摘  要：木槿屬植物纖用價(jià)值高，且兼具觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值，但其基因組學(xué)研究相對(duì)匱乏，嚴(yán)重制約木槿屬植物的研究與利用。研究以玉米B73為內(nèi)標(biāo)，采用流式細(xì)胞儀估算4個(gè)紅麻品種及其近緣種玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa L.)和玫瑰麻(Hibiscus sabdariffa var.altissima Wester)的基因組大小，同時(shí)檢測(cè)基因組大小在種內(nèi)及種間是否存在差異。結(jié)果表明，紅麻的基因組大小平均為1143.28Mb，2C DNA含量為2.338pg；玫瑰茄及其變種玫瑰麻的基因組大小平均為2506.40Mb，2C DNA含量為5.126pg。紅麻品種間基因組大小存在顯著性差異，同時(shí)木槿屬在種間也存在顯著性差異。此外，玫瑰茄及玫瑰麻的2C DNA含量約為紅麻的兩倍。該研究旨在為木槿屬植物基因組學(xué)和遺傳進(jìn)化研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：木槿屬；紅麻；流式細(xì)胞儀；基因組大小；

基因組大小(Genome size)，又稱C值，是指一個(gè)基因組中所擁有的DNA含量，一般以重量計(jì)算，或是以核苷酸堿基對(duì)的數(shù)量表示^[1]。植物基因組大小的測(cè)定可以估測(cè)物種的DNA含量，為該物種的基因組測(cè)序及基因組學(xué)研究提供參考。染色體組多倍化是促進(jìn)物種形成的重要因素之一^[2，3]，大部分開(kāi)花植物的祖先都經(jīng)歷過(guò)一輪或幾輪多倍體化^[4]，因此鑒別植物類(lèi)群的倍性水平對(duì)研究其系統(tǒng)進(jìn)化、物種起源模式具有非常重要的價(jià)值。流式細(xì)胞術(shù)是測(cè)定基因組大小的常用方法之一，已廣泛應(yīng)用于植物、真菌等的基因組大小測(cè)定，該制樣方法簡(jiǎn)便易行，檢測(cè)結(jié)果較為穩(wěn)定可靠^[5]。

木槿屬(Hibiscus)屬于錦葵科，全屬約200余種，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，中國(guó)有24種和16變種或變型。該屬多為草本、灌木或喬木，且多數(shù)種類(lèi)有著大型美麗的花朵，是主要的園林觀賞花灌木，部分種類(lèi)的皮層纖維發(fā)達(dá)，多為很好的纖用植物。隨著用途的不同拓展，木槿屬植物越來(lái)越受到植物學(xué)家、育種家的關(guān)注。對(duì)木槿屬植物進(jìn)行基因組大小測(cè)定對(duì)木槿屬植物的遺傳改良及種質(zhì)資源的利用和保護(hù)具有重要的意義。

紅麻(Hibiscus cannabinus)屬木槿屬(Hibiscus)一年生經(jīng)濟(jì)作物，玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa L.)及其變種玫瑰麻(Hibiscus sabdariffa var. altissima Wester)同樣屬于木槿屬，他們是紅麻的野生近緣種。紅麻韌皮纖維柔軟，纖維拉力強(qiáng)，對(duì)氣候和環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，寒、溫、熱帶氣候均可栽培，在輕鹽堿地和干濕地上也可生長(zhǎng)。紅麻是傳統(tǒng)的麻紡產(chǎn)業(yè)重要的原料作物，近年來(lái)紅麻纖維原料被用來(lái)研發(fā)生產(chǎn)汽車(chē)內(nèi)襯、紙地膜、輕型板材、活性炭及環(huán)境友好吸附材料，因此，紅麻被視為21世紀(jì)潛在的優(yōu)勢(shì)植物^[6]。玫瑰茄，也叫洛神葵，其花萼可作為原料或添加劑用于食品領(lǐng)域，花蕾采收干制后可入藥，具有諸多保健功效。玫瑰麻屬于玫瑰茄纖維用的變種，高抗根結(jié)線蟲(chóng)，抗紅麻炭疽病力強(qiáng)，纖維支數(shù)高、品質(zhì)好。

借助測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，科研人員完成了越來(lái)越多植物的基因組測(cè)序。但目前關(guān)于木槿屬植物基因組測(cè)序相關(guān)研究報(bào)道較少，僅有紅麻品種“福紅952”的測(cè)序工作已完成^[7]。木槿屬植物紅麻、玫瑰茄及變種玫瑰麻的測(cè)序可為其更好地遺傳改良打下基礎(chǔ)，而對(duì)兩種物種的基因組大小進(jìn)行測(cè)定，可為其基因組的測(cè)序提供參考。

