摘  要：采用堿提酸沉和經(jīng)典Osborne分級分離的方法，分別制備得到了漢麻分離蛋白以及清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，并研究了這5種分離蛋白的氨基酸組成、等電點、吸水吸油性、起泡性、乳化性、成膜性及凝膠性。結果表明:4種蛋白分離產(chǎn)物中漢麻球蛋白的占比最高為46.80%，其次為清蛋白18.47%和谷蛋白18.00%，醇溶蛋白最少；漢麻球蛋白的多數(shù)氨基酸含量高于其他組分，并表現(xiàn)出了優(yōu)異的氨基酸組成特性；5種分離蛋白的等電點依次為pH4.5、pH4.0、pH5.0、pH5.5和pH5.5；漢麻分離蛋白起泡性最好，漢麻清蛋白的乳化性最好，漢麻分離蛋白和谷蛋白吸水性較強，清蛋白和球蛋白的吸油能力較強，5種分離蛋白在質量濃度50mg/L下均可以揭膜，在200mg/mL時漢麻分離蛋白、清蛋白和谷蛋白能夠形成凝膠。

關鍵詞：漢麻籽蛋白；Osborne分級；功能特性

漢麻在我國有著悠久的種植歷史，近年來漢麻種子逐漸從一味中藥發(fā)展為一種營養(yǎng)豐富的日常食材^[1,2]。漢麻籽具有優(yōu)秀的不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸配比，同時還含有豐富的優(yōu)質蛋白質^[3]。它不含致敏因子，不會造成胃脹、反胃和過敏反應^[4,5]，因而使用特性極高^[6,7]。目前漢麻籽蛋白的研究僅停留在整籽蛋白的利用上^[8,9]，對于漢麻籽蛋白的構成、分級提取及不同蛋白質成分的理化特性等的研究還未曾展開^[10,11]。本研究采用Osborne方法分級提取漢麻籽分離蛋白^{[12,13,14,15]}，并在獲得4類分離蛋白后進行了理化特性的研究，為漢麻籽蛋白的合理利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

脫脂漢麻粕，購自錦州俏牌生物技術有限公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、Tris-HCl、氯化鈉、甘油，國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設備

VFD-6000真空冷凍干燥機(液晶屏編程凍干曲線)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；L-8900氨基酸分析儀(配有EZChrom Elite分析軟件)，天美(中國)科學儀器有限公司；GY-GSDCY-24孔干式氮吹儀，上海歸永電子有限公司；梅特勒FE28-Standard pH計，瑞士梅特勒公司；UV759S紫外-可見光分光光度計，上海精科有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1漢麻分離蛋白的提取

脫脂漢麻籽粕進行粉碎、過篩后獲得漢麻脫脂粉，以料液比1∶20(g/m L)在漢麻脫脂粉中加入蒸餾水進行混合，調節(jié)pH至10.5，于40℃恒溫提取2h，再以4000r/min離心20min，取上清液調節(jié)pH至4.5，靜止2h，棄去上清液，調節(jié)pH至6.0～7.0，真空冷凍干燥后獲得漢麻籽分離蛋白粉^[16,17]。

1.3.2漢麻籽各級蛋白Osborne分離方法

 

1.3.3氨基酸測定方法

分別稱取0.05g的5種蛋白質于15mL離心管中，加入3mL水溶解，再加入3mL濃鹽酸；氮吹儀操作30min后于110℃水解24h，再以5000r/min離心20min，定容至50mL；取4mL于100℃水浴蒸干后加入10mL的0.02mol/L鹽酸溶解，使用0.22μm濾膜過濾至進樣瓶，上機以氨基酸分析儀自動分析。

1.3.4等電點測定

移液管準確移取12份10.00 m L的5種蛋白質溶液于50mL離心管中，依次調節(jié)pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，以6000r/min離心15min，取一定量的上層清液于10.00mL考馬斯亮藍溶液中，靜置5～10min后，在波長595 nm處測定不同pH下蛋白質溶液的吸光度。由于不同的蛋白質溶液中蛋白質含量不同，因此，需要將各種蛋白質溶液分別稀釋至合適的質量濃度。根據(jù)蛋白質在等電點處溶解度最小的原理，吸光度最小的pH即為等電點。

