)率。0.05%和0.1%的CBD能夠降低皮膚受到外界刺激因素后的TEWL值、EI值和a^*值,并且修復(fù)皮膚屏障功能,同時改善皮膚紅斑情況,對受損皮膚具有一定的舒緩修復(fù)功效。

關(guān)鍵詞：大麻二酚；SDS刺激模型；膠帶撕拉模型；皮膚屏障；舒緩修復(fù)

 

大麻屬于木蘭綱（Magnoliopsida）蕁麻目（Urticales）大麻科（Cannabinaceae）大麻屬（Cannabis）大麻種（Cannabis sativa L.）的一年生草本植物。大麻葉中含有多酚、黃酮和植物堿等活性成分^[1]。凌年等^[2]研究發(fā)現(xiàn)，大麻葉中普遍含有大麻酚類化合物（Cannabinoid），從大麻葉提取物中分離出超過525種物質(zhì)，其中大麻酚類化合物至少有86種。大麻酚包括大麻二酚（CBD）、四氫大麻酚（THC）、六氫大麻酚（CBN）、大麻環(huán)萜酚（CBC）、大麻萜酚（CBGB）等。研究表明，CBD在醫(yī)學(xué)上具有減輕驚厥、炎癥、焦慮和嘔吐的作用，可治療神經(jīng)性皮炎。CBD是皮膚中具有的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的元素，即內(nèi)源性大麻素化合物（AEA和2-AG）、代謝型（CB1R和CB2R）和大麻素的離子型（TRPV-1）受體以及參與內(nèi)源性大麻素合成的代謝酶（例如FAAH和MAGL）^[3-5]。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)中的各種元素均是參與皮膚調(diào)節(jié)的關(guān)鍵機制，如控制表皮和皮膚附件的生長、細胞存活、免疫和炎癥反應(yīng)、傳遞感覺到中樞神經(jīng)系統(tǒng)（例如疼痛、瘙癢等）以及脂質(zhì)的合成等^[6]。大麻提取物的活性成分大麻素具有重要藥理和生理活性，目前對于大麻素類物質(zhì)，尤其是大麻素中含量較多的大麻二酚的應(yīng)用主要集中在消炎和對損傷細胞的修復(fù)方面，在皮膚舒緩及抗刺激應(yīng)用方面的研究極少^[7-8]。

在日常所用到的化妝品中，有些人使用過后往往會有發(fā)熱、刺痛、瘙癢感。如使用洗面奶后會刺痛，這種不良感覺往往是由于洗面奶等化妝品中的表面活性劑、防腐劑、多元醇類的物質(zhì)給皮膚帶來紅腫、熱脹和發(fā)麻瘙癢的感覺^[9]。

十二烷基硫酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，其作用于皮膚能影響角質(zhì)層脂質(zhì)和蛋白質(zhì)合成進而破壞皮膚屏障功能，引起刺激性接觸性皮炎的發(fā)生^[10-11]。SDS刺激試驗已成為研究刺激性接觸性皮炎的一個經(jīng)典的模型。據(jù)國內(nèi)外大量文獻報道，使用SDS刺激后，皮膚的生理參數(shù)如經(jīng)皮水分流失量（TEWL）、血紅素（EI）以及皮膚顏色紅度（a*值）將發(fā)生改變。膠帶黏貼模型原理是膠帶黏貼皮膚后會移去部分角質(zhì)細胞及細胞間脂質(zhì)，造成皮膚屏障功能的損傷，因此膠帶黏貼試驗常被用作皮膚物理性刺激的模型^[12-15]。

本文將通過CK儀器研究大麻二酚緩解肌膚由于表面活性劑、機械損傷、防腐劑導(dǎo)致的肌膚紅腫、熱脹和發(fā)麻。通過SDS刺激模型、膠帶撕拉模型測定經(jīng)皮水分流失TEWL值、血紅素EI值、皮膚紅度a*值的變化程度，評價不同濃度CBD的抗炎、舒緩抗刺激功效。用苯氧乙醇刺激模型評價CBD即時舒緩刺痛、發(fā)燙感的效果；用雞胚絨毛尿囊膜模型（HET-CAM）評價CBD抗刺激性能力。本次研究采用主觀評分和儀器檢測相結(jié)合的方法來評價CBD的功效，為CBD在舒緩抗刺激護膚品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為舒緩功效類的化妝品原料及成品的評價、應(yīng)用開發(fā)提供測試方法參考。