前人^{[8，9，10]}于2009年完成了玉米B73的測(cè)序工作，且將其作為內(nèi)標(biāo)廣泛用于植物基因組大小的測(cè)定中。本研究擬以已測(cè)序的玉米B73為內(nèi)標(biāo)，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定和估算不同紅麻品種、玫瑰茄及玫瑰麻等種質(zhì)資源的基因組大小，旨在為今后開(kāi)展木槿屬植物的基因組測(cè)序及基因組學(xué)研究等工作提供理論參考。

1材料與方法

1.1植物材料

紅麻(Hibiscus cannabinus)、玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)、玫瑰麻(Hibiscus sabdariffa var. altissima Wester)等資源保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所國(guó)家麻類(lèi)作物種質(zhì)資源中期庫(kù)，作為內(nèi)標(biāo)的玉米B73由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。玉米B73目前已成功測(cè)序，其基因組大小約為2365Mb，2C DNA含量約為4.836pg。本試驗(yàn)所使用的材料是植物的幼嫩葉片，需將待檢測(cè)的種子培養(yǎng)成幼苗。

1.2 細(xì)胞核解離液

單純的物理切碎方法無(wú)法獲得大量單個(gè)完整的細(xì)胞核，還需加入特異的細(xì)胞核解離液。本試驗(yàn)采用的細(xì)胞核解離液是Marie nuclear isolation緩沖液^[11]，配方是50mmol/L葡萄糖、15mmol/L KCl、15mmol/L NaCl、5mmol/L Na2EDTA、50mmol/L檸檬酸鈉、0.5%(V/V) Tween 20、50mmol/L HEPES、0.5%(V/V) β-巰基乙醇，調(diào)節(jié)pH至7.2，4℃條件下保存。

1.3植物組織勻漿的制備

取適量新鮮的植物幼苗葉片放入培養(yǎng)皿中，加入1mL的Marie nuclear isolation，用雙面刀在冰上快速切碎，然后用直徑為40μm的尼龍網(wǎng)將切碎的植物組織勻漿過(guò)濾至離心管中，靜置于冰上備用(放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng))。

1.4細(xì)胞核DNA的特異性染色

取500mL過(guò)濾后的細(xì)胞核懸浮液移入新的離心管中，加入10μL的10 mg/mL的RNase A，混勻后冰上靜置10 min；加1mg/mL的碘化丙啶溶液(PI， propidiumiodide)后混勻至濃度50μg/mL，然后在冰上避光靜置20min以上。

1.5植物核基因組大小的測(cè)定

利用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀(購(gòu)自美國(guó)BD公司)對(duì)植物細(xì)胞核懸浮液進(jìn)行測(cè)定，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，收集FL2通道的熒光信號(hào)，每個(gè)樣本收集不低于2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次。核DNA含量(基因組大小)計(jì)算公式為：

2結(jié)果與分析

2.1單個(gè)植物玫瑰茄、玫瑰麻及紅麻品種組織勻漿的檢測(cè)結(jié)果波峰數(shù)據(jù)

首先，為了檢測(cè)細(xì)胞核解離液的適用性，使用流式細(xì)胞儀對(duì)特異性染色的植物組織勻漿進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)收集過(guò)程中設(shè)置閾值為：FSC-H:10000，FL2-H:1000。各種待測(cè)植物的細(xì)胞核DNA波峰的變異系數(shù)(CV)都相對(duì)較小，即所得到的波峰數(shù)據(jù)是可靠的，也說(shuō)明Marie細(xì)胞核解離液是適用于所有待測(cè)植物的細(xì)胞核解離液。檢測(cè)得到的2C峰值分別是：玉米B73，319937.6；玫瑰茄，338143.2；玫瑰麻，342389.3；紅麻福紅991，168909.4；紅麻種質(zhì)7804，169141.8；紅麻青皮3號(hào)，163065.6；紅麻種質(zhì)722，166207.2 (圖1)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)玉米B73、玫瑰茄、玫瑰麻及紅麻不同品種幼苗葉片的波峰數(shù)據(jù)