1.3.5起泡性的測定

5種蛋白粉各取0.5g，溶于50mL水中，攪打2次，記錄攪拌停止后的總體積，按照公式(1)計算起泡性。

               

1.3.6乳化性的測定

用0.05mol/L,pH8.0的Tris-HCL溶液配制蛋白質量濃度為10mg/L的5種蛋白溶液。使用HCl溶液調蛋白質溶液pH至7.0，按4∶1的體積比加入大豆油，于10000r/min下均質1min，靜置1min后取乳化層10mL至有刻度離心管，于4℃下以3000r/min離心30min，乳化性的計算公式如公式(2)所示。

                 

1.3.7吸水、吸油特性研究

稱取5種分離蛋白各0.5g，加入6mL水充分混合，靜置20min后，以3000r/min離心20 min，棄去上清液，稱重試管。以每1g蛋白質結合的水量表示蛋白質吸水能力，按照公式(3)計算吸水性。

          

稱取5種分離蛋白各0.5g，加入6 m L大豆油充分混合，靜置20min后，以3000r/min離心20min，棄去上清液后稱重試管。以每1g蛋白質結合的油量表示蛋白質吸油能力，按照公式(4)計算吸油性。

          

1.3.8成膜性的測定

將5種蛋白質以蒸餾水配制成質量濃度為50mg/L的蛋白質溶液100mL，分別加入1.5g甘油，攪拌20min，于65℃水浴加熱20min，室溫放置7h后過濾，玻璃板涂膜，在60℃下干燥17h取出。在濕度90%、溫度30℃的條件下濕潤回軟15min，揭膜后室溫干燥48h，使用紫外-可見光分光光度計測定透光率。

1.3.9凝膠性的測定

將5種蛋白質以蒸餾水配制成質量濃度為200mg/mL的蛋白質溶液，用封口膜封口，于85℃下恒溫水浴40min后取出迅速冷卻，放入冰箱冷藏過夜，隨后倒置試管觀察成膠情況^[18,19]。

2結果與分析

2.1漢麻籽蛋白各級組分分布結果

采用經(jīng)典Osborne分級分離的方法，分別制備得到了清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白。由表1可知:漢麻球蛋白的占比最高，占總質量的46.80%，其次為清蛋白18.47%和谷蛋白18.00%，醇溶蛋白最少，只占總質量的3.66%。在分離漢麻蛋白過程中還剩余了約13.07%的殘渣，這主要是一些碳水纖維及剩余油脂的混合物以及一些不可溶性的蛋白質組分^[20]，可以在今后的研究中加以利用。

表1漢麻籽蛋白各級組分的組成比例

 

2.2漢麻分離蛋白及4種分級蛋白的氨基酸組成分析

采用氨基酸分析儀進行了漢麻分離蛋白及4種分級蛋白的氨基酸組成檢測，數(shù)據(jù)見表2。

表2漢麻分離蛋白及4種分級蛋白氨基酸分析結果

 

由表2可知:漢麻球蛋白顯示出了優(yōu)異的氨基酸組成特性，其中纈氨酸、蛋氨酸及組氨酸3種必需氨基酸含量均高于大豆分離蛋白、漢麻分離蛋白及其他各級蛋白組分，蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸及亮氨酸含量則與大豆分離蛋白相近，但遠高于其他蛋白組分。漢麻球蛋白各種非必需氨基酸的含量都高于大豆分離蛋白，特別是精氨酸和半胱氨酸，含量幾乎是大豆分離蛋白的2倍。

表3列出了5種蛋白的氨基酸種類分布，其中漢麻球蛋白的堿性氨基酸、酸性氨基酸含量都高于其他蛋白。漢麻谷蛋白的疏水氨基酸和親水氨基酸、含硫氨基酸以及芳香族氨基酸含量均高于其他蛋白；漢麻球蛋白的堿性氨基酸和酸性氨基酸含量均高于其他蛋白；漢麻醇溶蛋白中的各類氨基酸含量都是最低的。