1試驗部分

1.1試劑與儀器

大麻二酚（純度99%，樂爾福）；十二烷基硫酸鈉（[Sodium Dodecyl Sulfate,SDS），德國巴斯夫]；用去離子水配制質(zhì)量分數(shù)1%SDS水溶液；斑貼器（Finn Chambers，SmartPractice R）；固定膠帶MicroscopeTM（低致敏外用膠布，3M）。樣品組配制：不同質(zhì)量分數(shù)的大麻二酚（0.01%、0.05%和0.1%）+2%丁二醇+0.1%卡波姆U10+0.1%三乙醇胺+0.4%苯氧乙醇+離子水（加至100%）。基質(zhì)組配制：質(zhì)量分數(shù)2%丁二醇+0.1%卡波姆U10+0.1%三乙醇胺+0.4%苯氧乙醇+離子水（加至100%）。儀器：Mexameter MX18皮膚黑色素和血紅素測試儀、Colormeter CL400皮膚顏色測試儀，德國CK公司；VISIA-CR面部圖像分析系統(tǒng)，美國Canfield公司；1260高效液相色譜儀（包括真空在線脫氣機、二元泵系統(tǒng)、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、ChemStation工作站），美國安捷倫公司；電子天平，梅特勒公司。雞胚：SPF級雞蛋，購于新興大華農(nóng)禽蛋有限公司（溫氏集團），購回后置RcomMAX孵化箱中氣室端朝上，在溫度為（37.6±0.1）℃、相對濕度為（46%±1%）的條件下孵化，每小時水平方向傾斜45度自動翻蛋一次，自動換氣，孵化至第10天時用于試驗^[6]。

1.2試驗方法

1.2.1大麻二酚含量測定

使用安捷倫1260高效液相色譜儀；C18色譜柱（4.6mm×250mm×5μm）；流動相A：質(zhì)量分數(shù)0.1%甲酸-水，流動相B：質(zhì)量分數(shù)0.1%甲酸-乙腈；進樣量10μL；柱溫為30℃；波長220nm；洗脫梯度如表1所示。

表1梯度洗脫表

 

1.2.2苯氧乙醇模型刺激性試驗

通過臨床半主觀試驗評價大麻二酚“即時舒緩”功效。使用1%苯氧乙醇面膜刺激志愿者面部后進行單次涂樣，對比研究志愿者使用樣品前后對刺痛、發(fā)燙感的評分變化，評價大麻二酚即時舒緩的效果^[16]。

試驗流程：整個試驗均在恒溫（20±2）℃、恒濕（50%±5%）環(huán)境下進行，10名志愿者全臉貼敷含質(zhì)量分數(shù)1%苯氧乙醇面膜5min，并在敷貼30s、2.5min和5min時，針對受試者有不同程度的泛紅、刺痛、發(fā)熱癥狀，詢問受試者的自覺癥狀。按10分法進行評分（0分為沒有感覺，10分為重度）。揭掉面膜后用柔軟的干紙巾輕輕將臉部液體粘干。單次定量隨機半臉涂抹基質(zhì)以及含質(zhì)量分數(shù)0.01%、0.05%和0.1%大麻二酚的樣品，分別在30s、2.5min和5min時詢問受試者的自覺癥狀，并做好記錄。

1.2.3膠帶黏貼試驗

每位受試者雙前臂屈側(cè)隨機反復(fù)多次進行膠帶黏貼試驗（Tape Stripping,TAP),15名受試者左手前臂屈側(cè)區(qū)劃分4個邊長為2cm×2cm的正方形試驗區(qū)，試驗區(qū)域隨機分布在左手前臂屈側(cè)^[17]。

D0：測量4個試驗區(qū)未進行膠帶黏貼時的TEWL值，測量后在4個試驗區(qū)進行膠帶黏貼處理，直至TEWL值增加50%后停止黏貼。測量損傷后區(qū)域的經(jīng)皮失水TEWL值為初始值。

受試者于D0損傷后8h開始連續(xù)7天在試驗區(qū)域（1～4）每天2次涂抹基質(zhì)以及含質(zhì)量分數(shù)0.01%、0.05%和0.1%大麻二酚的樣品，并于D1、D2、D3和D7回訪測試。