內(nèi)標(biāo)植物的組織勻漿與待測(cè)植物的組織勻漿混合可以有效地減少試驗(yàn)誤差。然而玫瑰茄、玫瑰麻與玉米B73的G0/G1期峰值幾乎相同，在圖中無(wú)法區(qū)分，故進(jìn)一步對(duì)玉米B73與紅麻不同品種的組織勻漿進(jìn)行混合檢測(cè)。如圖2所示，檢測(cè)得到紅麻及玉米B73的2C峰值分別是：福紅991，165641.2，玉米，318941.2；種質(zhì)7804，165679.6，玉米，322378.4；青皮3號(hào)，163065.8，玉米，323092.5；種質(zhì)722，163658.4，玉米，323693.6。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)玉米B73與不同紅麻品種幼苗葉片組織勻漿混合液波峰數(shù)據(jù)

2.2木槿屬種間及紅麻種內(nèi)及品種間的基因組大小

內(nèi)標(biāo)玉米B73的材料取自不同日期，經(jīng)檢測(cè)其平均2C峰值是321608.7±2064.5(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。進(jìn)一步方差分析表明，紅麻不同品種基因組大小存在差異，玫瑰麻與玫瑰茄的基因組大小無(wú)顯著性差異，并且研究發(fā)現(xiàn)玫瑰茄與玫瑰麻的2C DNA含量約是紅麻的2倍(表1、2)。

表1 4個(gè)紅麻品種的基因組大小

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)。

表2 玫瑰茄、玫瑰麻及紅麻基因組大小及2C DNA含量

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)。

3討論

流式細(xì)胞術(shù)操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、測(cè)定結(jié)果精確，已被廣泛用于植物基因組大小測(cè)定和倍性鑒定，先后完成了海菜花屬、蘭屬等植物基因組大小的測(cè)定^{[12，13]}。除了具有較高的觀賞價(jià)值外，部分木槿屬植物纖維品質(zhì)好、藥用價(jià)值高，未來(lái)在紡織、醫(yī)藥、建材等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。但目前關(guān)于木槿屬植物基因組大小的研究較少，僅在紅麻中有過(guò)報(bào)道^[11]，該屬中玫瑰茄及其變種基因組大小尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以已測(cè)序的玉米B73為內(nèi)標(biāo)對(duì)紅麻不同品種及其近緣種玫瑰茄和其變種玫瑰麻進(jìn)行了基因組大小測(cè)定，結(jié)果顯示，無(wú)論是單個(gè)植物組織勻漿測(cè)定還是混合組織，DNA含量的變異系數(shù)CV均處于5%以內(nèi)，表明試驗(yàn)結(jié)果可靠穩(wěn)定。

紅麻具有耐逆性好、適應(yīng)性強(qiáng)、纖維產(chǎn)量高等特性，除作為傳統(tǒng)麻紡產(chǎn)業(yè)重要的原料作物，近年來(lái)被廣泛用于汽車(chē)內(nèi)襯、紙地膜、輕型板材、活性炭及環(huán)境友好吸附材料的制備。我國(guó)現(xiàn)收集紅麻種質(zhì)資源達(dá)1800多份，但對(duì)這些資源基因組大小研究報(bào)道較少。Zhang等^[7]采用二代+三代的測(cè)序策略，同時(shí)結(jié)合Hi-C染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)和高密度遺傳圖譜，首次完成紅麻全基因組測(cè)序和組裝工作，其基因組大小約為1078Mb。本研究對(duì)4份紅麻種質(zhì)資源基因組大小進(jìn)行了測(cè)定，其基因組大小平均值為1143 Mb， 且測(cè)定發(fā)現(xiàn)紅麻種質(zhì)資源“7084”基因組大小為1088.51±14.18Mb，與Zhang等^[11]通過(guò)測(cè)序所獲得的基因組大小相近，表明本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)估算紅麻基因組大小，結(jié)果較為穩(wěn)定可靠。近期研究利用EST-SSR標(biāo)記對(duì)包含青皮3號(hào)、722及7804在內(nèi)的44份紅麻標(biāo)記進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)上述3份資源被聚類(lèi)為不同的大類(lèi)，暗示這3份種質(zhì)資源存在一定的遺傳距離^[14]。本研究發(fā)現(xiàn)上述3份紅麻種質(zhì)間基因組大小存在差異，也同時(shí)暗示這些資源間遺傳背景存在一定差異，與近期研究結(jié)果相類(lèi)似。