表3漢麻分離蛋白及4種分級蛋白氨基酸種類分布

 

2.3等電點的確定

由圖1可知:漢麻分離蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的吸光度最小值分別出現(xiàn)在pH4.5、4.0、5.0、5.5和5.5處，因此推斷他們的等電點依次為pH4.5、pH4.0、pH5.0、pH5.5和pH5.5。在pH從3.0到其等電點處，由于酸性越強，蛋白質溶解度越高，因此5條曲線中吸光度均在一定范圍內呈先下降再升高的趨勢，也說明各種蛋白質在堿性條件下溶解度逐漸增大。

 

圖1 5種蛋白質等電點曲

2.4起泡特性和乳化特性的比較

由圖2可知:漢麻分離蛋白起泡性最好，其次是清蛋白、谷蛋白，球蛋白與醇溶蛋白的起泡性較差，考慮兩者可能是平均疏水作用而導致的起泡性差。漢麻分離蛋白及各分級蛋白的乳化性大小依次是清蛋白、漢麻分離蛋白、谷蛋白、球蛋白、醇溶蛋白。

 

圖2 5種蛋白質的起泡特性和乳化特

2.5吸水、吸油能力的測定

由圖3可知:漢麻分離蛋白和谷蛋白比清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的吸水性強。吸油率則相反，清蛋白和球蛋白的吸油能力高于漢麻分離蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白

 

圖3 5種蛋白質吸水、吸油能力

2.6成膜特性的研究

試驗發(fā)現(xiàn)漢麻分離蛋白和4種分級蛋白在質量濃度50mg/L下均可以揭膜，但膜薄而脆易碎，醇溶蛋白與谷蛋白膜的顏色較黃，主要原因是這2種蛋白本身的顏色較深。球蛋白膜的透光率最高，厚度也較薄。

表4 5種蛋白成膜特性

  

2.7凝膠特性的研究

由表5可知:在200mg/mL時，漢麻分離蛋白、清蛋白和谷蛋白開始形成凝膠，此時為弱凝膠，球蛋白和醇溶蛋白的凝膠質量濃度可能大于200mg/mL。

表5 5種蛋白凝膠特性

 

3結果與討論

采用堿提酸沉和經(jīng)典Osborne分級分離的方法，分別制備得到了漢麻分離蛋白和4種漢麻分級蛋白，其中，漢麻球蛋白的占比最高，占總質量的46.80%，其次為清蛋白18.47%和谷蛋白18.00%，醇溶蛋白最少。氨基酸組成的分析結果顯示，漢麻球蛋白中纈氨酸、蛋氨酸及組氨酸含量均高于大豆分離蛋白、漢麻分離蛋白及其他蛋白組分，表現(xiàn)出了優(yōu)異的氨基酸組成特性。

漢麻分離蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的等電點依次為pH4.5、pH4.0、pH5.0、pH5.5和pH5.5。漢麻分離蛋白起泡性最好，漢麻清蛋白的乳化性最好。漢麻分離蛋白和谷蛋白比清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的吸水性強，吸油率則相反，清蛋白和球蛋白的吸油能力高于漢麻分離蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白。漢麻分離蛋白和4種分級蛋白在質量濃度50mg/L下均可以揭膜。在200mg/mL時，漢麻分離蛋白、清蛋白和谷蛋白能夠形成凝膠?？傮w來說，漢麻粕分離蛋白擁有優(yōu)良的營養(yǎng)價值，特別是漢麻球蛋白具有優(yōu)異的氨基酸組成特性，是值得開發(fā)利用的新型植物蛋白質資源，具有廣闊的應用前景。

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文章摘自：石杰,宋淑敏,魏連會,楊慶麗.漢麻籽蛋白的分級提取及產(chǎn)物功能特性的研究[J].糧食與油脂,2021,34(11):132-136.