摘 要：本研究以漢麻作為材料，對其內(nèi)生菌進行了系統(tǒng)分離，并對漢麻內(nèi)生細菌對病原菌的抑菌活性進行了測定。結果表明，從漢麻中分離得到64株內(nèi)生菌，漢麻葉中的內(nèi)生菌資源較豐富；漢麻內(nèi)生細菌中有抑菌活性的菌株比例較高且抑菌譜較廣，對于供試細菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用。
宿主植物種類及外在環(huán)境不同，植物內(nèi)生菌種類和數(shù)量存在很大差異，因而內(nèi)生菌菌種多種多樣[1，2]。從漢麻中可以篩選出具有抑菌活性的內(nèi)生菌，其會產(chǎn)生抗生素等活性成分，并且為了避免宿主植株死亡，這些抗生素活性成分毒性相對較低[3]。因此，開發(fā)漢麻內(nèi)生菌，尋找新的抗生素，具有廣闊的研究前景。
1材料與方法
1.1試驗材料
試驗試劑包括牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基，由北京奧博星生物技術有限責任公司生產(chǎn)；瓊脂粉。
試驗設備包括恒溫培養(yǎng)箱、全自動立式高壓滅菌器。
1.2試驗方法
1.2.1樣品采集。
選擇茂盛、無病蟲害的漢麻植株，采集其新鮮的葉片、根、莖，每株采集3～4片葉片（無病蟲害及斑點）。
1.2.2樣品預處理。
采集得到的新鮮漢麻葉片用清水漂洗后切成0.3cm×0.3cm的組織塊，將根、莖切成0.3cm長的組織塊，對組織塊進行表面處理、表面干燥。
1.2.3樣品表面消毒。
對預處理得到的樣品進行表面消毒，方法如下：0.1%升汞漂洗10～30s→無菌水沖洗數(shù)次→75%乙醇漂洗30～60s→無菌水沖洗數(shù)次。檢測表面消毒有效性：本試驗需對檢驗材料組織表面消毒是否全面進行檢測，設置2組對照試驗。第1組：表面消毒完畢后，取最后一次清洗漢麻樣品的無菌水涂布于平板培養(yǎng)基上，設置3個平行。第2組：將消毒后的漢麻樣品置于平板培養(yǎng)基上，與培養(yǎng)基表面接觸幾分鐘后取出，設置3個平行。將2組平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱（相同條件）中培養(yǎng)3d，觀察平板中是否長菌。無菌說明消毒徹底；有菌則表明消毒不徹底，需要重新進行樣品預處理、表面消毒用于內(nèi)生菌分離純化。
1.2.4 漢麻內(nèi)生菌分離純化。
在無菌操作條件下將組織塊接種到PDA培養(yǎng)基中進行組織培養(yǎng)，每個平板接種4～5個組織塊，共接種6個平板。將平板分成2組分別置于28℃及37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d。觀察到組織塊長出菌落后，使用接種環(huán)挑取不同的菌落，采用劃線法將菌落接種于平板培養(yǎng)基中進行分離培養(yǎng)。反復接種2～3次后，挑取單菌落的菌絲體在顯微鏡下觀察，如無雜菌即可確定為純種菌株。得到的純種菌株分類接種于PDA斜面培養(yǎng)基中編號保藏。
1.2.5漢麻內(nèi)生菌發(fā)酵液上清液抑菌活性測定。
菌株培養(yǎng)條件：溫度設置為30℃，搖床轉速150r/min，用100mL三角瓶裝液30mL，培養(yǎng)基的初始pH值設定為7.2。對發(fā)酵液上清液的抑菌活性進行測定采用的是菌絲平板生長抑制法[4，5，6]，方法如下：在無菌條件下操作，吸取2.5mL菌株發(fā)酵液上清液置于培養(yǎng)皿中，取12.5mL融化后冷卻至40℃左右的PDA培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿中，混合均勻制成平板。對照以無菌水代替發(fā)酵液上清液。試驗組及對照組均設3次重復。將供試病原菌菌絲塊接入平板中央，30℃恒溫培養(yǎng)。觀察到對照培養(yǎng)皿中病原菌菌絲長滿平板時，采用十字交叉法，用游標卡尺測量每個培養(yǎng)皿的病原菌菌落直徑，計算抑菌率。計算方法如下：
抑菌率（%）=（對照菌落直徑-樣品菌落直徑）/對照菌落直徑×100
2結果與分析
2.1漢麻不同部位菌株種類
由表1可知，在64株漢麻內(nèi)生菌中，15株來自漢麻根段、16株來自漢麻莖段、33株來自漢麻葉。結果表明，漢麻葉中的內(nèi)生菌資源較豐富。
表1漢麻不同部位內(nèi)生菌分布情況
2.2漢麻內(nèi)生細菌對病原菌的抑制率
對17株漢麻內(nèi)生細菌（3株來自漢麻根段、5株來自漢麻莖段、9株來自漢麻葉）的發(fā)酵液上清液進行抑菌活性檢測，檢測到8株有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制率不同（表2）。由表2可知，漢麻內(nèi)生細菌中有抑菌活性的菌株比例較高且抑菌譜較廣，對于供試細菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等均表現(xiàn)出一定的抑制作用。在8株有抑菌活性的漢麻內(nèi)生細菌中，有6株來自漢麻葉片。
表2漢麻內(nèi)生細菌對3種病原菌抑菌效果
3結論
結果表明，從漢麻中分離得到64株內(nèi)生菌，其中15株來自漢麻根段、16株來自漢麻莖段、33株來自漢麻葉，漢麻葉中的內(nèi)生菌資源較豐富。漢麻內(nèi)生細菌中有抑菌活性的菌株比例較高且抑菌譜較廣，對于供試細菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等均表現(xiàn)出一定的抑制作用。
參考文獻
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文章摘自：吳瓊,王雷,曹滌非,李瑤,孫堯,孫鑫,薛佳瑩,黃國慶.漢麻內(nèi)生菌的分離及其抑菌活性研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2022(01):196-197.