1.2.4質(zhì)量分數(shù)1%SDS表面活性劑刺激模型

抗刺激模型：分別將不同濃度的大麻提取液與質(zhì)量分數(shù)1%SDS混合后，在16名志愿者手背內(nèi)側(cè)進行24h斑貼測試，對比基質(zhì)組與不同濃度大麻二酚的樣品組區(qū)域皮膚經(jīng)皮水分流失TEWL值、血紅素EI值、皮膚紅度a*值的變化程度，敷貼24h后，移開斑試器。分別在撕斑貼后24h及第1～7天評價其抗炎、抗刺激功效。

舒緩刺激模型：在16名志愿者手前臂屈側(cè)用質(zhì)量分數(shù)1%SDS進行24h斑貼誘導(dǎo)皮膚損傷產(chǎn)生炎癥后每天兩次使用基質(zhì)以及含質(zhì)量分數(shù)0.01%、0.05%和0.1%大麻二酚的試樣，記錄皮膚經(jīng)皮水分流失TEWL值、血紅素EI值、皮膚紅度a*值的變化程度，在第1～7天評價其舒緩、修復(fù)皮膚屏障功效。

1.2.5HET-CAM試驗

以生理鹽水（質(zhì)量分數(shù)0.9%Nacl水溶液）作為空白對照，陰性組用質(zhì)量分數(shù)1%SDS溶液。將雞胚自孵化箱中取出，置于自制的蛋架上，氣室端朝上，用有齒鑷頭部輕輕敲破蛋殼后，小心夾除氣室端蛋殼，完整暴露蛋殼膜，加2mL生理鹽水于蛋殼膜上使其潤濕，吸去生理鹽水，用彎鑷小心剝?nèi)サ皻つ?，暴露出絨毛尿囊膜（CAM），肉眼觀察其完整性，如有破損則不用于試驗。分別吸取0.3mL的樣品，滴加在絨毛尿囊膜表面，5min后加入質(zhì)量分數(shù)1%SDS，觀察開始出現(xiàn)血管融解、凝血的時間，其間進行拍照錄影，根據(jù)式（1）計算刺激評分（Irritation Score,IS）值[8]。按表2進行結(jié)果評價。

  

式中：sec H（出血時間）——CAM膜上觀察到開始發(fā)生出血的平均時間，s；

sec L（血管融解時間）——CAM膜上觀察到開始發(fā)生血管融解的平均時間，s；

sec C（凝血時間）——CAM膜上觀察到開始出現(xiàn)凝血的平均時間，s。

表2 刺激評分法結(jié)果評價

 

每個樣品均用6個雞胚進行試驗，計算6個雞胚的刺激評分總和，根據(jù)每個雞胚所得的IS值計算平均刺激評分。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)處理

所有試驗結(jié)果均為3次以上試驗的平均值，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0軟件，利用Dunnett’s檢驗和ANOVA檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.05即具有統(tǒng)計學(xué)顯著意義。

2結(jié)果與討論

2.1大麻二酚含量測定

精密吸取樣品10μL，按前述色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)。經(jīng)過內(nèi)標(biāo)法測試得知，大麻二酚的含量為質(zhì)量分數(shù)99.88%。

2.2苯氧乙醇模型刺激性試驗

苯氧乙醇可以對人體皮膚細胞的“TRPV1傳感器”（人體細胞用來感知外界的某一神經(jīng)通道）產(chǎn)生影響，使人產(chǎn)生“熱感”或者輕微“痛感”，10名志愿者使用質(zhì)量分數(shù)1%苯氧乙醇涂抹之后馬上產(chǎn)生灼熱感甚至是刺痛感，持續(xù)時間為5min左右。掀開面膜后使用樣品，使用基質(zhì)組樣品后并不能舒緩苯氧乙醇帶來的刺痛感，5min后刺激評分為6.12。使用中、高濃度CBD處理5min后刺激評分為1.5和1.3。說明中高濃度組的CBD能夠快速舒緩苯氧乙醇帶來的刺痛感和灼熱感。表3列出了具體試驗結(jié)果。

表3苯氧乙醇模型刺激評分

 

2.3膠帶黏貼試驗

膠帶黏貼會去除角質(zhì)層及細胞間脂質(zhì)，引起刺激性接觸性皮炎的發(fā)生。因而膠帶黏貼試驗常被作為機械性刺激模型。隨著角質(zhì)層被膠帶逐漸黏貼去除，角質(zhì)層受到破壞，TEWL值會升高?；|(zhì)組到第7天時TEWL值為12.81，修復(fù)率是59.24%，低、中、高濃度CBD組皮膚損傷后TEWL值是分別是18.25、18.95和19.25，經(jīng)過7天的修復(fù)后，TEWL值降至11.12、10.12和9.55，修復(fù)率為68.57%、81.04%和87.35%。表4列出了測得TEWL的值，圖1列出了相應(yīng)的皮膚修復(fù)率變化趨勢。

