摘 要：本發(fā)明屬于生物活性肽技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種漢麻降血脂肽組合物及其應(yīng)用。為解決漢麻籽粕資源利用不足的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種漢麻降血脂肽組合物，包括質(zhì)量比為4:5的氨基酸序列為Val-Ser-Glu-Pro-Arg的五肽和氨基酸序列為Ile-Asp-Lys-Phe-Ser-Arg的六肽。本發(fā)明由漢麻籽粕經(jīng)酶解及1KD超濾膜過(guò)濾獲得的小分子肽組合物中谷氨酸、精氨酸含量較高，特殊的氨基酸序列使?jié)h麻降血脂肽組合物在人體吸收代謝中表現(xiàn)出顯著的血脂調(diào)節(jié)功效，將本發(fā)明漢麻降血脂肽組合物應(yīng)用于降血脂藥品、保健食品以及食品添加劑中，能夠阻礙腸道內(nèi)的膽固醇吸收，促使膽固醇排出體外，從而降低血膽固醇濃度。
技術(shù)要點(diǎn)
1.一種漢麻降血脂肽組合物，其特征在于，主要包括氨基酸序列為Val-Ser-Glu-Pro-
Arg的五肽和氨基酸序列為Ile-Asp-Lys-Phe-Ser-Arg的六肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種漢麻降血脂肽組合物，其特征在于，所述五肽和六肽的質(zhì)量比為4:5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種漢麻降血脂肽組合物，其特征在于，所述五肽的分子量為680Da。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種漢麻降血脂肽組合物，其特征在于，所述五肽的谷氨酸含量為140.97mg/g，精氨酸含量為89.0mg/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種漢麻降血脂肽組合物，其特征在于，所述六肽的分子量為876Da。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種漢麻降血脂肽組合物，其特征在于，所述漢麻降血脂肽組合物的制備方法為：漢麻籽粕與蒸餾水按一定料液比混合，向混合液中加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，在一定溫度下酶解得到酶解液，升溫滅酶，將酶解液離心后取上清液，經(jīng)1KD超濾膜過(guò)濾獲得分子量＜1KD的漢麻降血脂肽組合物，低溫凍干獲得漢麻降血脂肽凍干粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種漢麻降血脂肽組合物，其特征在于，所述料液比為1g:10g。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種漢麻降血脂肽組合物，其特征在于，所述木瓜蛋白酶的酶活為80萬(wàn)u/g、加入量為混合液質(zhì)量的0.2～0.6％；所述中性蛋白酶的酶活為13萬(wàn)u/g、加入量為混合液質(zhì)量的2.0～3.0％。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種漢麻降血脂肽組合物，其特征在于，所述酶解溫度為60～70℃，酶解時(shí)間為1～3h；所述滅酶溫度為90～100℃，滅酶時(shí)間為10～20min。10.如權(quán)利要求1-9任一所述一種漢麻降血脂肽組合物在降血脂藥品、保健食品以及食品添加劑中的應(yīng)用。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物活性肽技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種漢麻降血脂肽組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
血脂異常是冠心病、心梗和缺血性腦卒中等心腦血管病的獨(dú)立而重要危險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重危害人體健康。目前臨床用于治療高血脂多應(yīng)用阿昔莫司、辛伐他汀、考來(lái)烯胺等化學(xué)藥物，雖然具有良好的療效，但長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生肝腎損傷、橫紋肌溶解等諸多不良反應(yīng)。因此從天然動(dòng)植物資源中篩選安全、無(wú)副作用的降血脂活性物質(zhì)，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的新趨勢(shì)。