作為紅麻的近緣種，玫瑰茄用途較為廣泛?；ㄝ嗫勺鳛槭秤迷匣蛱砑觿┯糜谑称奉I(lǐng)域，花蕾曬干后入藥，具有很好保健功效。玫瑰麻屬于玫瑰茄纖用變種，具有纖維品質(zhì)好的特點(diǎn)，但關(guān)于玫瑰茄及玫瑰麻基因組大小的研究尚未有相關(guān)報(bào)道。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)首次對(duì)玫瑰茄及其變種玫瑰麻的基因組大小進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果表明玫瑰茄及其變種玫瑰麻在基因組大小上無(wú)顯著差異，且玫瑰茄基因組2C DNA含量約是紅麻的2倍(2490.58±14.38Mb VS 1143.28±45.97Mb)?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，紅麻染色體數(shù)目一般為2x=36，玫瑰茄及玫瑰麻的染色體數(shù)目為4x=72，該研究結(jié)果中染色體倍性差異與本研究2C DNA含量差異相對(duì)應(yīng)^[15]。

4結(jié)論

綜上，本研究以玉米B73為內(nèi)標(biāo)，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)4個(gè)紅麻品種及其近緣種玫瑰茄及玫瑰麻的基因組大小進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)紅麻平均基因組大小約1143.28Mb，且4個(gè)紅麻品種間基因組大小存在差異。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)玫瑰茄的基因組大小約為紅麻基因組的2倍。該研究結(jié)果可為開(kāi)展木槿屬植物的基因組測(cè)序、基因組文庫(kù)建立以及系統(tǒng)進(jìn)化研究等工作提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Dolezel J，Bartos J，Voglmayr H，et al.Nuclear DNA content and genome size of trout and human[J].Cytometry，2003，51:127-128.

[2]Schmidt-Lebuhn A，Fuchs J，Kessler M.Flow cytometric measurements do not reveal different ploidy levels in minthostachys (lamiaceae)[J].Plant Systematics and Evollution，2008，271(1-2):123-128.

[3]Loureiro J，Travnicek P，Rauchova J，et al.The use of flow cytometry in the biosystematics，ecology and population biology of homoploid plants[J].Preslia，2010，82(1):3-21.

[4]Leitch A，Leitch I.Genomic plasticity and the diversity of polyploid plants[J].Science，2008，320(5875):481-483.

[5]韓鴻鵬，宋純鵬.流式細(xì)胞術(shù)在植物生物學(xué)研究中應(yīng)用進(jìn)展[J].北方園藝，2011，15:178-181.

[6]李德芳.紅/黃麻新用途綜合開(kāi)發(fā)與國(guó)際合作[J].中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2007，29(z2):411-414+419.

[7]Zhang L，Xu Y，Zhang X，et al.The genome of kenaf (Hibiscus cannabinus L.) provides insights into bast fibre and leaf shape biogenesis[J].Plant Biotechnol Journal，2020，18(8):1796-1809.

[8]Schnable P，Ware D，Fulton R，et al.The B73 maize genome:complexity，diversity，and dynamics[J].Science，2009，326:1112-1115.

[9]林峰，肖月娥，周翔宇，等.25份鳶尾屬植物基因組DNA C值的流式測(cè)定[J].草地學(xué)報(bào)，2018，26(4):198-203.

[10]齊香玉，陳雙雙，馮景，等.3種瓣型茉莉基因組大小測(cè)定與比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48(19):40-44.

[11]Marie D，Brown S.A cytometric exercise in plant DNA histograms，with 2C values for 70 species[J].Biology of the Cell，1993，78(1-2):41-51.

[12]林瀚，韓曉文，蘭思仁，等.基于流式細(xì)胞技術(shù)兩種蘭屬植物基因組大小的測(cè)定[J].森林與環(huán)境學(xué)報(bào)，2019，39(6):616-620.

[13]嚴(yán)東瑩，李艷，孫文禮，等.基于流式細(xì)胞術(shù)的海菜花屬植物基因組大小測(cè)定[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2020，38(2):173-180.

[14]金關(guān)榮，安霞，駱霞虹，等.紅麻干旱響應(yīng)基因EST-SSR標(biāo)記[J].分子植物育種，2018，16(14):4735-4742.

[15]鄧麗卿，黃培坤，粟建光，等.紅麻和木槿屬Furcaria組植物的形態(tài)分類(lèi)及細(xì)胞遺傳學(xué)研究[J].湖南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，20(4):310-317.

文章摘自：潘根，董志雪，唐蜻，程超華，臧鞏固，李德芳，黃思齊，李建軍，趙立寧.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定玫瑰茄及紅麻的基因組大小[J].中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2021，43(05):217-221.