表4 不同組別TEWL測得值

 

圖1 膠帶黏貼試驗中皮膚修復(fù)率變化趨勢

 

2.4表面活性劑SDS試驗

2.4.1抗炎抗刺激試驗

分別將不同濃度的CBD與質(zhì)量分數(shù)1%SDS混合后進行24h斑貼，其中經(jīng)皮失水TEWL值越低，表示皮膚的保水性能越好，血紅素EI值和皮膚紅度a*值越低，表示皮膚的抗炎抗刺激性越好。

測試結(jié)果如圖2～圖4所列。CBD與SDS混合后，移走斑試器30min后，基質(zhì)組以及低、中和高濃度組TEWL值、血紅素EI值和皮膚紅度a*值均有不同程度的上升，TEWL值分別為21.09、17.37、14.50、12.00（見圖2),EI值分別為286、273、256、234（見圖3),a*值為11.50、9.31、8.22、8.01（見圖4），中、高濃度組TWEL值、EI值和a*值上升的幅度明顯低于基質(zhì)組，且第3、7天測試結(jié)果與初始值沒有顯著性差別。說明中、高濃度的CBD能夠減少SDS帶來的刺激性，能夠很好地起到抗刺激作用。

圖2 抗刺激試驗TEWL值測定結(jié)果

 

圖4 抗刺激試驗皮膚紅度結(jié)果

  

2.4.2舒緩刺激試驗

先用質(zhì)量分數(shù)1%SDS進行24h斑貼，隨后分別涂抹不同濃度的CBD樣品，分別在第1、3和7天對受試者進行回訪，測試樣品組區(qū)域的皮膚經(jīng)皮水分流失TEWL值、血紅素EI值、皮膚紅度a*值的變化程度，評價其舒緩刺激功效。圖5～圖7分別列出了相應(yīng)的試驗結(jié)果。

2.5HET-CAM試驗

圖8列出了HET-CAM刺激性評價試驗結(jié)果。從圖8的照片可明顯看出，基質(zhì)組添加質(zhì)量分數(shù)0.9%NaCl溶液的雞胚在5min內(nèi)整個血管網(wǎng)形態(tài)結(jié)構(gòu)及輪廓清晰，無出血、血管融解、凝血現(xiàn)象，添加質(zhì)量分數(shù)1%SDS后，平均出血時間是16s，血管溶解時間是137s，沒有凝血現(xiàn)象。小血管、中等血管出現(xiàn)出血和融解，出血現(xiàn)象被血管融解掩蓋，無凝血現(xiàn)象，IS值為7.49，屬于中度刺激性。

圖3 抗刺激試驗血紅素測定結(jié)果

 

圖5 舒緩刺激試驗TEWL值測定結(jié)果

 

添加不同濃度CBD后，對SDS造成的刺激性癥狀有一定的緩解，質(zhì)量分數(shù)0.01%CBD組IS值為5.24，而0.05%CBD組、0.1%CBD組IS值分別為3.95和2.58，由中度刺激緩解為輕度刺激，說明CBD具有一定的緩解刺激能力。

3結(jié)論

對因表面活性劑、機械損傷、防腐劑等所導(dǎo)致的肌膚刺激，包括肌膚的紅腫、熱脹、發(fā)麻和瘙癢，通過質(zhì)量分數(shù)0.05%和1%CBD的作用，可以有效降低皮膚經(jīng)皮水分流失，同時降低血紅素值，減輕皮膚紅度，從而實現(xiàn)良好的舒緩抗刺激功效。

圖6 舒緩刺激試驗的血紅素EI值測定結(jié)果

 

圖7 舒緩刺激試驗的皮膚紅度a^*值測定結(jié)果

 

圖8 HET-CAM刺激性評價試驗結(jié)果

  

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文章摘自 招敏聰,郭文姣,孫美娟,蔡慧珍,楊懸,賀銳.大麻二酚舒緩抗刺激功效的研究及應(yīng)用[J].香料香精化妝品,2021(04):88-93+87.