生物活性肽是指對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類化合物。生物活性肽的結(jié)構(gòu)可以從簡(jiǎn)單的二肽到較大分子的多肽。作為基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，活性肽的生物利用度高，比蛋白質(zhì)更易吸收，同時(shí)具有多種生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、降血壓、降膽固醇、抗癌、抗氧化等。
漢麻(Cannabissativa)是大麻科大麻屬一年生草本植物，又名火麻，是最古老的栽培作物之一。漢麻籽作為食品和油料，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，包括約25～35％的脂肪酸、0～25％的蛋白質(zhì)、20～30％的碳水化合物和10～15％的纖維以及各種礦物質(zhì)。由于其含有豐富的人體必需氨基酸和必需脂肪酸，并且具有合理的組成比例，所以被認(rèn)為是現(xiàn)今最完整的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，是理想的生物活性多肽來(lái)源。
但在大部分漢麻產(chǎn)區(qū)，漢麻籽僅用于漢麻籽油的提取，而含有豐富蛋白質(zhì)的漢麻籽粕則被廢棄或用作飼料，導(dǎo)致漢麻籽資源的浪費(fèi)。
發(fā)明內(nèi)容
為解決漢麻籽粕資源利用不足的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種漢麻降血脂肽組合物及其應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案：
一種漢麻降血脂肽組合物，主要包括氨基酸序列為Val-Ser-Glu-Pro-Arg的五肽和氨基酸序列為Ile-Asp-Lys-Phe-Ser-Arg的六肽。
進(jìn)一步的，所述五肽和六肽的質(zhì)量比為4:5。
進(jìn)一步的，所述五肽的分子量為680Da。
進(jìn)一步的，所述五肽的谷氨酸含量為140.97mg/g，精氨酸含量為89.0mg/g。
進(jìn)一步的，所述六肽的分子量為876Da。
進(jìn)一步的，所述漢麻降血脂肽組合物的制備方法為：漢麻籽粕與蒸餾水按一定料液比混合，向混合液中加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，在一定溫度下酶解得到酶解液，升溫滅酶，將酶解液離心后取上清液，經(jīng)1KD超濾膜過(guò)濾獲得分子量＜1KD的漢麻降血脂肽組合物，低溫凍干獲得漢麻降血脂肽凍干粉。
進(jìn)一步的，所述料液比為1g:10g。
進(jìn)一步的，所述木瓜蛋白酶的酶活為80萬(wàn)u/g、加入量為混合液質(zhì)量的0.2～
0.6％；所述中性蛋白酶的酶活為13萬(wàn)u/g、加入量為混合液質(zhì)量的2.0～3.0％。
進(jìn)一步的，所述酶解溫度為60～70℃，酶解時(shí)間為1～3h；所述滅酶溫度為90～100℃，滅酶時(shí)間為10～20min。
本發(fā)明一種漢麻降血脂肽組合物在降血脂藥品、保健食品以及食品添加劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明提供的漢麻降血脂肽組合物中五肽含有的必需氨基酸含量占總氨基酸的25.19％，五肽中的谷氨酸、精氨酸含量較高，分別為140.97mg/g、89.0mg/g。特殊的氨基酸序列使?jié)h麻降血脂肽組合物在人體吸收代謝中表現(xiàn)出顯著的血脂調(diào)節(jié)功效，能夠阻礙腸道內(nèi)的膽固醇吸收，促使膽固醇排出體外，從而降低血膽固醇濃度。本發(fā)明提供的漢麻降血脂肽組合物對(duì)膽酸鈉、牛黃膽酸鈉、甘氨膽酸鈉的吸附率分別為85.02％、25.12％、58.10％。
漢麻籽粕是藥食同源食品原料，本發(fā)明充分發(fā)揮漢麻籽多肽的營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)療保健功效，拓展?jié)h麻籽多肽在功能食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用，提高漢麻籽深加工的附加值，且制備工藝簡(jiǎn)單，適于規(guī)?；a(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此，凡是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
實(shí)施例1
一種漢麻降血脂肽組合物，主要包括氨基酸序列為Val-Ser-Glu-Pro-Arg的五肽和氨基酸序列為Ile-Asp-Lys-Phe-Ser-Arg的六肽。
實(shí)施例2
一種漢麻降血脂肽組合物，主要包括氨基酸序列為Val-Ser-Glu-Pro-Arg的五肽和氨基酸序列為Ile-Asp-Lys-Phe-Ser-Arg的六肽，五肽和六肽的質(zhì)量比為4:5。
五肽的分子量為680Da，谷氨酸含量為140.97mg/g，精氨酸含量為89.0mg/g，必需氨基酸含量占總氨基酸25.19％。
六肽的分子量為876Da。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供了一種漢麻降血脂肽組合物的制備方法：
漢麻籽粕與蒸餾水按一定料液比混合，向混合液中加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，在一定溫度下酶解得到酶解液，升溫滅酶，將酶解液離心后取上清液，經(jīng)1KD超濾膜過(guò)濾獲得分子量＜1KD的漢麻降血脂肽組合物，低溫凍干獲得漢麻降血脂肽凍干粉。
實(shí)施例4
本實(shí)施例提供了一種漢麻降血脂肽組合物的制備方法：
漢麻籽粕與蒸餾水按料液比1g:10g混合，向混合液中加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，木瓜蛋白酶的酶活為80萬(wàn)u/g、加入量為混合液質(zhì)量的0.2～0.6％；中性蛋白酶的酶活為13萬(wàn)u/g、加入量為混合液質(zhì)量的2.0～3.0％。
在60～70℃溫度下酶解1～3h得到酶解液，將酶解液升溫至90～100℃滅酶10～20min使酶失活，將酶解液離心后取上清液，經(jīng)1KD超濾膜過(guò)濾獲得分子量＜1KD的漢麻降血脂肽組合物，低溫凍干獲得漢麻降血脂肽凍干粉。
實(shí)施例5
本實(shí)施例提供了一種漢麻降血脂肽組合物的制備方法：
漢麻籽粕與蒸餾水按料液比1g:10g混合，向混合液中加入木瓜蛋白酶和中性蛋白
酶，木瓜蛋白酶的酶活為80萬(wàn)u/g、加入量為混合液質(zhì)量的0.2～0.6％；中性蛋白酶的酶活為13萬(wàn)u/g、加入量為混合液質(zhì)量的2.0～3.0％。
在65℃溫度下酶解2.5h得到酶解液，將酶解液升溫至95℃滅酶15min使酶失活，將酶解液離心后取上清液，經(jīng)1KD超濾膜過(guò)濾獲得分子量＜1KD的漢麻降血脂肽組合物，低溫凍干獲得漢麻降血脂肽凍干粉。
實(shí)施例6
本實(shí)施例制備了不同分子量的漢麻籽粕多肽，制備方法為：
漢麻籽粕與蒸餾水按料液比1g:10g混合，向混合液中加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，木瓜蛋白酶的酶活為80萬(wàn)u/g、加入量為混合液質(zhì)量的0.2～0.6％；中性蛋白酶的酶活為13萬(wàn)u/g、加入量為混合液質(zhì)量的2.0～3.0％。
在65℃溫度下酶解2.5h得到酶解液，將酶解液升溫至95℃滅酶15min使酶失活，將酶解液離心后取上清液，采用超濾膜過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)酶解漢麻籽粕多肽混合液進(jìn)行分離，采用截留分子量分別為1KD，3KD，5KD的超濾膜對(duì)混合多肽進(jìn)行分離，得到4種不同分子量的多肽組分，各個(gè)組分和分子量范圍如表1所示：
表1
|
類別 |
組分a |
組分b |
組分c |
組分d |
|
分子量范圍 |
>5KD |
3KD-5KD |
1KD-3KD |
<1KD |
對(duì)分離所得4種不同分子量的多肽組分結(jié)合膽酸鹽能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)方法如下：
(1)繪制膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線
配制膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液：分別準(zhǔn)確稱取膽酸鹽0、20、40、60、80、100、120、140、160、180和200mg各置于100mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并加至刻度。取不同質(zhì)量濃度的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液1mL于具塞試管中，加入45％硫酸6mL，混勻；加入0.3％糠醛1mL，混勻；于65℃恒溫水浴中反應(yīng)30min，冷卻至室溫后，于620nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(2)漢麻籽多肽對(duì)膽酸鹽吸附作用的測(cè)定
分別吸取5～10mg/ml的組分a、b、c、d四種多肽組分，分別加入0.5～2ml人工胃液，在37℃，恒溫水浴1～3h；調(diào)節(jié)pH至6～7，加入1～3ml人工腸液，在37℃，恒溫震蕩1～3h；分別加入2ml牛黃膽酸鈉、膽酸鈉、甘氨膽酸鈉，在37℃，恒溫震蕩1～3h,經(jīng)離心，取上清液1ml，加入45％硫酸6ml、0.3％糠醛1ml,65℃，恒溫水浴30～60min；在620nm處檢測(cè)吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算四種多肽組分對(duì)膽酸鹽的吸附率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，
表2
由表2可知，漢麻籽多肽組分對(duì)3類代表性膽酸鹽均具有吸附作用，其中組分d，即漢麻降血脂肽組合物的吸附能力明顯大于其它三個(gè)組分，對(duì)膽酸鈉吸附率為85.02％，對(duì)較難被吸附的?；悄懰徕c的吸附率也高于20％，達(dá)到25.12％。因此可初步確定組分d中具有較強(qiáng)降血脂作用的功能因子。實(shí)驗(yàn)以膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c作為吸附對(duì)象，揭示了漢麻籽多肽通過(guò)吸附膽酸鹽，抑制其在腸道的吸收并將其排出體外，從而促進(jìn)膽固醇在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化成膽汁酸的降血脂機(jī)理，證實(shí)了漢麻籽多肽的降血脂作用。
實(shí)施例7
利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定實(shí)施例6獲得的組分a、b、c、d四種多肽組分的必需氨基酸組成和非必需氨基酸組成，結(jié)果分別如表3和表4所示，
表3
表4
由表3、表4可知，不同分子量漢麻籽多肽組分中谷氨酸的含量最高，精氨酸含量次之。其中各個(gè)多肽組分a、b、c、d中必需氨基酸含量分別為23.83％，24.46％，22.83％，25.19％，其中組分d，即漢麻降血脂肽組合物中的必需氨基酸含量最高，特殊的氨基酸序列使?jié)h麻降血脂肽組合物在人體吸收代謝中表現(xiàn)出顯著的血脂調(diào)節(jié)功效。
實(shí)施例8
本實(shí)施例通過(guò)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜測(cè)試，對(duì)實(shí)施例6獲得的組分d，即漢麻降血脂肽組合物的氨基酸序列進(jìn)行分析。取1μL樣品點(diǎn)至樣品靶上，自然干燥后，再取1μLCHCA基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰靶位上點(diǎn)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品(4700ProteomicsAnalyzerCalibrationMixture1)。采用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品CalibrationMixture1進(jìn)行外標(biāo)一級(jí)校準(zhǔn)，質(zhì)量誤差小于0.5Da；采集圖譜條件：一級(jí)質(zhì)譜(MS)范圍：800-4000m/z，每張譜圖累加500個(gè)LaserShots；選擇供試品目標(biāo)多肽對(duì)應(yīng)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜測(cè)試(MS/MS)，每張譜圖累加2500個(gè)LaserShots,在上述主要參數(shù)固定的前提下，分別調(diào)整激光強(qiáng)度和碰撞室(CID)氣體氣壓來(lái)獲取最佳譜圖。
經(jīng)檢測(cè)分析，結(jié)果表明漢麻降血脂肽組合物中主要包括氨基酸序列為Val-Ser-Glu-Pro-Arg的五肽和氨基酸序列為Ile-Asp-Lys-Phe-Ser-Arg的六肽。
摘自國(guó)家發(fā)明專利，發(fā)明人：宋淑敏，魏連會(huì)，潘靜，董艷，石杰，高媛，赫大新，夏尊民，高宇，申請(qǐng)?zhí)?span lang="EN-US">201910377762.6，申請(qǐng)日2019.05.05
